一種3』-cDNA展示方法
2023-09-13 21:18:30
專利名稱：一種3』-cDNA展示方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學領域，尤其涉及一種3』 -CDNA展示方法。
背景技術：
對不同生物不同發育階段的基因表達狀況進行遺傳分析，可以為研究生命活動過程提供十分重要的信息，研究基因在特定時期轉錄水平上的差異表達及表達豐度等情況。目前已有多種可在轉錄水平對差異表達基因篩選分析的方法，如DDRT-PCR、cDNA-AFLP和SSH等。但冗餘度、假陽性高等問題依然制約著這些技術的廣泛應用。mRNA 差異顯不聚合酶鏈式反應技術(differential display of mRNA reversetranscription polymerase chain reaction, DDRT PCR),是由 Liang 等首先建立的。此技術是以PCR技術和聚丙烯凝膠電泳技術為基礎，結合銀染或放射性自顯影等顯色技術，能快速有效地鑑定並克隆兩個或多個平行材料之間的差異表達基因，在植物研究方面已經取得了很多成果。現有技術一的缺點是假陽性高，效率較低。cDNA-AFLP是Bachem等在一種應用於基因組DNA的選擇性擴增限制性片段即(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)的基礎上設計出來的用於 RNA 指紋分析的方法。它將RT2PCR和AFLP結合起來，由於PCR中使用較高的退火溫度和應用特定引物對包含信息較多的內部特異片段進行選擇性擴增，增加了反應條件的嚴謹度，使其比DDRT-PCR的可靠性和可重複性大大提高。SSH的基本原理是利用消減雜交和兩次抑制PCR，使差異表達基因的cDNA片段得到高度富集，從而實現對差異表達基因的分離和克隆。消減雜交運用了雜交二級動力學原理，即豐度高的單鏈cDNA在退火時產生同源雜交的速度要快於豐度低的單鏈cDNA，從而在雜交過程中，使豐度高的單鏈cDNA雜交形成雙鏈，在雜交完畢後，原來在豐度上有差別的單鏈cDNA達到均一化的目的。抑制PCR是利用DNA鏈內退火優於鏈間退火，且比鏈間退火更穩定的動力學特性，使非目的系列片段兩端反向重複序列在退火時產生類似「鍋柄」的結構，無法與引物配對不能擴增，從而選擇性富集目的基因序列片段。現有技術二的缺點是無法處理多個樣本多個時期的mRNA差異表達研究。
發明內容
本發明實施例的目的在於提供一種3』 -cDNA展示方法，旨在解決假陽性高，效率較低，無法處理多個樣本多個時期的mRNA差異表達研究的問題。本發明實施例是這樣實現的，一種3』 -cDNA展示方法，其特徵在於，該方法的主要步驟包括(I)以總RNA或者mRNA為模板，以設計合成的Oligo (dT) 18V引物通反轉錄合成cDNA雙鏈；(2)將步驟⑴得到產物通過Taq I內切酶進行酶切；
(3)將步驟⑵產物與設計合成的「Y」形接頭用T4連接酶連接；(4)以Oligo (dT)18V及Taq I 「Y」形接頭序列設計引物進行PCR擴增。(5)變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測。進一步，所述變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測方法進一步包括(I)以總RNA或者mRNA為模板，以設計合成的Oligo (dT) 18V引物通過反轉錄合成cDNA雙鏈；(2)將步驟⑴得到產物通過Taq I內切酶進行酶切，得到兩端具有粘性末端的cDNA片段及一端為粘性末端另一端為PolyA末端的cDNA片段；(3)將步驟⑵產物與設計合成的「Y」形接頭用T4連接酶連接，得到兩種產物，一 種是兩端都連接上「Y」形接頭的片段，另一種是一端連接上「Y」形接頭一端具有PolyA末端的cDNA片段；(4)以Oligo (dT)18V及Taq I「Y」形接頭序列設計引物進行PCR擴增，其結果是兩端都連接上「Y」形接頭的片段在PCR擴增中因其片段兩尾的互補序列而形成鍋柄狀結構，擴增受到抑制；而一端連接上「Y」形接頭一端具有PolyA末端的cDNA片段在擴增中得到正常指數擴增。進一步，所述展示方法應用「Y」形接頭與酶切片段連接，抑制非PolyA末端的cDNA擴增，讓具有「Y」形接頭及PolyA末端的cDNA得到指數擴增，排除了非PolyA末端cDNA的幹擾，從而只擴增cDNA 3』末端序列。本發明應用「Y」形接頭與酶切片段連接，抑制非PolyA末端的cDNA擴增，讓具有「Y」形接頭及PolyA末端的cDNA得到指數擴增，排除了非PolyA末端cDNA的幹擾。因此，本發明方法能夠展示基於mRNA水平的基因表達譜，可用來篩選差異表達基因。方案中RNA模板需要量少，適用於任何來源生物樣品RNA，具有經濟性好、效率高、可靠性強、冗餘度低及假陽性低等優點。
圖1是本發明實施例提供的變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測的流程圖。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。本發明公開一種基於mRNA水平的3』 -cDNA限制性片段展示方法，其特點是經濟性好、冗餘度低及假陽性低。該方法的主要步驟包括(I)以總RNA(或者mRNA)為模板，以設計合成的Oligo (dT)18V引物通過反轉錄合成cDNA雙鏈。(2)將步驟(I)得到產物通過Taq I內切酶進行酶切。(3)將步驟(2)產物與設計合成的「Y」形接頭用T4連接酶連接。
(4)以Oligo (dT)18V及Taq I「Y」形接頭序列設計引物進行PCR擴增。(5)變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測(原理見圖1)。本發明方法能夠展示基於mRNA水平的基因表達譜，可用來篩選差異表達基因。方案中RNA模板需要量少，適用於任何來源生物樣品RNA，具有經濟性好、冗餘度低及假陽性低等優點。
所述變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測進一步包括(I)以總RNA或者mRNA為模板，以設計合成的Oligo (dT) 18V引物通過反轉錄合成cDNA雙鏈；(2)將步驟(I)得到產物通過Taq I內切酶進行酶切，得到兩端具有粘性末端的cDNA片段及一端為粘性末端另一端為PolyA末端的cDNA片段；(3)將步驟⑵產物與設計合成的「Y」形接頭用T4連接酶連接，得到兩種產物，一種是兩端都連接上「Y」形接頭的片段，另一種是一端連接上「Y」形接頭一端具有PolyA末端的cDNA片段；(4)以Oligo (dT)18V及Taq I「Y」形接頭序列設計引物進行PCR擴增，其結果是兩端都連接上「Y」形接頭的片段在PCR擴增中因其片段兩尾的互補序列而形成鍋柄狀結構，擴增受到抑制；而一端連接上「Y」形接頭一端具有PolyA末端的cDNA片段在擴增中得 到正常指數擴增。進一步，所述展示方法應用「Y」形接頭與酶切片段連接，抑制非PolyA末端的cDNA擴增，讓具有「Y」形接頭及PolyA末端的cDNA得到指數擴增，排除了非PolyA末端cDNA的幹擾，從而只擴增cDNA 3』末端序列。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種3』 -CDNA展示方法，其特徵在於，該方法的主要步驟包括 (1)以總RNA或者mRNA為模板，以設計合成的Oligo(dT) 18V引物通過反轉錄合成cDNA雙鏈； (2)將步驟(I)得到產物通過TaqI內切酶進行酶切； (3)將步驟(2)產物與設計合成的「Y」形接頭用T4連接酶連接； (4)以Oligo(dT)18V及Taq I 「Y」形接頭序列設計引物進行PCR擴增； (5)變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測。
2.如權利要求1所述的3』-cDNA展示方法，其特徵在於，所述變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測方法進一步包括 (1)以總RNA或者mRNA為模板，以設計合成的Oligo(dT) 18V引物通過反轉錄合成cDNA雙鏈； (2)將步驟(I)得到產物通過TaqI內切酶進行酶切，得到兩端具有粘性末端的cDNA片段及一端為粘性末端另一端為PolyA末端的cDNA片段； (3)將步驟(2)產物與設計合成的「Y」形接頭用T4連接酶連接，得到兩種產物，一種是兩端都連接上「Y」形接頭的片段，另一種是一端連接上「Y」形接頭一端具有PolyA末端的cDNA片段； (4)以Oligo(dT)18V及Taq I 「Y」形接頭序列設計引物進行PCR擴增，其結果是兩端都連接上「Y」形接頭的片段在PCR擴增中因其片段兩尾的互補序列而形成鍋柄狀結構，擴增受到抑制；而一端連接上「Y」形接頭一端具有PolyA末端的cDNA片段在擴增中得到正常指數擴增。
3.如權利要求1所述的3』-cDNA展示方法，其特徵在於，所述展示方法應用「Y」形接頭與酶切片段連接，抑制非PolyA末端的cDNA擴增，讓具有「Y」形接頭及PolyA末端的cDNA得到指數擴增，排除了非PolyA末端cDNA的幹擾，從而只擴增cDNA 3』末端序列。
全文摘要
本發明公開了一種3』-cDNA展示方法，步驟為(1)以總RNA(或者mRNA)為模板，以設計合成的Oligo (dT)18V引物通過反轉錄合成cDNA雙鏈；(2)將步驟(1)得到產物通過TaqⅠ內切酶進行酶切；(3)將步驟(2)產物與設計合成的「Y」形接頭用T4連接酶連接；(4)以Oligo (dT)18V及TaqⅠ「Y」形接頭序列設計引物進行PCR擴增。(5)變性聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測。本發明應用「Y」形接頭與酶切片段連接，抑制非PolyA末端的cDNA擴增，讓具有「Y」形接頭及PolyA末端的cDNA得到指數擴增，排除了非PolyA末端cDNA的幹擾，從而只擴增cDNA 3』末端序列，具有經濟性好、效率高、可靠性強、冗餘度低及假陽性低等優點，能夠同時研究多個樣本多個時期的生物體mRNA時空特異表達情況，是發掘基因的功能、探索生物發育機制等的有力工具。
文檔編號C12Q1/68GK102994632SQ201210382040
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月10日 優先權日2012年10月10日
發明者賈定洪, 鄭林用, 彭衛紅, 甘炳成, 黃忠乾, 譚偉, 王波, 謝麗源 申請人:四川省農業科學院土壤肥料研究所