一株擬無枝酸菌及利用其全細胞轉化製備香草醛的方法
2023-09-13 04:13:30
專利名稱：一株擬無枝酸菌及利用其全細胞轉化製備香草醛的方法
技術領域：
本發明涉及一株擬無枝酸菌(^^cohioAsis sp. )zhp06，及其轉化底物阿魏酸製備香草醛的生物轉化方法，屬生物技術領域。
背景技術：
香草醛，又稱香蘭素(vanillin)、香蘭精、香蘭醛，香草素或香茅醛等，化學名稱為 3-甲氧基-4-羥基苯甲醛，相對分子質量152. 15，白色至微黃色針狀或粉末狀結晶，是香莢蘭的主要成分。它以游離態和葡萄糖甙的形式廣泛存在於自然界植物中，在香子蘭的莢中的質量含量為1.5%-3%，是香子蘭花英中的典型香味物質。香草醛作為一種以奶油甜香味為特徵的風味物質，廣泛用於冰淇淋、巧克力和乳制甜點等食品中，堪稱世界上使用最廣的增香劑。目前，市場上大多是以愈創木酚(1，2_甲氧基苯酚)為原料經化學方法合成香草醛 (年產12000t，16美元/kg)，僅有極少一部分是從香子蘭(Vanilla planifolia)豆莢中提取生產(年產20t，3200美元/kg)。化學合成法生產香草醛，工藝成熟，但環境汙染嚴重，同時產品香氣單一，安全性開始受到質疑。天然香蘭素的高昂價格，不能滿足人們對天然香料的消費的需求，由此推動了生物轉化生產天然香蘭素的研究。其中利用微生物細胞對前體底物進行轉化的方法，近年來成為生產生物香草醛的發展趨勢。阿魏酸是香草醛的前體底物，根據微生物的不同，目前有一步法和兩步法微生物轉化生產香草醛。專利CN 1421523A和CN 18M783A公開了用黑麴黴CGMCC 0774和朱紅密孔菌CGMCC 1115微生物兩步法轉化阿魏酸生成香草酸、再生成香草醛的方法，這種方法需要培養兩種微生物，存在工藝路線長的缺陷。US 06133003公布了 2株擬無枝酸菌DSM 9991、DSM 9992 —步法發酵轉化阿魏酸生成香草醛的方法，微生物在發酵罐中生長12. 5 h 後，開始分階段加入阿魏酸底物，轉化50h後發酵液中香草醛達到11.5 g/L，摩爾轉化率為 77.8%。US 06235507公布了用西唐氏鏈黴菌份了印如耶⑶·^ setonni ATCC 39116以阿魏酸為底物一步法生產香草醛的方法，微生物接種於發酵培養基中生長20-40 h，當培養基中葡萄糖消耗完時開始分階段加入阿魏酸底物，轉化5-50h後，發酵液中可積累8-16g/L香草醛以及香草醇、香草酸、愈創木酚、乙烯基愈創木酚以及2-甲氧基-4-乙基苯酚等副產物，用有機溶劑如甲基正丁醚(MTBE)，通過調節pH來分離提取香草醛與副產物愈創木酚。 上述發明中，發酵液中香草醛濃度高，轉化率高，但轉化過程中加入阿魏酸底物的時機不易控制，副產物雜質較多，且微生物菌種難以獲得。國內周慶禮等用鏈黴菌Str^tomyces sp. L1936，通過2次添加底物阿魏酸的發酵，使產物香蘭素濃度達到7. 12 g/L，摩爾轉化率為69. 9% (食品與發酵工業，2004，30(3) 18-20.)。中國專利CN 101165168A也公布一株鏈黴菌份了印如耶⑶·^ sp. V-I (CCTCC NO :M 206065，)，用CY培養基和大孔吸附樹脂 DM11，通過發酵過程中，間歇添加阿魏酸濃度到45g/L，產香蘭素達到19. 2g/L，摩爾轉化率為5%。這兩種一步法中，同樣存在轉化過程中需多次加入阿魏酸底物以提高發酵液中香草醛的濃度、操作不易控制的問題。本發明篩選到一株擬無枝酸菌zhp06，通過先培養微生物細胞或將其製備成固定化細胞，然後以游離或固定化細胞作為生物催化劑，轉化底物阿魏酸為香草醛。培養的微生物細胞可以反覆用於生物轉化反應，降低了微生物發酵的成本，並且通過直接提高底物阿魏酸的濃度，提高轉化液中香草醛的濃度，產物香草醛容易提取。
發明內容
本發明目的在於提供一株擬無枝酸菌(zhp06)，以及用其進行全細胞生物轉化阿魏酸製備香草醛的方法。本發明的技術方案一種擬無枝酸菌(^Bj^o/aioAsis sp. ) zhp06,於2011年7 月沈日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 201U65，該菌株菌體呈細絲狀，在固體培養基上菌落呈灰白色或黃色，孢子呈橢球狀，適宜生長溫度範圍， 且在50-55°C也能生長；16S rRNA基因序列與多株擬無枝酸菌的16S rRNA基因序列相似性達 98% 99%。利用所述擬無枝酸菌(zhp06)或其突變株轉化反式阿魏酸生產香草醛的方法，其步驟包括
(1)擬無枝酸菌(zhp06)或其突變株通過常規培養，離心後得到菌體細胞；
(2)以上述菌體細胞或其固定化細胞作為生物催化劑，與反式阿魏酸為底物的溶液進行轉化反應；
(3)採用大孔樹脂吸附法提取轉化液中的香草醛。步驟(1)擬無枝酸菌(zhp06)的發酵培養基配方為葡萄糖5 15 g，酵母膏1 20 g, Na2HPO4 · IOH2O 1 10 g，KH2PO4 0. 1 2 g, NaCl 0. 1 0. 5 g, MgSO4 · 7Η20 0. 2 0. 5 g，CaCl2 ·2Η20 0. 01 0· 1 g，阿魏酸鈉0. 05 0. 5 g ；用自來水定容到1 L，pH7. 2 7. 4，121°C 滅菌 20 min。步驟(2)生物催化劑與轉化用底物溶液混合，其重量/體積比例為1 2 1 20，底物溶液的組成為反式阿魏酸鈉的濃度3 40 g/L, Na2HPO4 · IOH2O 1 10 g/L, KH2PO4 0. 1 0. 5 g/L, ρΗ7· 5-9，轉化反應溫度 28 45°C，時間 20-70 h。步驟(3):當步驟(2)轉化反應進行5 12小時後，向轉化體系中添加樹脂重/體系體積為5% 50%的大孔樹脂HZ-16或HZ-802，反應結束後，將樹脂過濾出，用兩倍於樹脂體積的乙酸乙酯或乙醇在35 40°C條件下進行洗脫，加無水硫酸鈉靜止脫水12 15 h， 濾液真空濃縮至香草醛含量200 230g/L，於4°C靜置結晶。培養基中的碳源用澱粉、或蔗糖、或麥芽糖、或果糖代替葡萄糖。以下是本發明方法的詳細描述 微生物菌株的篩選與鑑定
本發明從昆明、無錫等地採集11份土樣中分離放線菌，挑取菌落點種於篩選平板上， 培養3-5天後，2，4- 二硝基苯胼溶液浸溼的濾紙覆蓋在菌落上，挑選出現橙色和紅色圈的菌株，進行復篩。將復篩的菌株轉接於液體發酵培養基培養2-5天，取5mL發酵液離心， 溼菌體與含5 g/L的阿魏酸鈉混合，37°C轉化M-48 h。轉化液點樣到矽膠層析薄板上，於苯正己烷三氯甲烷乙醚冰醋酸=4:3:2:1:0. 1系統中展層，在沈511111顯色，分析其轉化產物。其中菌株zhp06積累香草醛顯著。提取菌株zhp06的染色體DNA，經16S rRNA基因序列測定，測得的16S rRNA基因序列(GenBank JF828149)與多株擬無枝酸菌的16S rRNA的基因序列相似性達98% 99%。 並按《放線菌系統學》(科學出版社2007，P363)與《放線菌分類基礎》(科學出版社1977) 生理生化鑑定，認為屬擬無枝酸菌屬(Amycolatopsis sp.)菌株。菌體呈細絲狀，固體培養基上呈白色或黃色，孢子呈橢球狀，適宜生長溫度範圍觀_371，且在50-55°C也能生長； 適宜生長的PH值為6-9 ；適宜生長的NaCl濃度為0_5% ；可使牛奶凝固、腖化，使明膠液化， 產過氧化氫酶、脲酶、脂酶，澱粉酶活性較低，不能分解纖維素；不能產、乙醯甲基甲醇， 分解葡萄糖產生甲酸等酸性物質較少，可以產吲哚。此菌已於2011年7月沈日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 2011265o微生物斜面培養基葡萄糖、天冬醯胺瓊脂培養基，或ISP-2培養基(見《中國菌種目錄》，化學工業出版社，2007)。篩選平板篩選培養基在斜面培養基中，補加0. 5-5g/L的苯甲酸或阿魏酸。發酵培養基葡萄糖5 15 g，酵母膏1 20 g, Na2HPO4 · IOH2O 1 10 g，KH2PO4 0. 1 2 g, NaCl 0. 1 0. 5 g, MgSO4 · 7Η20 0. 2 0. 5 g, CaCl2 · 2H20 0. 01 0. 1 g,阿魏酸鈉0.05 0.5 g，pH 7. 2 7. 4，用自來水定容到1 L。每500 mL三角瓶裝液50 mL， 121°C 滅菌 20 min。培養基中的碳源除了葡萄糖外，還可以用澱粉、或蔗糖、或麥芽糖、或果糖。生物催化劑製備與轉化反應
菌體接種於斜面培養基，28-37°C培養3-6天。用無菌水製成孢子懸液，按2%-5%接種量，接入液體發酵培養基，在^_40°C，180 220r/min條件下震蕩培養22 40小時，於 3000-6000 r/min 離心 10_15min，得到溼菌體。以溼菌體或固定化菌體全細胞為生物催化劑，與轉化用底物溶液混合，其比例為 1:2 1:20 (重量/體積)，底物溶液的組成為反式阿魏酸鈉的濃度3 40 g/L, Na2HPO4 IOH2O 1 10 g/L, KH2PO4 0. 1 0. 5 g/L，pH7. 5-9，轉化反應溫度 28 45°C，時間 20-70 h。固定化細胞的方法採用以卡拉膠或殼聚糖或海藻酸鈣等為載體的固定化方法，如 《生物固定化技術及應用》(P137-157，化學工業出版社，2009)所述。產物提取
轉化反應5 12小時後，向轉化體系中添加5% 50% (樹脂重/體系體積)大孔樹脂 HZ-16或HZ-802，反應結束後，將樹脂過濾出，用兩倍於樹脂體積的乙酸乙酯或乙醇在35 40°C條件下進行洗脫，加無水硫酸鈉靜止脫水12 15 h，濾液經真空蒸發濃縮至香草醛含量200 230g/L，於4°C靜置結晶。產物分析方法
採用HPLC分析轉化液中產物的成分。如用島津LC-20AB，系統控制器CBM-20A，UV-VIS 檢測器 SPD-20AV,柱溫箱 CT0-20A ；色譜柱 Waters Sunfire C18 5 μ m 4. 6*250mm ；檢測條件檢測波長觀0 nm，柱溫30°C，流動相為0.01%的醋酸溶液甲醇=7:3，流速為1 mL/ min,進樣量20 μ L0本發明的有益效果分離出一株能轉化高濃度阿魏酸生成香草醛的菌株，通過先培養微生物，然後以微生物細胞為催化劑與高濃度底物進行轉化反應的方法，製備香草醛， 其中生物催化劑可以反覆利用。該方法的反應條件溫和，環境汙染小，生產周期短，轉化後產物純度高，有利於產品的分離純化，具有良好的應用前景。生物材料樣品保藏擬無枝酸菌(Amycolatopsis邠.)zhp06,已保藏於中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，地址中國.武漢.武漢大學，保藏日期2011年7月沈日， 保藏編號為 CCTCC NO =M 2011265o
具體實施例方式以下是說明本發明的實例，但不局限於這些實例。實施例1
按細菌基因組DNA提取試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)方法提取篩選菌株 zhp06的染色體DNA，以細菌通用引物(上遊弓丨物ACGGTTACCTTGTTACGACTT，下遊引物 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)通過PCR擴增其16S rRNA基因，委託上海生工有限公司進行測序， 測得的16S rRNA基因序列片段，提交至GenBank，登記號為JF828149。與NCBI網站中用 BLAST檢索GenBank中相關菌株的16S rRNA基因序列進行同源性比對(表1)，按《放線菌系統學》進行生理生化特性鑑定，其顯著特徵是對溫度、PH、NaCl的耐受性較強，與最接近的 (或同源性最高)的菌株廣溫擬無枝酸菌^BJ^ohioAsis eurytherma strain NT202和熱黃擬無枝酸菌^^cohioAsis thermoflava strain 17；3573比較(表2)，在碳源(如阿拉伯糖、 纖維二糖、木糖等)的利用方面有所不同，而在生長溫度、NaCl的耐受性方面性質相同，且與廣溫擬無枝酸菌^BJ^ohtoAsis eurytherma strain NT202在明膠分解、澱粉酶、硝酸還原酶、脲酶等酶產生方面完全相同，認為是無枝酸菌屬菌株(廣溫擬無枝酸菌變種)，此菌已於 2011年7月沈日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 2011265o表1同源性分析表
權利要求
1.一種擬無枝酸菌UBJ^WaiOASi1S sp. )zhp06，於2011年7月洸日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 201U65，該菌株菌體呈細絲狀，在固體培養基上菌落呈灰白色或黃色，孢子呈橢球狀，適宜生長溫度範圍觀_371，且在50-55°C也能生長； 16S rRNA基因序列與多株擬無枝酸菌的16S rRNA序列相似性達98% 99%。
2.一種利用權利要求1所述的擬無枝酸菌zhp06或其突變株轉化反式阿魏酸生產香草醛的方法，其步驟包括(1)擬無枝酸菌zhp06或其突變株通過常規培養，離心後得到菌體細胞；(2)以上述菌體細胞或其固定化細胞作為生物催化劑，與反式阿魏酸為底物的溶液進行轉化反應；(3)採用大孔樹脂吸附法提取轉化液中的香草醛。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(1)擬無枝酸菌zhp06的發酵培養基配方為葡萄糖 5 15 g，酵母膏 1 20 g, Na2HPO4 · IOH2O 1 10 g, KH2PO4 0. 1 2 g, NaCl 0.1 0.5 g, MgSO4 ·7Η20 0. 2 0. 5 g, CaCl2 ·2Η20 0.01 0.1 g，阿魏酸鈉 0. 05 0. 5 g ；用自來水定容到1 L，pH 7. 2 7. 4，121°C滅菌20 min。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(2)生物催化劑與轉化用底物溶液混合，其重量/體積比例為1:2 1:20，底物溶液的組成為反式阿魏酸鈉的濃度3 40 g/L， Na2HPO4 · IOH2O 1 10 g/L, KH2PO4 0. 1 0. 5 g/L, ρΗ7· 5-9，轉化反應溫度 28 45°C，時間 20-70 ho
5.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟(3):當步驟(2)轉化反應進行5 12 小時後，向轉化體系中添加樹脂重/體系體積為5% 50%的大孔樹脂HZ-16或HZ-802，反應結束後，將樹脂過濾出，用兩倍於樹脂體積的乙酸乙酯或乙醇在35 40°C條件下進行洗脫，加無水硫酸鈉靜止脫水12 15 h，濾液真空濃縮至香草醛含量200 230g/L，於4°C靜置結晶。
6.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於培養基中的碳源用澱粉、或蔗糖、或麥芽糖、或果糖代替葡萄糖。
全文摘要
本發明涉及一株擬無枝酸菌及利用該菌的全細胞生物轉化阿魏酸生產香草醛的方法，屬生物技術領域。該菌已於2011年7月26日保藏於中國典型培養物保藏中心，其保藏號CCTCC NOM2011265。在高底物濃度下，該微生物細胞轉化阿魏酸產生香草醛的最大濃度可達到10g/L以上，對底物摩爾轉化率為50%以上，用樹脂吸附提取轉化液中的香草醛，得到香蘭素粗品的純度為80%～95%。本發明轉化反應條件溫和，菌體細胞可以反覆，對環境汙染小，生產周期短，成本低，轉化產物易分離純化，具有良好的應用前景。
文檔編號C12P7/24GK102321563SQ201110325488
公開日2012年1月18日 申請日期2011年10月24日 優先權日2011年10月24日
發明者周建海, 李慧, 王興林, 諸式彪, 鄭璞 申請人:無錫新和源生物科技有限公司, 江南大學