一種以鏈黴菌中製備胰島素前體的方法
2023-09-15 03:02:00
專利名稱：一種以鏈黴菌中製備胰島素前體的方法
已經提出過一種製備融合蛋白的方法(西德專利DE3714866A1或歐洲專利EP0，289，936A2)，該方法包括將結構基因的C端偶聯到自由修飾過的串聯基因(tendamistat)上以獲得所需蛋白，並於鏈黴菌宿主細胞中表達此結構基因，以及從培養液上清中分離所分泌的融合蛋白。這一較早的申請還涉及將編碼另一蛋白質的結構基因的C端偶聯到任意修飾過的串聯基因上而構成的基因結構、含有此種類型基因結構的載體、含有此類載體的鏈黴菌細胞，以及包括修飾或未修飾過的串聯基因編碼蛋白的N端部分。這一較早的申請包括一些融合蛋白的實例，在這些融合蛋白中，串連基因的胺基酸順序通過一種橋式連接部分而和猴胰島素原偶聯。
作為本發明對上述概念的進一步發展，本方法特別適用於製備串聯基因部分接有一縮短了的胰島素原的融合蛋白，這種胰島素原的C鏈僅含一或二個賴氨酸殘基。該胰島素原能特異地、直接地、而且經濟地轉化成人胰島素。
具體來說，本發明涉及擴增和表達編碼融合蛋白之基因的優越的基因結構。本發明更具體的實例將在下文解釋並於專利權利要求中定義。依據本發明使用的基因結構的有利方面是以合成基因為基礎的。合成基因編碼的是縮短了的胰島素原衍生物。合成法能夠方便地選用適合鏈黴菌的特定密碼子來構建該基因，因而使融合蛋白的產量得以增加。
該方法也有利於在合成基因中引進一個終止子序列，從而使合成速度也有所增加。
依據本發明提供的方法的一大優點是有可能用平板測定法鑑定融合蛋白。該法已在歐洲專利EPA10，161，629實施例3和西德專利公開3，536，182號中介紹過。這不僅將有利於篩選目的克隆，而且能夠很容易地確定與產率有關的各種參數，從而有利於提高工作效率。
依據本發明得到的融合蛋白顯然具有相當於(或最少類似於)成熟胰島素的構型，這不僅極大地有利於將它進一步加工成胰島素，而且可以在足夠長的發酵時間裡獲得滿意的產量;同時令人驚異的是，沒有發現分泌到發酵液中的蛋白酶的明顯作用。
依據本發明修飾的胰島素原具有縮短了的C鏈，使用羥胺進行化學切割和/或使用胰蛋白酶，最好是賴氨酸內切蛋白酶進行酶切割，能夠直接將它加工成人胰島素。最好使用酶切法。賴氨酸內切蛋白酶切斷賴氨酸羧基端。依據本發明獲得的融合蛋白中，A鏈和B鏈的適當排列是指當上述酶作用於胰島素原時，能令人驚異地使其中的二硫橋正確地連結起來。
在構建基因時，能夠很方便地在串聯部分和胰島素原分子的起始部分間提供一橋式連接部分。該橋式連接部分使胰島素原衍生物能夠被酶從串聯部分切割下來。所用的酶是將胰島素原衍生物切割成二條胰島素鏈的同一種酶。
依據本發明用賴氨酸內切割融合蛋白產生(依據修改過的C鏈的結構而不同)de-B30胰島素(它能夠經轉肽作用轉化成人胰島素)或B31-Lys-胰島素或B31-Lys-B32-Lys-胰島素。這些衍生物均可在羧肽酶B的作用下轉化為人胰島素。
當使用較短的串聯基因來進行基因構建時，能獲得特高產量的所需蛋白。依據本發明的具體方法具有這種突出的優點，即修飾過的胰島素部分佔融合蛋白的一半，因而使附加部分相當少。融合蛋白的正確摺疊並不因串聯部分縮短而受影響，因而依據本發明使用較小的融合蛋白仍然有可能獲得良好的工作效率。這一優點並不是因損害了宿主細胞內部的蛋白酶造成的降解速率的增加而獲得的。事實上，出乎預料之外，融合蛋白對這類蛋白酶的穩定性反而增加了。
因此，本發明的基因構建具有一系列的優越性，其結果是使胰島素前體能夠很容易與融合蛋白的「附加重物部分」分開。這種直接的工作方式更進一步改進了人胰島素的產量。
從培養基中分離融合蛋白，將融合蛋白進一步加工成胰島素前體，以及隨後轉化成人胰島素均可用已知的方法進行。因此，融合蛋白能夠順利地應用吸附或離子交換層析和/或凝膠過濾法分離。能夠用化學法或更先進的酶學方法切割胰島素原部分。橋式連接部分的構建為普遍了解和描述過的方法(如參見歐洲專利EP-A20，229，998)。
EP-B0，089，007中公開了胰島素前體原或胰島素原的類似物。該類似物前體鏈的C端(或胰島素原的N端)帶有Lys或Arg(這兩個胺基酸亦優選用於依照本發明進行的構建)，這些前體的B鏈末端為B29-Lys，而該處的C肽能夠縮短是僅為Lys或Arg，因而在胰島素原結構中B29-Lys後面僅跟有Lys或Arg，其後再連上A鏈，這是最簡單的情形。在胰蛋白酶或類似胰蛋白酶的內切多肽酶的作用下，以及在合適部位帶有保護基因的一種天然胺基酸酯的幫助下，這些化合物可作為胰島素的前體被用來製備胰島素。
胰島素前體中B鏈和A鏈經橋式連接部分-X-Y-而連接，其中X和Y可以代表相同的或不同的Lys或Arg這兩個胺基酸。這樣的胰島素前體已在EP-A0，195，691中公開。這些前體在酵母中表達，然後經酶促轉化作用轉化成人胰島素。
EP-A0，163，529中還公開了帶有縮短了的C鏈的胰島素前體。
EP-B0，132，769和0，132，770中則描述了胰島素衍生物和含有這些衍生物的藥物製劑。
下述實施例將詳細闡述本發明。除特別指出者外，百分數均為重量百分數。
附圖
表示依據本發明實施例1進行的基因構建。圖中的比例不是按實際比例給出的。
實施例1表1中描述的合成基因(1)是按已知的磷酸亞胺法化學合成的。在選擇密碼子時，注意選用適合鏈黴菌的鹼基C和G。如同較早那份申請中的編碼猴胰島素原的基因(表2所示)一樣，表1所示基因(1)也在5′端加有一段含限制酶EcoRⅠ特定順序的延伸序列。結構基因後面是二個終止密碼子和一段帶有限制酶SalⅠ識別位點的接頭序列。在3′端加有限制酶HindⅢ的延伸序列。
用內切酶EcoRⅠ和HindⅢ切割市場上夠得的質粒pUC19，並將表1所示的合成基因(1)連接在其中，結果得到質粒pⅠ1(2)。擴增後，用內切酶EcoRⅠ和SalⅠ將合成基因切成片段(3)並用於下面描述的構建過程。
用SmaⅠ完全消化質粒pUC19並與表2中描述之終止順序(4)連接。將含有終止子序列正確指向的質粒稱為pT1(5)。用EcoRⅠ打開此質粒(5)，並用DNA聚合酶(Klenow片段)將切點補平，重新連接得到質粒pT2(6)。用酶SalⅠ和SphⅠ打開該質粒，並分離其中的大片段(7)。
用SphⅠ和EcoRⅠ切割質粒pKK400(8)(參見較早的申請，圖4，(20))，並將帶有串聯基因的小片段(9)分離出來。
連接片段(3)、(7)和(9)，結果得到質粒pKK500(10)，其中串聯序列後面帶有橋式連接部分PheAsnAlaNetAlaThrGlyAsnSerAsnGlyLysTTCAATGCGATGGCCACCGGGATTTCGAACGGCAAGAAG TTA CGC TAC CGG TGGCCC TAAAGC TTG CCG TTCEcoRI此部分編碼12個胺基酸，其後是編碼按本發明修飾過的胰島素原的基因。使用SphⅠ和SstⅠ切割來檢測排列是否正確，切割結果應為從大約3500鹼基大小的質粒上切下一833鹼基的片段。用雙脫氧法進行DNA序列分析以證實序列的正確性。
依據本發明，起C肽作用的Lys增添了另一個Lys，同樣用類似的方法進行基因構建。為此目的，使Lys的三連密碼子AAG重複一次。質粒pⅠ2以及載體pKK600均按類似方法獲得。
實施例2類似於先前提出的申請中的載體pGFI，從載體pKK500和pKK600中製得pGF2和pGF3表達質粒。用SphⅠ和SstⅠ雙重消化載體pKK500和pKK600，分別分離823和826鹼基對的插入片段，並將這些DNA片段連接到用同樣兩種酶切開的表達質粒pIJ702中。將此連接混合物轉化到變鉛青鏈黴菌(S.Iividans)TK24中，並從顯示有串聯基因活性(平板試驗)的硫鏈絲菌肽(thiostrepton)抗性轉化株中分離質粒DNA。所有的陽性克隆均含有來自pKK500和pKK600的插入片段。
用已知方法表達已編碼的融合蛋白。假如在28℃搖瓶中培養轉化株變鉛青鏈黴菌TK24四天，並從培養液中分離菌絲體，則可按下述方法檢測在上清液中的融合蛋白將20至200微升15%濃度的三氟醋酸加於10至100微升上述溶液中，離心濃縮沉澱的蛋白質，洗滌後用含SDS的樣品緩衝液(U.Laemmli，Nature227(1970)680-685)溶液之。於90℃保溫2分鐘，再於10-17%的SDS-聚丙烯醯胺凝膠中電泳分離，得到一分子量為15千道爾頓的蛋白質，也就是說，其在串聯基因和胰島素前體組成的融合蛋白的分子量範圍內。該融合蛋白既和抗串聯基因蛋白的抗體反應，亦與抗胰島素抗體反應。
實施例3用限制酶EcoRⅠ和SstⅠ消化表達質粒pTF2(DE3714866A1，實施例4)，並除去編碼猴胰島素原的片段。將大小為5，650鹼基對的片段用於下述連接反應。
用同樣的限制酶從質粒pKK550(實施例1)中切割一大小為285鹼基對的DNA片段，該片段含有縮短了的胰島素原基因以及終止子序列。
連接從pTF2中獲得的5，650鹼基對大小的片段和從pKK500中獲得的285鹼基對的片段，得到表達質粒pTF3。
用連接混合液轉化變鉛青鏈黴菌TK24的原生質體，結果得到有硫鏈絲菌肽抗性並能分泌可與抗胰島素原抗體反應之融合蛋白的克隆。這種融合蛋白含有串聯基因編碼的前41個胺基酸、橋式連接部分Pro-Ser-Leu-Asn-Ser-Asn-Gly-Lys以及縮短了的胰島素原。
權利要求
1.一種製備融合蛋白的方法，該方法包括將編碼胰島素原衍生物的結構基因偶聯於串聯基因的C端，其中所述的胰島素原衍生物的B鏈是通過一個編瑪Lys或Lys-Lys的橋式連接部分與A鏈相連接的，然後在鏈黴菌宿主細胞中表達這一結構基因並從上清液中分離分泌的融合蛋白。
2.根據權利要求1的方法，其中串聯基因是經過修飾的。
3.根據權利要求1和2的方法，其中串聯基因是縮短了的。
全文摘要
將一個編碼縮短了的胰島素原(其中胰島素B鏈僅通過Lys或Lys-Lys與A鏈相連)的基因偶聯於串聯基因上，將該基因構建物引入一表達載體中，然後用於轉化鏈黴菌宿主細胞，從而表達和分泌相應的融合蛋白。此融合蛋白能夠容易地經切割而成為胰島素前體。
文檔編號C07K19/00GK1042378SQ89108320
公開日1990年5月23日 申請日期1989年11月3日 優先權日1988年11月3日
發明者克勞斯-皮特·庫勒, 京特·約翰內斯·裡思, 歐根·烏爾曼, 霍爾格·瓦爾麥 申請人:赫徹斯特股份公司