亞洲梨火疫病菌的檢測試劑盒及檢測方法
2023-09-13 06:40:10 2
專利名稱：亞洲梨火疫病菌的檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明亞洲梨火疫病菌(￡rw/mh;^n/0//fle)的檢測試劑盒及其檢測方法， 屬於生物技術領域。專用於海關進出境亞洲梨所帶亞洲梨火疫病菌的高靈敏度快 速檢測，同時可用于田間亞洲梨火疫的早期診斷和病菌的監測。
(二)
背景技術：
自1995年起，在韓國的Chuncheon地區果園的亞洲梨/^n/o//"e)上發 現一種與梨火疫病(￡nW"/"aw> /owm)十分相似的病害。隨後的研究表明該病 與梨火疫病十分相似但又不完全相同。該菌主要侵染亞洲梨和部分西洋梨 cwmrno^)品種，對蘋果無致病力。最終在德國所做的分子生物學鑑定進一步將 此病鑑定為一個新種亞洲梨火疫病菌(￡rw/m'a;^n/o/z'加)。我國沒有發生此病 害，是我國規定的檢疫性有害生物。該病主要侵染梨樹花序和嫩枝，引起花腐 和枝枯，症狀與五nWm'a amy/ovom引起的症狀十分相似。
亞洲梨火疫病菌對於我國，目前最有可能亦最危險的傳播途徑是通過帶菌接 穗、苗木和果實的傳帶，所以在海關加強檢驗檢疫是十分必要的。檢測技術先 進、可靠，外來有害生物傳入的風險就可以降低。目前國內外農產品及植物種苗 交易十分頻繁，有必要建立一種準確率和靈敏度均高的快速檢測方法來檢測亞洲 梨火疫病菌，尤其是無症狀的植物材料的檢測。由於該病是我國的一類檢疫性病 害，因此在我國檢疫是主要的控制此病害的手段，嚴格限制或禁止從發生此病害 的國家和地區進口梨和苗木等，從其它國家進口的種子必須進行有關的檢驗。目 前亞洲梨火疫具體的檢測手段主要是傳統的檢測技術和分子檢測技術。傳統的檢 測技術包括利用半選擇性培養基分離和鑑定病菌、免疫學檢測方法、致病性測定 及過敏反應測定、生理生化反應測試等。這些方法往往需耗費較長時間並且靈敏 度和準確性不高，因此常規的檢測方法難以適應檢疫的需求。近年來，採用PCR擴增病原菌的致病性基因、未知的DNA片段、質粒DNA和 rDNA轉錄間隔區(ITS)等進行病原菌鑑定、檢測及病害診斷為國際上廣泛使 用。Bereswil瞎人(1992)利用梨火疫病菌的pEA29質粒上0.9kb的戸/I片段對梨火 疫病菌進行特異性鑑定，特異性擴增梨火疫病菌菌體，檢測靈敏度可達50個菌體 細胞，並在6小時內可得結果。Bereswill等人(1995)利用梨火疫病菌的^w^基因 設計了一對引物，對梨火疫病菌進行特異性檢測，專化性極好，由於^w基因的 拷貝數很低，因此靈敏度只有擴增pEA29質粒PCR技術的1/10 (500細胞)。 Merighi等(2000)利用PCR-ELISA技術對梨火疫病進行了檢測，檢測人工接種 的梨枝條，靈敏度達4Xl(^cfij/g。但是這些報導都是針對五nw'w'fl flmj;/ovora設計 的引物，無法將亞洲梨火疫區分開來。
隨著近年來我國口岸對亞洲梨及種苗進口的增多，該病菌從疫區進入我國的 機會亦增多，但我國口岸缺乏必要的對該病菌的檢測方法。病害防治、預測預報 及植物檢疫需要有準確快速的病菌檢測方法，尤其是需要我國擁有自主智慧財產權 的檢測方法，從而可以將之投入到商業生產和應用中，目前在這一領域還沒有一 種既靈敏特異又快速的亞洲梨火疫檢測方法的報導。此項發明滿足了這些需求。 參考文獻
Bereswill， S.， Pahl, A., Bellemann， P., Zeller, W. & Geider, K. (1992). Sensitive and species-specific detection of五nv/wi.a a附y/ovora by polymerase chain reaction analysis.五"v/ro" M/cro&o/ 58, 3522-3526;
Bereswill, S., Bugert, P.， Bruchmttller， I, Geider,K. (1995) Identification of the fire blight pathogen, ￡nw>n'a a/ny/ovora by PCR assays with chromosomal DNA. i4pp"erf朋d e"v!'ra"附抓a/冊'cro6!'o/ogy 61 (7), 2636-2642;
Merighi, M.， Sandrini, A,, Landini, S,， Ghini, S.， Girotti, S., Malaguti， S. and Bazzi， C. (2000) Chemiluminescent and Colorimetric Detection of ￡rw/"i'a affiy/ovora by Immunoenzymatic Determination of PCR Amplicons from PlasmidpEA29/Va"/Z)&eaye 84 (1) ， 49-5
發明內容
技術問題本發明的目的是解決現有技術中亞洲梨火疫的生物學檢測方法所 需周期長、鑑定困難等問題，提供亞洲梨火疫的檢測方法及其檢測試劑盒，對亞 洲梨火疫進行PCR檢測，準確性高、周期短、靈敏性好。
技術方案
亞洲梨火疫檢測試劑盒，包括以下成分 亞洲梨火疫的特異性引物序列上遊引物HrcC-Fl: 5'-GACGTTTGCACCTGGAAACCG-3' 下遊引物HrcC-Rl: 5'-GCGGTAGGTAATCAAGGCCAC-3'
試劑盒反應體系
1 mL檢測溶液包括0.05咖olTris.Cl、 0. 125mmol KC1 、 0.0025 mmol MgCl2、 0.01 mmol dNTPs、上、下遊引物O. 25咖ol、 0. lmg BSA、 Taq DNA聚合酶 100單位。該溶液儲存於-2(TC冰箱。保存期限為l年。 上述亞洲梨火疫檢測試劑盒用於檢測亞洲梨火疫的方法，包括
1) 菌懸液製備
將發病梨枝條表面消毒後切成小段，然後用滅菌水浸泡30min，離心取上 清，以此菌懸液為模板。
2) 亞洲梨火疫的PCR檢測
取1 DNA溶液，加入10 pL試劑盒溶液和14nL滅菌超純水，總體積25
PCR擴增程序為94。C變性3分鐘；進入循環，94。C變性30秒，62。C退火30 秒，72。C延伸30秒，30個循環；最後72。C延伸5分鐘。
擴增產物的電泳檢測取10 PCR擴增產物，在1% (克/100毫升)的瓊 脂糖凝膠上進行電泳，電壓為50-100V， 30分鐘後在紫外光下檢測結果；如果 存在分子量約為476 bp的DNA條帶，則證明所檢測病原為亞洲梨火疫。 有益效果本發明與現有技術相比，其優點和積極效果表現在
(1) 實用性好直接從病組織中檢測亞洲梨火疫具重要的實際應用價值。亞洲 梨火疫隨貿易往來最可能的傳播途徑是隨植物材料(如種苗、接穗等)傳播，在 貿易口岸中，檢疫部門主要是通過對病殘體中病菌的分離、鑑定來判別是否攜帶 亞洲梨火疫。但是目前的檢測方法需要對該病原菌進行分離純化，需要幾天的時 間；且分離過程中很容易受一些腐生菌的幹擾，無法滿足海關檢疫的需要。為了 使我們的檢疫方法具有實際的應用價值，我們採取從病組織製備菌懸液直接進行 PCR擴增，可在6小時內完成對亞洲梨火疫的檢測。因此本方法大大提高了檢測 的效率。
(2) 準確性高由於傳統亞洲梨火疫的檢測技術只是根據分離菌的生理生化特 徵來確定對象，無法區分相近種，從而導致準確性不高；而本發明根據亞洲梨火
5疫的//kC基因序列，利用Bioedit軟體對該序列與其它相似種的///rC基因序 列進行比較，選擇亞洲梨火疫特有的一段保守序列做特異引物，能根據變異序列 設計特異性引物進行擴增比較，為病原菌的鑑定和檢測提供準確的靶標位點。經 過與亞洲梨火疫以及其它不同植物病原菌的比較，該引物的準確率為100%。
(3)靈敏度高試劑盒研製中我們觀察到，在菌懸液濃度為104 cfu /mL時， 按本試劑盒的方法可以檢測到特異性條帶；該濃度下反應體系中僅有50個活菌 體，表明本試劑盒足以在菌濃度較低的情況下檢測亞洲梨火疫。
(四) 說明書附圖
圖l亞洲梨火疫的特異PCR擴增
(A) M為DNA Maker DL2000, 1~17為亞洲梨火疫，18為陰性對照
(B) M為DNA Maker DL2000， 1為亞洲梨火疫，2~8為梨火疫(￡rm'm'a "wy/ovom) ， 9 22為其他細菌，23為陰性對照
以設計的亞洲梨火疫特異性引物對17個亞洲梨火疫菌株擴增，均可檢測到 擴增產物。對包括5mz'm'aamy/ovom在內的15種其他菌均無擴增產物。 圖2亞洲梨火疫的靈敏度PCR擴增
M為DNA Maker DL2000， PCR反應體系中的亞洲梨火疫菌懸液濃度(cfu/ml): 1， 108; 2， 107; 3, 106; 4, 105; 5， 104; 6, 103; 7, ddH20，分別以十倍梯度稀釋的 菌懸液為模板，利用特異引物進行PCR檢測，最低可檢測到104 cfu/ml (50個 菌體)。
(五)
具體實施例方式
實施例1:亞洲梨火疫的特異性引物HrcC-Fl/HrcC-Rl的PCR擴增。
亞洲梨火疫檢測試劑盒，包括以下成分
亞洲梨火疫的特異性引物序列
上遊引物HrcC-Fl: 5'-GACGTTTGCACCTGGAAACCG-3' 下遊引物HrcC-Rl: 5'-GCGGTAGGTAATCAAGGCCAC隱3'
試劑盒反應體系1 mL檢測溶液包括0.05 mmolTris'Cl、 0. 125mrno1 KC1、 0.0025 mmol MgCl2、 0.01 mmol dNTPs、上、下遊引物0.25 mmol、 O.lmgBSA、 Taq DNA聚合 酶100單位。該溶液儲存於-2CTC冰箱。保存期限為l年。 實例l從浙江發病梨枝檢測亞洲梨火疫
上述亞洲梨火疫檢測試劑盒用於檢測亞洲梨火疫的方法，包括
1)亞洲梨火疫的PCR檢測
取1 菌懸液，加入10 nL試劑盒溶液和14pL滅菌超純水，總體積25
PCR擴增程序為94'C變性3分鐘；進入循環，94 'C變性30秒，62'C退火 30秒，72。C延伸30秒，30個循環；最後72。C延伸5分鐘。 擴增產物的電泳檢測取io ^LPCR擴增產物，在1% (克/100毫升)的瓊脂糖凝 膠上進行電泳，電壓為50-100V， 30分鐘後在紫外光下檢測結果；如果存在分子 量約為330bp的DNA條帶，則證明所檢測病原為亞洲梨火疫(圖2)。
權利要求
1、亞洲梨火疫檢測試劑盒，包括以下成分亞洲梨火疫的特異性引物序列如下上遊引物HrcC-F15′-GACGTTTGCACCTGGAAACCG-3′下遊引物HrcC-R15′-GCGGTAGGTAATCAAGGCCAC-3′試劑盒反應體系1mL檢測溶液包括50mmol.L-1Tris.Cl、125mmol.L-1KCl、2.5mmol.L-1MgCl2、10mMdNTPs、上、下遊引物0.25mmol/mL、0.1mg.mL-1BSA、Taq DNA聚合酶100單位。
2、 權利要求l所述亞洲梨火疫檢測試劑盒用於檢測亞洲梨火疫的方法，包括取l ^LDNA溶液或菌懸液，加入9nL試劑盒溶液和15pL滅菌去離子 水，總體積為25^L;PCR擴增程序為94。C變性3分鐘；進入循環，94。C變性30秒，62。C退火30 秒，72。C延伸30秒，30個循環；最後72。C延伸5分鐘；擴增產物的電泳檢測取10 nLPCR擴增產物，在1% (克/100毫升)的瓊 脂糖凝膠上進行電泳，電壓為50-100V， 30分鐘後在紫外光下檢測結果；如果 存在分子量約為476bp的DNA條帶，則證明所檢測病原為亞洲梨火疫。
全文摘要
本發明亞洲梨火疫的檢測試劑盒屬於農作物防病治病及植物檢疫範疇。上遊引物HrcC-F15′-GACGTTTGCACCTGGAAACCG-3′；下遊引物HrcC-R15′-GCGGTAGGTAATCAAGGCCAC-3′。試劑盒包括1mL檢測溶液，含50mmol.L-1Tris.Cl、125mmol.L-1KCl、2.5mmol.L-1MgCl2、10mMdNTPs、上、下遊引物0.25mmol/mL、0.1mg.mL-1BSA、Taq DNA聚合酶100單位。以此引物為基礎的亞洲梨火疫檢測試劑盒具較強的特異性、靈敏性及穩定性，為亞洲梨火疫檢測提供了快速、靈敏、特異的技術方法。圖為亞洲梨火疫的特異PCR產物。
文檔編號C12R1/18GK101509036SQ20091003013
公開日2009年8月19日 申請日期2009年3月27日 優先權日2009年3月27日
發明者劉鳳權, 蕾 張, 田豔麗, 胡白石 申請人:南京農業大學