一種磷黴素生物轉化菌株的篩選方法
2023-09-20 07:16:15
專利名稱：一種磷黴素生物轉化菌株的篩選方法
技術領域：
本發明涉及生物轉化/生物催化技術領域，具體為一種磷黴素生物轉化菌株的新篩選方法。
背景技術：
磷黴素[(-)-順-(1R，2S)-1，2-環氧丙基磷酸，FOM]是一種抑制細菌生長的廣譜抗生素。FOM可以由順丙烯磷酸(cis-propenylphosphonic acid，cPA)經過微生物轉化作用獲得。傳統的方法是採用振蕩培養方法篩選轉化菌株。該方法採用在液體培養基中添加前體cPA，經振蕩培養後，以發酵液的離心上清液為測定樣品。這種方法的缺點是需要較多的勞力、設備和時間。
單菌落瓊脂塊培養法是一種高效率的抗生素生產菌篩選方法。該方法的要點是用打孔器在營養瓊脂平板上打取大小均一的瓊脂塊，並分別把它們移入滅過菌的空平皿中，於每個瓊脂塊上接種待測菌株，保持適合的溫度和溼度，經過一定時間培養。把每一個長有大菌落的瓊脂塊轉移到含有指示菌種(即拮抗對象)的瓊脂平板上，以分別測定它們的抗生素抑菌圈的直徑，從而擇優取之。該方法的關鍵是將單菌落瓊脂塊分別培養，在這種情況下，各單菌落瓊脂塊的培養條件基本相同，且產生的代謝產物不致擴散，因此測得的數據與振蕩培養條件下十分相似，然而工作效率卻大為提高。
該方法的局限在於它僅適合本身可生物合成抗生素的放線菌的篩選，因為放線菌具有發達的基內菌絲(生長於瓊脂塊內部)，在這種情況下，其分泌的抗生素可以均勻地擴散於瓊脂塊中，便於檢測。
發明內容
本發明目的是提供一種快速的、批量篩選FOM生物轉化細菌菌株，又可以在生物鑑定盤上初步區分單菌落轉化效率的新方法。
本發明的技術方案是一種磷黴素生物轉化菌株的篩選方法，在含有順丙烯磷酸前體的瓊脂塊上接種待測菌株培養，然後將瓊脂塊倒置於生物鑑定盤上，檢測、篩選出具有轉化能力的菌株。
瓊脂塊的製備與單菌落瓊脂塊培養包括
1)瓊脂塊培養基組成按重量百分數計，瓊脂塊培養基組成為順丙烯磷酸0.3％，牛肉膏0.5％，蛋白腖1％，NaCl 0.5％，甘油3％，NaVO30.02％，CoCl20.05％，瓊脂1.8-2.0％，餘量為自來水，115℃滅菌30分鐘。
2)瓊脂塊的製備將上述培養基融化，倒入平皿，靜置凝固後，用打孔器打出瓊脂塊，然後在其表面接種待檢測菌株，置於30℃，75％-85％相對溼度下培養4-5天。
磷黴素轉化菌株的篩選包括1)指示菌培養與懸液的配製按重量百分數計，指示菌培養基成分牛肉膏0.5％，蛋白腖1％，NaCl 0.5％，瓊脂2％，餘量為自來水，加熱溶解後，調pH7.0-7.2，121℃溼熱滅菌20分鐘後，擺斜面備用。
指示菌培養37℃培養24hr，菌苔呈半透明至白色。
指示菌懸液的製備把滅菌的生理鹽水倒入茄型瓶中，用接種環刮洗菌苔，再將刮洗液倒入滅菌的生理鹽水中，測定吸光度為0.54-0.57。
2)生物檢定培養基及其平板的製備按重量百分數計，培養基I成分牛肉膏0.5％，蛋白腖1％，NaCl 0.5％，瓊脂2.0％，餘量為自來水，pH7.0-7.2；按重量百分數計，培養基II成分牛肉膏0.5％，蛋白腖1％，NaCl 0.5％，瓊脂1.5％，餘量為自來水，pH7.0-7.2；培養基I、培養基II均在121℃滅菌20分鐘；將融化的培養基I倒入生物鑑定盤，製成下層平板；再將融化的培養基II冷卻至55℃，加入指示菌菌懸液，迅速混勻後倒入生物鑑定盤，製成上層平板。
3)磷黴素轉化菌株生物鑑定將培養好的單菌落瓊脂塊置於紫外燈下滅菌20分鐘，再將瓊脂塊倒置於生物鑑定平板上，37℃培養16hr，觀察並測量抑菌圈直徑；依據抑菌圈的有無和抑菌圈直徑的大小來篩選具有磷黴素生物轉化能力的菌株。
生物鑑定盤所用的指示菌為大腸桿菌或其它磷黴素敏感菌。
本發明通過搖床發酵法對初篩的菌株復篩，培養基為順丙烯磷酸0.3％，牛肉膏0.5％，蛋白腖1％，NaCl 0.5％，甘油3％，NaVO30.02％，CoCl20.02％，餘量為自來水，30℃，160rpm培養4天，通過抑菌圈直徑大小，進一步篩選出轉化效率較高的菌株。
本發明利用薄層層析分析磷黴素，展開劑為正丁醇∶乙酸∶水(體積比3∶1∶1)，將展開後的層析板風乾，置於生物鑑定平板上，待浸潤後取下，37℃培養16hr，含有磷黴素部分產生抑菌圈。
本發明的有益效果是1、本發明利用圓柱狀固體培養基(瓊脂塊)培養待檢測菌株，利用大腸桿菌為生物鑑定的指示菌，篩選磷黴素轉化菌株。根據在等體積並含有等量前體物的瓊脂塊上生長的待選菌株轉化能力不同，產生的磷黴素濃度不同，進而由磷黴素在指示菌平板上產生的抑菌圈大小也不同，最終篩選出磷黴素轉化優勢菌種。
2、本發明方法的設備要求低，操作簡單，非常適用於抗生素生物轉化細菌的初級批量篩選。
圖1為本發明順丙烯磷酸(cPA)在微生物的催化作用下轉化為磷黴素(FOM)示意圖。
具體實施例方式
本發明首先將等量的前體cPA均勻的混入瓊脂塊中並於表面接種待測菌株，生物轉化過程首先需要菌體吸收外源性前體，通過菌體內酶催化作用將其轉化為磷黴素。而由於接種的細菌只生長於瓊脂塊表面，只能吸收並轉化表層的cPA而產生FOM，所以FOM主要積累於瓊脂塊表面。因此，要使篩選靈敏度獲得大幅度提高，將瓊脂塊倒置於生物鑑定平板上作抑菌圈實驗是一個有效途徑，並由抑菌圈大小判斷轉化效率。
本發明的具體操作步驟如下一、指示菌培養與懸液的配製指示菌為大腸桿菌(E.coli)，中國科學院瀋陽應用生態研究所保藏。
按重量百分數計，指示菌培養基組成牛肉膏0.5％，蛋白腖1％，NaCl 0.5％，瓊脂2％，餘量為自來水。加熱溶解後，調pH7.0-7.2。裝入茄型瓶90mL，121℃溼熱滅菌20分鐘後，擺斜面備用。
指示菌培養37℃培養24hr，菌苔呈半透明至白色。
指示菌懸液的製備把100mL滅菌的生理鹽水倒入茄型瓶中，用接種環刮洗菌苔，再將刮洗液倒入滅菌的空錐瓶中，測定吸光度(O.D.值)為0.54-0.57。
二、瓊脂塊的製備與單菌落瓊脂塊培養按重量百分數計，瓊脂塊培養基組成cPA 0.3％，牛肉膏0.5％，蛋白腖1％，NaCl 0.5％，甘油3％，NaVO30.02％，CoCl20.05％，瓊脂1.8％，餘量為自來水，115℃滅菌30分鐘。
瓊脂塊的製備將上述培養基融化，於每個Φ90mm平皿倒入25mL，靜置凝固。凝固後，用打孔器打出瓊脂塊(Φ6×6mm)，然後在其表面接種待檢測菌株，置於30℃，75％～85％相對溼度下培養4-5天。
三、磷黴素轉化菌株的篩選生物檢定培養基及其平板的製備按重量百分數計，培養基I成分牛肉膏0.5％，蛋白腖1％，NaCl 0.5％，瓊脂2％，餘量為自來水，pH7.0-7.2；培養基II成分牛肉膏0.5％，蛋白腖1％，NaCl 0.5％，瓊脂1.5％，餘量為自來水，pH7.0-7.2；培養基I、培養基II均在121℃滅菌20分鐘。將200mL融化的培養基I倒入生物鑑定盤(20×30cm)，製成下層平板；再將100mL融化的培養基II冷卻至55℃，加入指示菌菌懸液1mL，迅速混勻後倒入生物鑑定盤，製成上層平板。
磷黴素轉化菌株生物鑑定將培養好的單菌落瓊脂塊置於紫外燈下(30W，40cm)滅菌20分鐘，再將瓊脂塊倒置於生物鑑定平板上，37℃培養16hr。觀察並測量抑菌圈直徑。依據抑菌圈的有無和抑菌圈直徑的大小來篩選具有磷黴素生物轉化能力的菌株。
實施例將本實驗室保存的210株細菌接種到瓊脂塊上，於30℃，75％相對溼度培養4天。將經過接種待檢測菌株並培養後的瓊脂塊紫外滅菌後，倒置貼於生物鑑定平板上。37℃培養16hr後觀察抑菌圈的有無和直徑大小，其中有12株細菌有明顯的抑菌圈。
同時作三組平行對照即1)不含有cPA的瓊脂塊對照，用以排除培養基中其它抑菌成分的幹擾；2)含有cPA的瓊脂塊對照，用以排除cPA底物的非生物的轉化幹擾；3)不含有cPA只接種菌株的瓊脂塊對照，用以排除菌株本身產生抑菌物質的幹擾。實驗結果表明三組對照都沒有在鑑定平板上產生抑菌圈。說明篩選出的菌株是通過轉化cPA為FOM而呈現抑菌圈的。
通過搖床發酵法對初篩的12個菌株復篩，培養基為cPA 0.3％，牛肉膏0.5％，蛋白腖1％，NaCl 0.5％，甘油3％，NaVO30.02％，CoCl20.02％，餘量為自來水，30℃，160rpm培養4天，通過抑菌圈直徑大小，進一步篩選出轉化效率較高的菌株。
利用薄層層析分析磷黴素，展開劑為正丁醇∶乙酸∶水(體積比3∶1∶1)。將展開後的層析板風乾，置於生物鑑定平板上，待浸潤後取下，37℃培養16hr。含有磷黴素部分產生抑菌圈。比較樣品與磷黴素標準品的Rf，樣品的Rf值為3.52；標準品的Rf值為3.53，驗證產生的抗生素為磷黴素。
權利要求
1.一種磷黴素生物轉化菌株的篩選方法，其特徵在於在含有順丙烯磷酸前體的瓊脂塊上接種待測菌株培養，然後將瓊脂塊倒置於生物鑑定盤上，檢測、篩選出具有轉化能力的菌株。
2.按照權利要求1所述的篩選方法，其特徵在於，瓊脂塊的製備與單菌落瓊脂塊培養包括1)瓊脂塊培養基組成按重量百分數計，瓊脂塊培養基組成為順丙烯磷酸0.3％，牛肉膏0.5％，蛋白腖1％，NaCl 0.5％，甘油3％，NaVO30.02％，CoCl20.05％，瓊脂1.8-2.0％，餘量為自來水，115℃滅菌30分鐘2)瓊脂塊的製備將上述培養基融化，倒入平皿，靜置凝固後，用打孔器打出瓊脂塊，然後在其表面接種待檢測菌株，置於30℃，75％-85％相對溼度下培養4-5天。
3.按照權利要求1所述的篩選方法，其特徵在於，磷黴素轉化菌株的篩選包括1)指示菌培養與懸液的配製按重量百分數計，指示菌培養基成分牛肉膏0.5％，蛋白腖1％，NaCl 0.5％，瓊脂2％，餘量為自來水，加熱溶解後，調pH 7.0-7.2，121℃溼熱滅菌20分鐘後，擺斜面備用；指示菌培養37℃培養24hr，菌苔呈半透明至白色；指示菌懸液的製備把滅菌的生理鹽水倒入茄型瓶中，用接種環刮洗菌苔，再將刮洗液倒入滅菌的生理鹽水中，測定吸光度為0.54-0.57；2)生物檢定培養基及其平板的製備按重量百分數計，培養基I成分牛肉膏0.5％，蛋白腖1％，NaCl 0.5％，瓊脂2.0％，餘量為自來水，pH 7.0-7.2；按重量百分數計，培養基II成分牛肉膏0.5％，蛋白腖1％，NaCl 0.5％，瓊脂1.5％，餘量為自來水，pH7.0-7.2；培養基I、培養基II均在121℃滅菌20分鐘；將融化的培養基I倒入生物鑑定盤，製成下層平板；再將融化的培養基II冷卻至55℃，加入指示菌菌懸液，迅速混勻後倒入生物鑑定盤，製成上層平板；3)磷黴素轉化菌株生物鑑定將培養好的單菌落瓊脂塊置於紫外燈下滅菌20分鐘，再將瓊脂塊倒置於生物鑑定平板上，37℃培養16hr，觀察並測量抑菌圈直徑；依據抑菌圈的有無和抑菌圈直徑的大小來篩選具有磷黴素生物轉化能力的菌株。
4.按照權利要求1或3所述的篩選方法，其特徵在於生物鑑定盤所用的指示菌為大腸桿菌或其它磷黴素敏感菌。
5.按照權利要求1所述的篩選方法，其特徵在於通過搖床發酵法對初篩的菌株復篩，培養基為順丙烯磷酸0.3％，牛肉膏0.5％，蛋白腖1％，NaCl 0.5％，甘油3％，NaVO30.02％，CoCl20.02％，餘量為自來水，30℃，160rpm培養4天，通過抑菌圈直徑大小，進一步篩選出轉化效率較高的菌株。
6.按照權利要求1或5所述的篩選方法，其特徵在於利用薄層層析分析磷黴素，展開劑為正丁醇、乙酸、水的體積比為3∶1∶1，將展開後的層析板風乾，置於生物鑑定平板上，待浸潤後取下，37℃培養16hr，含有磷黴素部分產生抑菌圈。
全文摘要
本發明涉及生物轉化/生物催化技術領域，具體為一種磷黴素生物轉化菌株的篩選方法。本發明利用圓柱狀固體培養基(瓊脂塊)培養待檢測菌株，利用大腸桿菌為生物鑑定的指示菌，將瓊脂塊倒置於生物鑑定盤上篩選磷黴素轉化菌株。根據在等體積並含有等量前體物的瓊脂塊上生長的待選菌株轉化能力不同，產生的磷黴素濃度不同，進而由磷黴素在指示菌平板上產生的抑菌圈大小也不同，最終篩選出磷黴素轉化優勢菌種。該方法的設備要求低，操作簡單，非常適用於抗生素生物轉化細菌的初級批量篩選。
文檔編號C12Q1/04GK1683553SQ200510045858
公開日2005年10月19日 申請日期2005年2月6日 優先權日2005年2月6日
發明者李智峰, 徐慧, 張雪姝, 張穎, 陳冠雄, 張忠澤, 王蘭君, 陳玉 申請人:中國科學院瀋陽應用生態研究所