一種糖尿病預測標誌物-纖維膠凝蛋白-3(Ficolin-3)化學發光定量檢測試劑盒及其製備方法

2023-09-13 20:36:00 1

一種糖尿病預測標誌物-纖維膠凝蛋白-3(Ficolin-3)化學發光定量檢測試劑盒及其製備方法
【專利摘要】本發明提供了一種糖尿病預測標誌物-纖維膠凝蛋白-3(Ficolin-3)化學發光定量檢測試劑盒及其製備方法。根據本發明的試劑盒包括纖維膠凝蛋白-3校準品、酶標記的抗纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體，纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體包被的固相載體，清洗液以及上述酶所作用的化學發光底物。本發明還提供了上述試劑盒的製備方法，包括酶標記抗體、用抗體包被固相載體、校準品配製、發光底物配製等步驟。本發明的試劑盒主要針對糖尿病早期發現、及時幹預提供了診斷依據。同時本試劑盒具有線性範圍寬、校準品系列穩定並可直接使用、操作方便，更符合臨床應用需求的優點。
【專利說明】一種糖尿病預測標誌物-纖維膠凝蛋白-3 (Fi Co I in-3)化學發光定量檢測試劑盒及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及免疫分析醫學領域，具體地，本發明提供了一種糖尿病早期診斷標誌物-纖維膠凝蛋白-3(Ficolin-3)化學發光定量檢測試劑盒及其製備方法。
【背景技術】
[0002]近30年來，我國糖尿病患病率顯著增加。1980年全國14省市30萬人的流行病學資料顯示，糖尿病的患病率為0.7%。2007-2008年，在中華醫學會糖尿病學分會組織下，全國14個省市進行了糖尿病的流行病學調查。結果顯示我國20歲以上的成年人糖尿病患病率為9.VA。對於糖尿病患者而言，早期發現、早期確診和早期治療糖尿病是讓他們恢復健康的關鍵，要實現上述目標，就需要找到合適的標誌物以實現糖尿病的早期發現，從而進一步實現糖尿病的早期確診和早期治療；因此，早期診斷和治療為目的去研究和尋找能夠用作預測和診斷糖尿病的蛋白質分子標記物具有十分重要的意義。
[0003]近年來人們越來越傾向將糖化血紅蛋白(HbAlc)作為篩查糖尿病高危人群和診斷糖尿病的一種方法。但ffiAlc檢測目前在我國尚不普遍，而且我國HbAlc檢測方法的標準化程度不夠，HbAlc測定的儀器和質量控制尚不能符合目前糖尿病診斷標準的要求。此外，中國人群中ffiAlc診斷糖尿病的切點是否與國際上一致還尚待研究證實。基於以上原因，目前尚不推薦在我國採用ffiAlc診斷糖尿病。但是近來出現了很多關於纖維膠凝蛋白-3(Ficolin-3)應用的報導，報導顯示Ficolin-3表達水平與糖尿病有很大關係，Ficolin-3在糖尿病病人血清中的表達水平高於正常健康對照血清中的表達水平。並最終明確Ficolin-3在糖尿病領域的重要發現為糖尿病的早期發現、及時幹預提供了必要手段，同時也為未來糖尿病的有效治療提出進一步探索的方向。
[0004]標記免疫分析是一大類高特異性檢測技術的總稱，因其具有許多獨特優點，已廣泛應用於基礎醫學和臨床各領域。它們的基本原理相同，僅依標記物的不同而最終測量所發出的信號而異。雖然文獻報告的方法已有10餘種，但有推廣應用價值或已被廣泛應用的主要有:放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、時間分辨螢光免疫分析(TRFIA)和化學發光免疫分析(CLIA)等。放射免疫分析因使用放射性核素，汙染環境，有效期短，測量時間長等自身缺點難以實現自動化，限制了進一步發展。酶免疫分析因其存在所發信號時間短的缺點，現階段化學發光免疫分析法佔主導地位。根據大量的實驗結果及臨床應用資料，從實用性、穩定性、準確性及發展前景來看，依次為:化學發光免疫分析、時間分辨螢光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析
[0005]目前纖維膠凝蛋白-3診斷試劑盒國內較少，國外試劑盒基本上是用傳統的酶聯免疫(ELISA)方法進行測定且大多都應用於研發方面。性能方面其檢測範圍均偏窄(檢測最高限均小於I U g/ml)，而根據文獻記載，目前針對糖尿病檢測用纖維膠凝蛋白-3的臨床正常值在7-53 u g/ml,因此如果將上述ELISA試劑盒應用於糖尿病的診斷，將需要對樣本進行大濃度稀釋，會大大增加用戶操作的複雜程度。同時由於未解決纖維膠凝蛋白-3校準品系列溶液不穩定的問題，因此國內外廠家的試劑盒基本都要求在檢測時使用試劑盒中的纖維膠凝蛋白-3高濃度液體，採用現用現配的方式獲得校準品系列，這種做法進一步增大了用戶的操作複雜性，且存在批間差異大、可控性差等問題。綜上所述，目前市場上的纖維膠凝蛋白-3試劑盒採用酶聯免疫法，存在線性範圍過窄、不能覆蓋臨床的正常和異常值範圍，校準品系列需檢測前配製等缺陷，操作複雜性很高，批間差異大、可控性差，達不到臨床應用的要求。

【發明內容】

[0006]本發明所要解決的技術問題是:解決上述市場上纖維膠凝蛋白-3試劑盒所存在的問題，提供出一種纖維膠凝蛋白-3化學發光定量檢測試劑盒及其製備方法。此試劑盒具有線性範圍寬、校準品系列穩定並可直接使用、操作方便，更符合臨床應用需求的特點。
[0007]本發明的目的之一是在於提供一種糖尿病預測標記物-纖維膠凝蛋白-3 (Ficolin-3)化學發光定量檢測試劑盒。
[0008]本發明的再一目的是提供一種製備上述試劑盒的方法。
[0009]根據本發明的試劑盒包括:
[0010]I)纖維膠凝蛋白-3校準品；
[0011]2)鹼性磷酸酶標記抗纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體工作液；
[0012]3)纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體包被的固相載體工作液；
[0013]4)清洗液；
[0014]5)化學發光底物。
[0015]根據本發明的試劑盒，其中，所述的固相載體為磁性微粒，大小為200nm?3iim，磁性微粒表面的活性基團為-C00H。
[0016]根據本發明的試劑盒，其中，所述化學發光底物的主要成分為1，2_ 二氧環乙烷類衍生物或APS-5。
[0017]根據本發明的試劑盒，其中，所述I，2- 二氧環乙烷類衍生物為(金剛烷)-1，2- 二氧環乙烷、AMPro (3- (2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4- (3-磷氧醯)-苯基-1，2- 二氧環乙烷二鈉鹽)、CSPD, CDP-star 或 Lumigen PPD。
[0018]根據本發明的試劑盒，其中，所述纖維膠凝蛋白-3校準品溶液中的穩定劑是含量為I %的乾酪素鈉。
[0019]本發明提供了一種製備上述試劑盒的方法，包括以下步驟:
[0020]I)配製纖維膠凝蛋白-3校準品；
[0021]2)用纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體包被固相載體，配製工作液；
[0022]3)用鹼性磷酸酶標記纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體，配製工作液；
[0023]4)配製清洗液；
[0024]5)配製化學發光底物；
[0025]6)分裝上述纖維膠凝蛋白-3校準品、纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體包被固相載體工作液、鹼性磷酸酶標記纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體工作液、清洗液以及化學發光底物；
[0026]7)組裝為成品。
[0027]根據本發明的方法，優選，所述鹼性磷酸酶標記抗纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體工作液的製備方法包括以下步驟:
[0028]I)用N，N- 二甲基甲醯胺(DMF)將琥珀醯亞胺配製為10mg/ml的溶液；
[0029]2)配製 0.1M pH8.0±0.05 的 Tris 緩衝液，配製方法為稱取 1211.4mg Tris,加入約80g純化水，充分混勻溶解，用4M鹽酸溶液或4M氫氧化鈉溶液調整溶液pH值到
8.0±0.05，之後補加純化水，將溶液定重在IOOg ;用配好的0.1M pH8.0±0.05的Tris緩衝液溶解鹼性磷酸酶，製備出濃度為2mg/ml的鹼性磷酸酶溶液；
[0030]3)將2mg/ml的鹼性磷酸酶溶液與10mg/ml的琥珀醯亞胺溶液按照體積比為I: 0.4的體積比混合，在室溫條件下反應10-20分鐘，得到鹼性磷酸酶的活化產物。
[0031]4)用N，N- 二甲基甲醯胺(DMF)將亞氨基硫雜環戊烷鹽酸鹽配製為10mg/ml的溶液；
[0032]5)用配好的0.1M pH8.0±0.05的Tris緩衝液溶解抗纖維膠凝蛋白_3單克隆抗體，製備出濃度為2mg/ml的抗纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體的溶液；
[0033]6)將2mg/ml抗纖維膠凝蛋白_3單克隆抗體的溶液與10mg/ml的亞氨基硫雜環戊烷鹽酸鹽按照體積比為1: 0.4的體積比混合，室溫反應10-20分鐘，得到抗纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體的活化產物。
[0034]7)將兩種活化產物按照1:1的體積比混合，室溫反應16-24小時後使用分子篩層析方式得到酶標記的抗纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體。
[0035]8)將上述鹼性磷酸酶連接物與0.1M Tris, 5% BSA,0.9% NaCl，PH值為8.0±0.5的溶液可按照0.5-2 u g/ml的鹼性磷酸酶連接物濃度配製成工作液。
[0036]根據本發明的方法，優選，所述抗纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體包被固相載體工作液的製備方法包括以下步驟:
[0037]I)配製PH6.050mM MES溶液，其中包含9.762g MES，純化水定重至lOOOg，混勻後待用。
[0038]2)配製PH7.40.2M PB溶液:稱取5.244g磷酸二氫鈉，28.836g磷酸氫二鈉，加約800g純化水，攪拌至溶解，用4M鹽酸溶液或4M氫氧化鈉溶液調整溶液pH值到7.4，純化水定重至lOOOg，混勻後待用。
[0039]3)用上述50mM MES溶液將有機磁性微粒配製為20mg/ml的溶液，上磁板吸去上清，加入相同體積的50mM MES溶液清洗，重複清洗三次，最後一次加入相同體積50mM MES溶液保存待用，稱取活化劑N-羥基丁二醯亞胺與乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺，將其用純化水配製為濃度分別為20mg/ml與40mg/ml的溶液待用。在上述50mM MES溶液保存的磁珠中依次加入剛配製的兩種活化劑溶液，加入的活化劑溶液的體積按照公式:V(體積)=M (磁珠質量)X30 yl。活化條件為室溫反應1-4小時。
[0040]4)用上述MES溶液將抗纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體配製為0.5-lmg/ml溶液。後將配製好的抗體全部投入到上述活化後的磁珠溶液中進行連接反應。反應條件為室溫反應
1-4小時。
[0041 ] 5)將連接反應後的溶液上架吸去上清，加入等體積的PB溶液清洗，重複3次，最後一次加入等體積的PB溶液保存待用。
[0042]6)上述將連接好的磁濃縮液與PH7.40.2M PB溶液可按照0.5_2mg/ml的磁性微粒濃度配製成工作液。[0043]根據本發明的方法，優選，所述化學發光底物的配製包括以下步驟:
[0044]I)配製IL的化學發光底物:本化學發光底物的主要成分為針對鹼性磷酸酶的1，
2-二氧環乙烷類衍生物或APS-5。
[0045]2)溶液配製:1，2_ 二氧環乙烷類衍生物或APS_51g，Tris24g，NaC1160g，十六烷基三甲基氯化銨0.0255g,加入純化水約900ml，混勻15分鐘，用4M鹽酸溶液或4M氫氧化鈉溶液調整溶液pH值到9.7±0.05，之後補加純化水定容至1000ml，混勻10分鐘。此發光底物在2-8°C條件下避光保存，使用前需震蕩混勻。
[0046]根據本發明的方法，優選，所述校準品溶液內加入了有助於校準品穩定的成分乾酪素鈉含量為I%，其配製包括以下步驟:
[0047]I)校準品緩衝液的配製:Trisl211.4mg，BSA5g，乾酪素鈉lg，加入純化水約90ml，混勻至各試劑溶解，用4M鹽酸溶液或4M氫氧化鈉溶液調整溶液pH值到7.5±0.05，補加純化水定容至IOOml，混勻待用。
[0048]2)校準品的配製:在上述緩衝液中加入纖維膠凝蛋白-3純品配製而成。
[0049]3)試劑保存:在2-8 °C條件下保存，用前震蕩混勻。
[0050]根據本發明的方法，優選，所述清洗液的配製包括以下步驟:
[0051]I)溶液配製:Trisl211.4mg, NaC19g,吐溫_201g,加入純化水約900ml,混勻至各試劑溶解，用4M鹽酸溶液或4M氫氧化鈉溶液調整溶液pH值到8.0±0.5，補加純化水定容至1000ml，混勻待用。
[0052]2)試劑保存:在2-8 °C條件下保存，用前震蕩混勻。
[0053]本發明的主要創新之處在於:
[0054]1、本發明提供了一種糖尿病預測標誌物-纖維膠凝蛋白-3的定量檢測試劑盒，本發明通過將化學發光分析技術和納米-微米級有機磁性微粒引入到了纖維膠凝蛋白-3的測定系統，有效地增大了免疫反應面積，擴寬了系統的檢測範圍，因而能夠覆蓋臨床糖尿病預測所需的纖維膠凝蛋白-3正常和異常範圍，並使檢測過程更簡單、快速、穩定。適合各大醫院推廣使用，為臨床診斷和科研工作提供一種非常有價值的檢測手段。
[0055]2、本發明所引入的酶是鹼性磷酸酶，相對於辣根過氧化物酶，它有更好的穩定性。
[0056]3、本發明的試劑盒校準品緩衝液中的穩定劑是針對纖維膠凝蛋白-3的適用性進行篩選而確定的，可以有效地保證纖維膠凝蛋白-3校準品系列的穩定性，解決了市場上試劑盒現用現配的校準品應用現狀，方便了臨床應用。
【具體實施方式】
[0057]實施例1纖維膠凝蛋白-3化學發光免疫分析定量試劑盒的製備
[0058]1、鹼性酶標抗體工作液的製備
[0059]I)用N，N- 二甲基甲醯胺(DMF)將琥珀醯亞胺配製為10mg/ml的溶液；
[0060]2)配製0.1M pH8.0±0.05的Tris緩衝液，配製方法為稱取1211.4mg Tris，加入80g純化水，充分混勻溶解，用4M鹽酸溶液或4M氫氧化鈉溶液調整溶液pH值到8.0±0.05，之後補加純化水，將溶液定重至IOOg ;用配好的0.1M pH8.0±0.05的Tris緩衝液溶解鹼性磷酸酶，製備出濃度為2mg/ml的鹼性磷酸酶溶液；
[0061]3)將2mg/ml的鹼性磷酸酶溶液與10mg/ml的琥珀醯亞胺溶液按照體積比為I: 0.4的體積比混合，在室溫條件下反應10-20分鐘(本實施例反應15分鐘)，然後得到鹼性磷酸酶的活化產物。
[0062]4)用N，N- 二甲基甲醯胺(DMF)將亞氨基硫雜環戊烷鹽酸鹽配製為10mg/ml的溶液；
[0063]5)用配好的0.1M pH8.0±0.05的Tris緩衝液溶解抗纖維膠凝蛋白_3單克隆抗體，製備出濃度為2mg/ml的抗纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體的溶液；
[0064]6)將2mg/ml抗纖維膠凝蛋白_3單克隆抗體的溶液與10mg/ml的亞氨基硫雜環戍烷鹽酸鹽按照體積比為1: 0.4的體積比混合，室溫反應10-20分鐘(本實施例反應15分鐘)，然後得到抗纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體的活化產物。
[0065]7)將兩種活化產物按照1:1的體積比混合，室溫反應16-24小時(本實施例反應18小時)後，通過分子篩層析方式得到酶標記的抗纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體。
[0066]8)將上述鹼性磷酸酶連接物與0.1M Tris，5%BSA，0.9%NaCl，PH值為8.0±0.5的溶液可配製成0.5-2 u g/ml的鹼性磷酸酶連接物工作液，本實施例中我們配製的濃度為I U g/mlo
[0067]2.抗纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體包被固相載體工作液的製備包括以下步驟:
[0068]I)配製PH6.050mM MES溶液，其中包含9.762g MES,純化水定重至lOOOg。
[0069]2)配製PH7.40.2M PB溶液，其中包含5.244g磷酸二氫鈉，28.836g磷酸氫二鈉，純化水定重至1000g。
[0070]3)用上述MES緩衝液將外購有機磁珠配製為20mg/ml的溶液，上磁板吸去上清加入相同體積的MES清洗，重複清洗三次，最後一次加入相同體積MES緩衝液保存待用，稱取活化劑N-羥基丁二醯亞胺與乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺，將其用純化水配製為濃度分別為20mg/ml與40mg/ml的溶液待用。在上述MES緩衝液保存的磁珠中依次加入剛配製的兩種活化劑溶液，加入的活化劑溶液的體積按照公式:V (體積)=M(磁珠質量)X30 ill。活化條件為室溫1-4小時(本實施例中反應了 2小時)。
[0071]4)用上述MES溶液將抗纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體配製為0.5-lmg/ml溶液。後將配製好的抗體全部投入到上述活化後的磁珠溶液中進行連接反應。反應條件為室溫1-4小時(本實施例中反應了 2小時)。
[0072]5)將連接反應後的溶液上架吸去上清，加入等體積的PB溶液清洗，重複3次，最後一次加入等體積的PB溶液保存待用。
[0073]6)上述將連接好的抗體-磁性微粒連接物與工作液PH7.40.2M PB溶液可配製成
0.5-2mg/ml的抗體-磁性微粒連接物工作液來使用,本實施例中我們配製濃度為lmg/ml。
[0074]3.化學發光底物的配製包括以下步驟:
[0075]DAMPPDlg, Tris24g，NaCl 160g，十六烷基三甲基氯化銨0.0255g，加入純化水約900ml，混勻15分鐘，用4M鹽酸溶液或4M氫氧化鈉溶液調整溶液pH值到9.7±0.05，之後補加純化水定容至1000ml，混勻待用。此發光底物在2-8°C條件下避光保存，使用前需震蕩混勻。
[0076]2)本實施例紅我們使用AMPH)作為底物的主要成分，AMPPD可被替換成等量的其他1，2_ 二氧環乙烷類衍生物或APS-5，底物中其他成份的量不變。
[0077]4.纖維膠凝蛋白-3校準品的配製[0078]校準品緩衝液:Trisl211.4mg, BSA5g，乾酪素鈉lg，加入純化水約90ml，混勻至各試劑溶解，用4M鹽酸溶液或4M氫氧化鈉溶液調整溶液pH值到7.5±0.05，補加純化水定容至100ml，混勻待用。用校準品緩衝液將纖維膠凝蛋白-3純品分別配製成0，20，80，160，320，640 u g/ml，5個濃度點，共6瓶待用。
[0079]5.清洗液的配製
[0080]溶液配製:Trisl211.4mg, NaC19g,吐溫_201g,加入純化水約900ml,混勻至各試劑溶解，用4M鹽酸溶液或4M氫氧化鈉溶液調整溶液pH值到8.0±0.5，補加純化水定容至1000ml，混勻待用。
[0081]6.半成品及成品組成
[0082]上述步驟所得產品分裝即為半成品。抽出三份經過特異性、精密度、分析靈敏度及穩定性檢定合格才能組成定量檢測試劑盒。組裝成試劑盒後還需抽檢合格後才能出廠。
[0083]實施例2本發明試劑盒的使用方法
[0084]以實施例1製備的試劑盒的具體操作如下:
[0085]實施例2本發明的試劑盒的使用方法:
[0086](I)分別吸取30 U I待測血清或纖維膠凝蛋白-3校準品、60 U I鹼性酶標抗體工作液和60 Ul纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體包被固相載體工作液，加至標記好的相應試管的底部。
[0087](2)用多功能渦旋機輕輕往復震蕩試管架。
[0088](3)試管連架置37°C水浴16分鐘。
[0089](4)加30 ill分離試劑至各試管中。
[0090](5)用多功能渦旋機輕輕往復震蕩試管架。
[0091](6)試管連架37°C水浴10.5分鐘。
[0092](7)試管連架放入磁分離器，磁場中沉澱2分鐘。
[0093](8)用一大而緩慢的圓周運動倒轉磁分離器倒出上清液，把倒轉的試管放在濾紙上，用強有力的動作拍擊磁分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。
[0094](9)加300 U I清洗液至各試管。
[0095](10)用多功能渦旋機輕輕往復震蕩試管架。
[0096](11)試管連架放入磁分離器，磁場中沉澱2分鐘。
[0097](12)用一大而緩慢的圓周運動倒轉磁分離器倒出上清液，把倒轉的試管放在濾紙上，用強有力的動作拍擊磁分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。
[0098](13)重複步驟(9)-(12)兩次。
[0099](14)將試管轉移到發光檢測儀上進行檢測。化學發光免疫分析儀能讀取樣本發光值並自動轉換成纖維膠凝蛋白-3的濃度，結果的單位為U g/ml。
[0100](15)根據所述發光值強度與纖維膠凝蛋白-3濃度的比例關係計算得到所述待測血清中纖維膠凝蛋白-3的濃度。
[0101]實施例3本發明試劑盒的性能檢測
[0102]本發明進行了以下性能指標的檢測:
[0103]1、分析靈敏度 < 0.5 ii g/ml。
[0104]分析靈敏度的做法為:用零濃度校準品作為樣本，重複測定20次，記錄20次測量結果的信號值，計算20次測量結果的平均值(M)和標準差(SD)，根據校準品與相鄰校準品之間的濃度-RLU值結果進行兩點回歸擬合得出一次方程，將M+2SD所對應的信號值帶入上述方程，求出對應的濃度值，即為本試劑盒的分析靈敏度。
[0105]2、線性範圍為 0.5-640 ii g/ml。
[0106]3、精密度:批內< 8%，批間< 10%。
[0107]精密度做法:
[0108]批內精密度:選取3份不同濃度的樣本一次各重複檢測10次，計算10次測定結果的平均值(M)和標準差(SD)，根據公式CV = SD/M均值(各重得出變異係數(CV)。
[0109]批間精密度:選取3份不同濃度的樣本，分三次檢測，一次各重複檢測10次，計算30次測定結果的平均值(M)和標準差(SD)，根據公式CV = SD/M均值(三次得出變異係數(CV)。
[0110]結果如下:
【權利要求】
1.一種纖維膠凝蛋白-3化學發光免疫分析測定試劑盒及其製備方法，其特徵在於，所述試劑盒包括: 1)纖維膠凝蛋白-3校準品； 2)鹼性磷酸酶標記抗纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體工作液； 3)纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體包被的固相載體工作液； 4)清洗液； 5)化學發光底物。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述的固相載體為磁性微粒，大小為200nm-3 y m，磁性微粒表面的活性基團為-COOH。
3.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述化學發光底物的主要成分為1，2_二氧環乙烷類衍生物或APS-5。
4.如權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於，所述1，2_二氧環乙烷類衍生物為(金剛烷)-1，2- 二氧環乙烷、AMPPD (3- (2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4- (3-磷氧醯)-苯基-1，2- 二氧環乙烷二鈉鹽)、CSPD, CDP-star 或 Lumigen PPD。
5.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述纖維膠凝蛋白-3校準品溶液內含有的穩定劑為I%的乾酪素鈉。
6.一種製備權利要求1所述試劑盒的方法，其特徵在於包括以下步驟: 1)配製纖維膠凝蛋白-3校準品； 2)用纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體包被固相載體，配製工作液； 3)用鹼性磷酸酶標記纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體，配製工作液； 4)配製清洗液； 5)配製化學發光底物； 6)分裝上述纖維膠凝蛋白-3校準品、纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體包被固相載體工作液、鹼性磷酸酶標記纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體工作液、清洗液以及化學發光底物； 7)組裝為成品。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述鹼性磷酸酶標記抗纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體工作液的製備方法包括以下步驟: 1)用N，N-二甲基甲醯胺(DMF)將琥珀醯亞胺配製為10mg/ml的溶液； 2)配製0.1M pH8.0±0.05的Tris緩衝液，配製方法為稱取1211.4mg Tris，加入約80g純化水，充分混勻溶解，用4M鹽酸溶液或4M氫氧化鈉溶液調整溶液pH值到8.0±0.05，之後補加純化水，將溶液定重在IOOg ;用配好的0.1M pH8.0±0.05的Tris緩衝液溶解鹼性磷酸酶，製備出濃度為2mg/ml的鹼性磷酸酶溶液； 3)將2mg/ml的鹼性磷酸酶溶液與10mg/ml的琥珀醯亞胺溶液按照體積比為1: 0.4的體積比混合，在室溫條件下反應10-20分鐘，得到鹼性磷酸酶的活化產物。 4)用N，N-二甲基甲醯胺(DMF)將亞氨基硫雜環戊烷鹽酸鹽配製為10mg/ml的溶液； 5)用配好的0.1M pH8.0±0.05的Tris緩衝液溶解抗纖維膠凝蛋白_3單克隆抗體，製備出濃度為2mg/ml的抗纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體的溶液； 6)將2mg/ml抗纖維膠凝蛋白_3單克隆抗體的溶液與10mg/ml的亞氨基硫雜環戍燒鹽酸鹽按照體積比為1: 0.4的體積比混合，室溫反應10-20分鐘，得到抗纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體的活化產物。 7)將兩種活化產物按照1:1的體積比混合，室溫反應16-24小時後使用分子篩層析方式得到純度較高的酶標記的抗纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體連接物。 8)將上述鹼性磷酸酶連接物與0.1M Tris, 5% BSA, 0.9% NaCl，PH值為8.0±0.5的溶液可按照0.5-2 u g/ml的鹼性磷酸酶連接物濃度配製成工作液。
8.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述抗纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體包被固相載體工作液的製備方法包括以下步驟: 1)配製PH6.050mM MES溶液，其中包含9.762g MES，純化水定重至lOOOg，混勻後待用。 2)配製PH7.40.2M PB溶液:稱取5.244g磷酸二氫鈉，28.836g磷酸氫二鈉，加約800g純化水，攪拌至溶解，用4M鹽酸溶液或4M氫氧化鈉溶液調整溶液pH值到7.4，純化水定重至lOOOg，混勻後待用。 3)用上述50mMMES溶液將有機磁性微粒配製為20mg/ml的溶液，上磁板吸去上清，加入相同體積的50mM MES溶液清洗，重複清洗三次，最後一次加入相同體積50mM MES溶液保存待用，稱取活化劑N-羥基丁二醯亞胺與乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺，將其用純化水配製為濃度分別為20mg/ml與40mg/ml的溶液待用。在上述50mM MES溶液保存的磁珠中依次加入剛配製的兩種活化劑溶液，加入的活化劑溶液的體積按照公式:V(體積)=M(磁珠質量)X30iU。活化條件為室溫反應1-4小時。 4)用上述MES溶液將抗纖維膠凝蛋白-3單克隆抗體配製為0.5-lmg/ml溶液。後將配製好的抗體全部投入到上述活化後的磁珠溶液中進行連接反應。反應條件為室溫反應1-4小時。 5)將連接反應後的溶液上架吸去上清，加入等體積的PB溶液清洗，重複3次，最後一次加入等體積的PB溶液保存，作為磁濃縮液待用。 6)上述將連接好的磁濃縮液與PH7.40.2M PB溶液可按照0.5-2mg/ml的磁性微粒濃度配製成工作液。
9.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述化學發光底物的配製包括以下步驟: 1，2-二氧環乙烷類衍生物或八?5-51§，Tris24g, NaC1160g，十六烷基三甲基氯化銨0.0255g，加入純化水約900ml，混勻15分鐘，用4M鹽酸溶液或4M氫氧化鈉溶液調整溶液pH值到9.7±0.05，之後補加純化水至1000ml，混勻待用。
10.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述校準品的配製包括以下步驟: 1)校準品緩衝液的配製:Trisl211.4mg，BSA5g，乾酪素鈉lg，加入純化水約90ml，混勻至各試劑溶解，用4M鹽酸溶液或4M氫氧化鈉溶液調整溶液pH值到7.5±0.05，補加純化水定容至100ml，混勻待用。 2)校準品的配製:在上述緩衝液中加入纖維膠凝蛋白-3純品配製而成。
11.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述清洗液的配製包括以下步驟: Trisl211.4mg, NaC19g，吐溫_201g，加入純化水約900ml，混勻至各試劑溶解，用4M鹽酸溶液或4M氫氧化鈉溶液調整溶液pH值到8.0±0.5，補加純化水定容至1000ml，混勻待用。
【文檔編號】G01N33/544GK103454265SQ201310344751
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月9日 優先權日:2013年8月9日
【發明者】馮君君, 何蕾, 劉向禕, 路晟 申請人:北京潤諾思醫療科技有限公司