一種豬流行性腹瀉新型抗體ELISA檢測試劑盒的製作方法
2023-09-15 01:50:30
本發明涉及免疫檢測技術領域，具體是涉及一種豬流行性腹瀉新型抗體elisa檢測試劑盒.
背景技術：
豬流行性腹瀉(ped)是嚴重危害我國養豬業的一個豬病，抗體檢測是防控的關鍵，然而國內外尚無成熟的pedelisa抗體檢測試劑盒。
目前市場上雖然有韓國安捷pedelisa抗體檢測試劑盒，但只能檢測初乳中的iga，並且這些試劑盒在國內均沒有註冊，因此，目前國內外尚且沒有成熟的、商品化的pedelisa抗體檢測試劑盒。
技術實現要素：
本發明解決的技術問題是以杆狀病毒表達的ped抗原為基礎，研製靈敏度高、特異性和穩定性強的elisa抗體檢測試劑盒，用於豬流行性腹瀉病毒抗體的快速檢測。
本發明的技術方案是：一種豬流行性腹瀉新型抗體elisa檢測試劑盒，所述試劑盒包括包被了豬流行性腹瀉抗原的酶標板、陰性對照血清、陽性對照血清、20x濃縮洗液、酶標抗原、底物緩衝液a、底物液b、終止液。
進一步地，在上述方案中，所述包被了豬流行性腹瀉抗原的酶標板的製備過程中，所用的包被原是通過杆狀病毒表達系統獲得的pedv-s蛋白，所用包被液是碳酸鈉緩衝液，所用封閉液是含1％明膠的上述包被液。有前期研究結果表明pedv的s蛋白可以辨別靶細胞及促使病毒和細胞膜的融合，故被認為在免疫介導中起著重要作用，而有研究表明感染pedv的豬血清中的抗s蛋白抗體比抗n蛋白抗體更為持久，即可在更長的時間中檢測到抗s蛋白的抗體，因此s蛋白是建立pedv血清學檢測方法的首選抗原。
進一步地，在上述方案中，所述酶標抗原是利用辣根過氧化物酶(hrp)通過過碘酸鈉法對pedv-s蛋白進行標記。所述陰、陽性對照血清通過ifa試驗鑑定獲得。
進一步地，在上述方案中，所述20x濃縮洗滌液配方為：氯化鈉8g、磷酸二氫鉀0.2g、磷酸氫二鈉3g、氯化鉀5g、吐溫-202ml、蒸餾水20ml。
進一步地，在上述方案中，所述底物緩衝液a為過氧化脲溶液，底物緩衝液a配方為每1000ml水中加入過氧化脲1g，10.3g檸檬酸，35.8gna2hpo4·12h2o，吐溫-20100μl，ph5。
進一步地，在上述方案中，所述底物液b為四甲基聯苯胺(tmb)溶液，底物液b的配方為每1000ml蒸餾水中加入四甲基聯苯胺(tmb)700mg(40mldmso溶解)，10.3g檸檬酸，ph2.4。
進一步地，在上述方案中，所述終止液配方：2m濃硫酸。
一種豬流行性腹瀉新型抗體elisa檢測試劑盒，其使用方法為：
s1：待測血清或初乳經前處理後備用；
取出試劑盒，在室溫下平衡30分鐘備用；
20x的濃縮洗液按所需量稀釋成1x備用，陰、陽性對照血清或初乳各做兩個重複，加入100μl1x濃縮洗液稀釋的待檢血清或初乳，37℃孵育40分鐘；
倒出孔中的液體，用稀釋好的pbst洗5次，將酶標板倒置在吸水紙上拍幹；加入按1:200稀釋好的酶標抗原100μl，37℃孵育30分鐘；
倒出孔中的液體，用pbst洗板5次，拍幹；取底物緩衝液a和底物液b等體積混勻，每孔加100μl，在暗處顯色10-15分鐘，每孔加入50μl的終止液終止反應，酶標儀上測定各孔在波長為450nm處的od值；
s2：結果計算，用所建立的雙抗原夾心elisa方法檢測30份陰性血清或初乳，血清或初乳1:100稀釋，100μl/孔，每份血清或初乳重複2孔，按照以上已確立的elisa程序進行elisa測定，讀出d450值，計算30份血清或初乳的d450平均值和標準差；
s3：根據統計學原則，d450值平均數+3×標準方差時，可以在99.9％的水準上判定為陽性，因而設定陰陽性臨界值等於陰性血清或初乳的d450值平均數+3×標準方差，求得陰陽性臨界值0.4，在規定的實驗條件下，其d450值大於臨界值，即待檢血清樣本d450﹥0.4，判為陽性，反之為陰性。
進一步地，上述的豬流行性腹瀉新型抗體elisa檢測試劑盒的檢測原理是：酶標板上的每個孔均包被有相同量的抗原，加入待測血清後，固相包被抗原和待測血清中的抗體反應，形成固相抗原抗體複合物，洗滌除去未結合物質，再加入酶標抗原，固相免疫複合物上的抗體與酶標抗原結合，徹底洗滌未結合的酶標抗原，加入底物緩衝液a和底物液b，顯色反應淺，用酶標儀檢測的od值低，表明血清中抗體水平低；反之，當待測血清中抗體含量高時，則所測的od值高，顯色反應深。根據陰、陽性對照血清的值計算待檢血清抗體的陰陽性。
本發明的有益效果是：本發明以杆狀病毒表達系統獲得的pedv-s蛋白作為包被抗原，利用辣根過氧化物酶(hrp)通過過碘酸鈉法對pedv-s蛋白進行標記，獲得酶標抗原。以此作為開發的新型pedelisa抗體檢測試劑盒不但能夠檢測豬血清中的igg,還能夠檢測初乳中的iga,屬國內外首創，具有很好特異性和靈敏性，檢測時間短，能同時檢測大量的樣品，而且本發明試劑盒保存時間長，穩定性好。本發明對解決大批量樣品豬血清中的豬流行性腹瀉病毒抗體檢測具有重要的現實意義。
附圖說明
圖1是本發明試劑盒製備過程的流程圖；
圖2是抗原包被elisa板的保存期測定結果；
圖3是酶標抗原的保存期測定結果。
具體實施方式
一種豬流行性腹瀉新型抗體elisa檢測試劑盒，包括包被了豬流行性腹瀉抗原的酶標板、陰性對照血清、陽性對照血清、20x濃縮洗液、酶標抗原、底物緩衝液a、底物液b、終止液。包被了豬流行性腹瀉抗原的酶標板的製備過程中，所用的包被原是通過杆狀病毒表達系統獲得的pedv-s蛋白，所用包被液是碳酸鈉緩衝液，所用封閉液是含1％明膠的上述包被液。將pedvs蛋白克隆入杆狀病毒表達載體系統中，轉染昆蟲細胞，獲得體外表達的外源蛋白，並將該蛋白作為診斷抗原建立elisa抗體檢測方法，與原核表達的蛋白作為包被抗原相比，杆狀病毒表達系統所表達的外源蛋白更加接近真實的天然蛋白的空間構象和功能，利用該系統表達的蛋白與豬血清中抗體的結合更加具有特異性和敏感性，作為理想的包被抗原蛋白。
酶標抗原是利用辣根過氧化物酶(hrp)通過過碘酸鈉法對pedv-s蛋白進行標記。陰、陽性對照血清通過ifa試驗鑑定獲得。
20x濃縮洗滌液配方為：氯化鈉8g、磷酸二氫鉀0.2g、磷酸氫二鈉3g、氯化鉀5g、吐溫-202ml、蒸餾水20ml。
底物緩衝液a為過氧化脲溶液，底物緩衝液a配方為每1000ml水中加入過氧化脲1g，10.3g檸檬酸，35.8gna2hpo4·12h2o，吐溫-20100μl，ph5。
底物液b為四甲基聯苯胺(tmb)溶液，底物液b的配方為每1000ml蒸餾水中加入四甲基聯苯胺(tmb)700mg(40mldmso溶解)，10.3g檸檬酸，ph2.4。
終止液配方：2m濃硫酸。
本實施例的豬流行性腹瀉新型抗體elisa檢測試劑盒的使用方法為：
s1：待測血清或初乳經前處理後備用；
取出試劑盒，在室溫下平衡30分鐘備用；
20x的濃縮洗液按所需量稀釋成1x備用，陰、陽性對照血清或初乳各做兩個重複，加入100μl1x濃縮洗液稀釋的待檢血清或初乳，37℃孵育40分鐘；
倒出孔中的液體，用稀釋好的pbst洗5次，將酶標板倒置在吸水紙上拍幹；加入按1:200稀釋好的酶標抗原100μl，37℃孵育30分鐘；
倒出孔中的液體，用pbst洗板5次，拍幹；取底物緩衝液a和底物液b等體積混勻，每孔加100μl，在暗處顯色10分鐘，每孔加入50μl的終止液終止反應，酶標儀上測定各孔在波長為450nm處的od值；
s2：結果計算，用所建立的雙抗原夾心elisa方法檢測30份陰性血清或初乳，血清或初乳1:100稀釋，100μl/孔，每份血清或初乳重複2孔，按照以上已確立的elisa程序進行elisa測定，讀出d450值，計算30份血清或初乳的d450平均值和標準差；
s3：根據統計學原則，d450值平均數+3×標準方差時，可以在99.9％的水準上判定為陽性，因而設定陰陽性臨界值等於陰性血清或初乳的d450值平均數+3×標準方差，求得陰陽性臨界值0.4，在規定的實驗條件下，其d450值大於臨界值，即待檢血清樣本d450﹥0.4，判為陽性，反之為陰性。
本發明的豬流行性腹瀉新型抗體elisa檢測試劑盒的檢測原理是：酶標板上的每個孔均包被有相同量的抗原，加入待測血清後，固相包被抗原和待測血清中的抗體反應，形成固相抗原抗體複合物，洗滌除去未結合物質，再加入酶標抗原，固相免疫複合物上的抗體與酶標抗原結合，徹底洗滌未結合的酶標抗原，加入底物緩衝液a和底物液b，顯色反應淺，用酶標儀檢測的od值低，表明血清中抗體水平低；反之，當待測血清中抗體含量高時，則所測的od值高，顯色反應深。根據陰、陽性對照血清的值計算待檢血清抗體的陰陽性。
保存期實驗：
將豬流行性腹瀉新型抗體檢測試劑盒中的抗原包被elisa板，置37℃恆溫箱中加速老化，將其餘成分仍放於4℃。抗原包被elisa板於37℃恆溫箱中放置1d、2d、3d、4d、5d、6d後，依次取出繼續保存於4℃。當抗原包被elisa板於37℃恆溫箱中放置至第7d後，取出所有之前保存於4℃的抗原包被elisa板，對背景已知的6份被檢血清(4份陽性血清p1、p2、p3、p4，2份陰性血清n1、n2)進行檢測，以判斷抗原包被elisa板的保存情況。保存期測定結果如圖1所示。
將試劑盒中的抗原包被elisa板，置37℃放置7d後，檢測背景已知的6份血清，結果見上圖，從結果可知抗原包被elisa板在37℃恆溫箱中放置7d，其檢測結果數值仍較穩定，說明試劑盒中的抗原包被elisa板在37℃恆溫箱中可保存一周，即相對於4℃能保存一年。
將豬流行性腹瀉新型抗體檢測試劑盒中的酶標抗原分裝成7管後，置37℃恆溫箱中加速老化，將其餘成分仍放於4℃。酶標抗原於37℃恆溫箱中放置1d、2d、3d、4d、5d、6d後，依次取出繼續保存於4℃。當酶標抗原於37℃恆溫箱中放置至第7d後，取出所有之前保存於4℃的酶標抗原，對背景已知的6份被檢血清(4份陽性血清p1、p2、p3、p4，2份陰性血清n1、n2)進行檢測，以判斷酶標抗原的保存情況。保存期測定結果如圖3所示。
將試劑盒中的酶標抗原，置37℃放置7d後，檢測背景已知的6份血清，結果見上圖，從結果可知酶標抗原在37℃恆溫箱中放置7d，其檢測結果數值仍較穩定，說明試劑盒中的酶標抗原在37℃恆溫箱中可保存一周，即相對於4℃能保存一年。
試劑盒特異性實驗：
用s蛋白以10倍的反應濃度與pedv陽性血清混合，進行阻斷試驗。s蛋白吸附陽性血清後，所測抗體的od值顯著降低，(n-p)/n的值均大於0.5，阻斷陽性。阻斷試驗的結果表明，以s蛋白為抗原建立的雙抗原夾心法elisa具有較好的特異性。
(n-p)/n＝(未阻斷孔od值一阻斷孔od值)/未阻斷孔od值(此比值大於0.5即判為阻斷陽性)
用表達蛋白包被酶標板，分別取豬鏈球菌陽性血清(mrp)、大腸桿菌陽性血清(ed)和口蹄疫陽性血清(fmdv)等，進行交叉試驗。pedv陽性血清elisa試驗p/n值較高，在4.0以上，而與豬鏈球菌陽性血清、大腸桿菌陽性血清和口蹄疫陽性血清反應的p/n值則比較低，均在2.0以下，結果說明建立的間接elisa具有較好的特異性(見表1)。
根據阻斷試驗和交叉試驗結果可知該試劑盒其特異性較好，可用於pedv的血清學診斷。
表1
血清樣品不稀釋
試劑盒敏感性實驗：
擇保存的1份強陽性血清(s1)、1份陽性血清(s2)、2份弱陽性血清(s3、s4)，一份陰性血清s5，分別進行倍比稀釋(25～6400)，設置重複孔，按優化的elisa方法進行檢測，讀取其od值，由下圖可見，強陽性血清經6400倍稀釋，陽性血清經800倍稀釋，弱陽性血清經200倍稀釋，od值均大於0.4，而陰性樣品經25-6400倍稀釋，od值均小於0.4，結果見表2，表明該方法具有良好的敏感性。
表2
最後應說明的是：以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；儘管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特徵進行等同替換；而這些修改或者替換，並不使相應技術方案的本質脫離本發明實施例技術方案的精神和範圍。