抑制Nix蛋白表達的siRNA及其應用的製作方法
2023-09-20 06:53:10 1
抑制Nix蛋白表達的siRNA及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了屬於生物【技術領域】的一種抑制Nix蛋白表達的siRNA及其應用。所述抑制Nix蛋白表達的siRNA，其正義鏈序列為序列表中SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列，其反義鏈序列為序列表中SEQ?ID?No.2所示的核苷酸序列。本發明的siRNA能明顯特異性抑制心臟成纖維細胞內Nix的表達，轉染siRNA腺病毒後，明顯抑制細胞周期的進程，來抑制心臟成纖維細胞的增殖，同時明顯抑制細胞外基質蛋白的表達；進一步的siRNA腺病毒可以明顯抑制NE誘導的Nix的表達，抑制NE誘導的心臟成纖維細胞增殖、細胞周期的進程和細胞外基質蛋白的表達，從而起到抗病理性纖維化的作用。
【專利說明】抑制Nix蛋白表達的siRNA及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及一種抑制Nix蛋白表達的siRNA及其應用。
[0002]背景資料
[0003]心衰由於其發病率高(0.9%)，死亡率高(50%)，目前已成為嚴重危害健康的世界性難題。心臟重塑是心衰發病和死亡的重要原因，高血壓、腎上腺素受體激動是促進心臟重塑發生發展的重要因素。心臟重塑的細胞病理學特徵為心肌細胞肥大與死亡，心臟成纖維細胞增殖與基質蛋白合成分泌的增加。以往研究的焦點主要集中於心肌細胞肥大和凋亡的預防和逆轉，近年來，對心臟纖維化的研究越來越受到人們的關注。已經表明抑制纖維化可以有效地控制心臟功能的下降，起到控制和延緩心衰的作用。[0004]1998年發現的Nix蛋白由於其在壓力超負荷導致的心臟肥厚中轉錄上調而引起廣泛關注，在高血壓致心肌肥厚的研究中，靶向心肌細胞轉基因過表達和基因敲除Nix實驗表明其在高血壓導致的心功能障礙、心衰的進程中具有重要的作用。而在對其機制的相關探討中，發現它主要通過兩條通路調控心肌細胞的死亡，從而參與了高血壓致心功能障礙的發生發展。但在心臟細胞中，心肌細胞數目不足三分之一，而非心肌細胞中百分之九十以上為成纖維細胞，心臟成纖維細胞增殖與基質蛋白合成分泌的增加是心臟重塑、心衰發生發展的主要病理學特徵。在高血壓致心衰進程中，以往研究僅關注了 Nix對心肌細胞死亡的影響，而Nix與心臟成纖維細胞的關係及其在心臟成纖維細胞中的作用還未見報導。此外，目前也並沒有發現針對Nix對抗心臟重塑的相關技術。
[0005]基因治療是指將特定的遺傳物質轉入患者特定的靶細胞，以最終達到預防或改變特殊疾病狀態的治療方法。腺病毒載體是基因治療中最常用的病毒載體，它具有包裝容量較大、製備方便且易純化和濃縮、宿主範圍廣、感染效率高等特點。以腺病毒為載體的藥物大部分應用於治療惡性腫瘤，也將可能應用於各種疾病的治療。
【發明內容】
[0006]本發明的第一個目的在於提供一種抑制Nix蛋白表達的siRNA。
[0007]本發明的第二個目的在於提供一種表達載體，其含有上述siRNA。
[0008]本發明的第三個目的在於提供上述siRNA和表達載體在製備抗心肌纖維化的藥物中的應用。
[0009]實現本發明的技術方案如下:
[0010]一種抑制Nix蛋白表達的siRNA，其正義鏈序列為序列表中SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，其反義鏈序列為序列表中SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
[0011]正義鏈:5’to3』 GGCCUAGACAUACAUGAAATT (SEQ ID N0.1)；
[0012]反義鏈:5’to3』 UUUCAUGUAUGUCUAGGCCTT (SEQ ID N0.2)。
[0013]上述siRNA在製備抗心臟纖維化的藥物中的應用。
[0014]一種表達載體,其包含上述siRNA。
[0015]所述表達載體為腺病毒載體。[0016]上述的表達載體在製備抗心臟纖維化的藥物中的應用。
[0017]本發明的抑制Nix蛋白表達的siRNA可以通過人工合成的方法製備。
[0018]本發明的優點或有益效果:本發明的siRNA能明顯特異性抑制心臟成纖維細胞內Nix的表達，轉染siRNA腺病毒後，明顯抑制細胞周期的進程，來抑制心臟成纖維細胞的增殖，同時明顯抑制細胞外基質蛋白的表達；進一步的siRNA腺病毒可以明顯抑制NE誘導的Nix的表達，抑制NE誘導的心臟成纖維細胞增殖、細胞周期的進程和細胞外基質蛋白的表達，從而起到抗病理性纖維化的作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1為siRNA抑制Nix的表達的結果；其中各標號代表:1:對照組；2:陰性對照的siRNA; 3 ；GAPDH-siRNA;4:393 位點的 siRNA ；5:545 位點的 siRNA ；6:1496 位點的 siRNA。
[0020]圖2為螢光顯微鏡下Nix-siRNA腺病毒轉染心臟成纖維細胞的結果。
[0021]圖3為Nix-siRNA腺病毒對Nix表達的影響(*p〈0.05與對照組相比較)。
[0022]圖4為Nix-siRNA腺病毒對細胞增殖的影響(*p〈0.05與對照組相比較)。
[0023]圖5為Nix-siRNA腺病毒對細胞周期的影響。
[0024]圖6為Nix-siRNA腺病毒對纖維連接蛋白和膠原蛋白表達的影響(*p〈0.05與對照組相比較)。
[0025]圖7為高血壓狀態下Nix的表達及去甲腎上腺素的變化(*p〈0.05與對照組相比較)。
[0026]圖8為Nix-siRNA腺病毒對NE誘導的Nix表達的影響(*p〈0.05與對照組相比較，#p〈0.05與NE組相比較)。
[0027]圖9為Nix-siRNA腺病毒對NE誘導的細胞周期的影響。
[0028]圖10為Nix-siRNA腺病毒NE誘導的纖維連接蛋白和膠原蛋白表達的影響(*ρ〈0.05與對照組相比較，#ρ<0.05與NE組相比較)。
圖11為Nix-siRNA腺病毒NE誘導的纖維連接蛋白和膠原蛋白表達的影響(*ρ〈0.05與對照組相比較，#Ρ<0.05與NE組相比較)。
【具體實施方式】
[0029]以下通過實施例對本發明進一步說明。
[0030]以下實施例中的方法中如無特別說明，所用的生化試劑均為市售試劑，所有的方法均為常規方法。
[0031]實施例1本發明的抑制Nix蛋白表達的siRNA的來源
[0032](I) Nix-siRNA 設計
[0033]從Nix蛋白的轉錄本AUG起始密碼子開始，搜尋下遊AA序列，記錄跟每個AA3』端相鄰的19個核苷酸作為候選的siRNA靶位點。有義鏈I位為G或C，19位為A或U，有義鏈15~19至 少有3個A或U，或著13~19至少有5個A或U。
[0034]根據以下原則:GC含量在30% — 50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效；將潛在的序列和相應的基因組資料庫進行比較，排除那些和其他編碼序列及EST同源的序列。最後將靶點定位為393、545、1496三個位點進行化學合成siRNA。併合成陰性對照的 siRNA。
[0035]393 位點的 siRNA:正義鏈:5』 to3』 GGCAGAUCAUGUUUGAUGUTT ；
[0036]反義鏈:5’to3』 ACAUCAAACAUGAUCUGCCTT ；
[0037]545 位點的 siRNA:正義鏈:5』 to3』 CCCAAAGAGUUCCAUUUCATT ；
[0038]反義鏈:5，to3，UGAAAUGGAACYCYYYGGGTT；
[0039]1496 位點的 siRNA:正義鏈:5』 to3』 GGCCUAGACAUACAUGAAATT ；
[0040]反義鏈:5’to3』 UUUCAUGUAUGUCUAGGCCTT。
[0041]上述siRNA委託上海吉瑪製藥技術有限公司直接合成。
[0042](2) Nix-siRNA 的篩選
[0043]將上述合成的siRNA 用 Lipofectamine2000 (invitrogen)轉入 NIH/3T3 細胞中，並選用GAPDH-siRNA作為陽性對照。具體操作步驟詳見Lipofectamine2000( invitrogen)說明書。
[0044]將轉染的細胞消化收集後提取細胞蛋白，進行Western blot檢測Nix與GAPDH的表達。結果如圖1所示，1496位點的siRNA可以明顯抑制Nix的表達。
[0045]實施例2將1496位點的siRNA進行腺病毒包裝
[0046]一、siRNA腺病毒載體的製備`
[0047]首先採用化學合成法合成含幹擾序列的單鏈DNA oligo。然後於90°C水浴15min退火配對產生雙鏈，再通過其兩端所含酶切位點(Age I與EcoR I )直接連入酶切後的RNAi腺病毒載體上；將連接產物轉入製備好的細菌感受態細胞，PCR鑑定陽性重組子後，送測序驗證，測序結果經比對確認正確。陽性克隆即為構建成功的目的基因RNAi腺病毒載體。
[0048]具體操作如下:
[0049]1、採用化學合成法合成以下單鏈DNA oligo(上海吉凱基因有限公司合成):5， to3，
[0050]ccggcaGGCCTAGACATACATGAAActcgagTTTCATGTATGTCTAGGCCTGtttttg。
[0051]2、把上述合成的DNA乾粉溶解於退火緩衝液中，90°C水浴15min，然後自然冷卻至室溫，產生雙鏈。
[0052]3、連接
[0053]通過T4DNA連接酶將雙酶切(Age I與EcoR I)線性化的RNAi腺病毒載體GVl 19(上海吉凱基因有限公司)和上述DNA片段進行連接反應，連接後的產物進行轉化實驗。連接反應體系如下，於16°C連接過夜，連接產物(連接液)進行轉化實驗。
[0054]
鎮劍體$〖(μ1)
線性化的載體DNA lOOng/μΙI
DNA oligo lOOng/μΙI
10*T4噬菌體DNA連接酶緩衝液2
了41俊菌體DNA連接酶I
ddH:015[0055]4、轉化
[0056]感受態細胞的製備:
[0057]配置下述溶液:
[0058]I) 0.1M CaCl2 溶液，以 0.45 μ m 過濾除菌；
[0059]2)250mM KC12 溶液；
[0060]3) 2M MgCl2溶液，高壓滅菌；
[0061]4) S0B:lml250mM KC12 溶液加入 100ml LB，以 5M NaOH 調 PH 值至 7.0，高壓滅菌，臨用前加入0.5ml2M MgCl2溶液。
[0062]用氯化鈣製備新鮮的DH5a大腸桿菌感受態細胞:
[0063]I)從於37°C培養16小時的新鮮平板中挑取一個單菌落，轉到一個含有100ml SOB培養基的IL燒瓶中。於37°C劇烈振搖培養3小時(旋轉搖床，300rpm)。
[0064]2)在無菌條件下將細菌轉移到一個無菌、用冰預冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分鐘，使培養物冷卻至0°c。
[0065]3)於4°C，以4000轉/分離心10分鐘，回收細胞。
[0066]4)倒出培養液，將管倒置I分鐘，使最後殘留的痕量培養液流盡。
[0067]5)以IOml用冰預冷的0.1mol / L CaCl2重懸每份沉澱，放置於冰浴上。
[0068]6)於4°C，以4000轉/分離心10分鐘，回收細胞。
[0069]7)倒出培養液，將管倒置I分鐘，使最後殘留的痕量培養液流盡。
[0070]8)每50ml初始培養物用2ml用冰預冷的0.lmol/L CaCl2重懸每份細胞沉澱。
[0071]9)將細胞分裝成小份，放於-70°C。
[0072]轉化過程:
[0073]配置下述溶液:
[0074]l)250mM KC12 溶液；
[0075]2) 2M MgCl2溶液，高壓滅菌；
[0076]3) SOB 培養基:lml250mM KC12 溶液加入 100ml LB,以 5M NaOH 調 PH 值至 7.0，高壓滅菌，臨用前加入0.5ml2M MgCl2溶液；
[0077]4) SOB 瓊脂培養基:0.49396g MgS04.7H20 溶於 100mLSOB 培養基，加入 1.5g 瓊脂粉，高壓滅菌，冷至溫度低於60°C，加入Amp至終濃度到100 μ g/ml，混勻鋪板，一般90_直徑平皿需要30-50ml培養基；
[0078]5) IM葡萄糖溶液，過濾除菌；
[0079]6) SOC培養基:2ml IM葡萄糖溶液加入100ml SOB培養基；
[0080]轉化步驟:
[0081]I)用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200 μ I轉移到無菌的微量離心管中，每管加2 μ I連接液,輕輕旋轉以混勻內容物,在冰中放置30分鐘。
[0082]2)將管放到預加溫到42°C的循環水浴中放好的試管架上，恰恰放置90秒，不要搖動試管，再快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1-2分鐘。
[0083]3)每管加800μ1 SOC培養基。用水浴將培養基加溫至37°C，然後將管轉移到37°C搖床上，溫育45分鐘 使細菌復甦；將150 μ I已轉化的感受態細胞轉移到含20mmol /L MgS04和Amp抗性(100ug/ml)的LB瓊脂培養基上。[0084]4)將平板置於室溫直至液體被吸收，再倒置平皿，於37°C培養，16小時；
[0085]5)進行陽性克隆PCR。
[0086]5、陽性克隆的PCR鑑定
[0087]挑取轉化子重懸於10 μ I LB溶液，混勻取I μ I作為模板；使用GVl 19通用引物(上海吉凱基因有限公司)，進行菌落PCR鑑定實驗。
[0088]PCR鑑定體系和PCR程序:
[0089]
【權利要求】
1.一種抑制NiX蛋白表達的siRNA，其正義鏈序列為序列表中SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，其反義鏈序列為序列表中SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
2.權利要求1所述的siRNA在製備抗心臟纖維化的藥物中的應用。
3.—種表達載體,其包含權利要求1所述的siRNA。
4.根據權利要求3所述的表達載體,其特徵在於,所述表達載體為腺病毒載體。
5.權利要求3或4所述的表達載體在製備抗心臟纖維化的藥物中的應用。
【文檔編號】A61P9/00GK103882022SQ201410115148
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月26日 優先權日:2014年3月26日
【發明者】錢令嘉, 劉偉麗, 弓景波, 王新興 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所