用於去除所選擇dna序列的方法和手段的製作方法

2023-09-21 00:16:40

專利名稱：：用於去除所選擇dna序列的方法和手段的製作方法用於去除所選擇DNA序列的方法和手段發明領域本發明涉及在去除步驟期間不求助於體外(invitro)培養，允許高效去除事先已導入所述植物內的目的DNA序列中所選擇部分例如選擇標記基因或篩選標記基因的方法和手段。去除方法可以作為用於在植物細胞和植物中將靶DNA序列經同源重組精確交換為目的DNA序列的方法的一部分使用，由此隨後可以去除同源重組階段期間為臨時選擇基因替換事件所用的選擇標記或篩選標記，而不會留下痕跡並且在去除步驟期間不求助於體外培養。技術背景去除導入植物細胞或植物內，但在導入後隨即因多種原因變成無用或甚至是多餘的外源DNA中所選擇亞片段已經是熱點研究的主題。此類序列的實例例如是需要用於分離轉基因植物而在成熟植物內不再需要的選擇標記基因。實現高效消除選擇標記基因的方法主要依賴位點特異性重組或轉座(見例如Hohn等，PlantBioTechnology第139-143頁)。Siebert和Puchta(2002)描述可以通過同源重組和通過非同源末端連接從高等真核生物的基因組內高效地切除側翼為切點罕見限制酶位點的轉基因序列。WO03/004659涉及重組系統並涉及用於從真核生物的染色體DNA中去除核酸序列的方法。該文件還涉及含有所述系統或通過該方法產生的轉基因生物(優選地是植物)。然而該方法基本上需要利用體外培養方法來鑑定或選擇其中待去除美國專利申請2005/0060769提出從第一個轉基因玉米(Zeamays)植物細胞中製備重組的轉基因玉米植物或植物細胞的方法，其中相對於第一個轉基因植物細胞內的轉基因的遺傳結構，重組植物或植物細胞內的轉基因由於同源重組介導性轉基因缺失作用而具有改變的遺傳結構。在下文，包括在權利要求書內，描述如此方法和手段的不同實施方案，該方法和手段可不求助於體外培養方法，高效去除已事先導入植物細胞內的DNA分子的部分中所選擇的亞序列。WO97/30166或美國專利6,407,314描述可以用於在小孢子內表達基因的來自菸草的小孢子特異性基因的啟動子片段。由本發明解決的另一個問題涉及定向和精確地將植物細胞內的靶DNA序列通過同源重組交換成替換性DNA序列，而不留下方法的痕跡，並且在同源重組的初始步驟後不求助於體外培養方法。為此目的，可以方便地施用如此方法，即其可以經染色體內同源重組而高效地去除事先已插入基因組、優選地是植物細胞的核基因組內DNA分子的部分中所選擇亞序列。早已認識到需要對植物內轉基因整合的位點進行控制，並且已經開發數種方法試圖滿足這種需要(綜述見Kumar和Fladung，2001，TrendsinPlantScience,6，ppl55-159)。這些方法基本上依賴於以同源重組為基礎的轉基因整合，該策略已經成功地應用於原核生物和低等真核生物(見例如EP0317509或相應的出版物Paszkowski等，1988，EMBOJ"7，第4021-4026頁)。然而對於植物，用於轉基因整合的主導機制以很少涉及重組DNA鏈間同源性的異常重組為基礎。因而，此領域內的主要挑戰是檢測由所導入外源DNA經異常重組的極高效整合所掩蓋的稀有同源重組事件。解決此問題的一種方式是選擇通過異常重組發生的整合事件，如W094/17176內舉例。解決此問題的另一種方式是通過切點罕見內切核酸酶如I-Scel誘導雙鏈DNA斷裂而激活靼基因座。已經使用農桿菌(Agrobacteria)送遞修復性DNA至植物細胞證實這種l支術增加同源重組頻率至少2個數量級(Puchta等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,93，第5055-5060頁)。WO96/14408描述編碼I-Scel酶的分離的DNA。該DNA序列可以併入克隆栽體及表達載體、轉化的細胞系和轉基因動物。該栽體用於基因作圖和基因的位點定向性插入。WO00/46386描述通過I-Scel雙鏈斷裂而修飾、修復、減弱和失活細胞內的基因或其它染色體DNA的方法。還公開了治療或預防有需要的個體內遺傳疾病的方法。還公開了嵌合的限制性內切核酸酶。Chilton和Que(2003，PlantPhysiol.133:第956-965頁)和Tzifira等(2003，PlantPhysiol.133:第1011-1023頁)報導T-DNA偏好性地整合至由切點罕見酶I-Scel或I-Ceul人工誘導的雙鏈DNA斷裂內。該報導還包括包含相應切點罕見酶的識別位點的供體T-DNA載體。然而，現有技術內的方法常常依賴於通過同源重組重新形成或產生完整的選擇標記基因或篩選標記基因。因此，仍需要允許通過替換性DNA定向交換幾乎任何靶DNA序列的方法。這些問題和其它問題如下文所述在本發明不同的詳述實施方案內並在權利要求書內得到解決。發明筒述在本發明的一個實施方案中，描述了用於將目的DNA分子導入植物細胞或植物的基因組內，隨後去除目的DNA分子的亞序列(優選地包M擇標記或篩選標記)的方法，該方法包括步驟a.將目的DNA分子導入植物細胞的基因組，目的DNA分子包含側翼為同向重複排列的兩個DNA序列的DNA分子的亞序列並且還包含至少一個切點罕見雙鏈DNA斷裂誘導(DSBI)酶的識別位點，其中所述識別位點位於以同向重複排列的兩個DNA序列附近，優選地位於它們之間；b.選擇在其中目的DNA分子整合進入基因組內的植物細胞並從植物細胞再生植物；c.將此植物與包含編碼DSBI酶的嵌合基因的第二個植物雜交，其中所述嵌合基因包含如下有效連接的DNA區段i小孢子特異性啟動子片段，如選自核苷酸序列SEQIDNo.3的啟動子片段；iiDNA區域，其編碼識別所述識別位點的切點罕見雙鏈斷裂誘導酶，如選自I畫SceI、I誦ChuI、I誦DmoI、I誦CreI、I畫CsmI、PI曙FliI、Pt曙MtuI、I-Ceul、I-SceII、I國SceIII、HO、PI畫CivI、PI國CtrI、PI畫AaeI、PI-BSUI、PI-DhaI、PI畫DraI、PI-MavI、PI-MchI、PI誦MfuI、PI國MflI、PI畫MgaI、PI畫MgoI、PI畫MinI、PI畫MkaI、PI誦MleI、PI-MmaI、PI-MshI、PI國MsmI、PI-MthI、PI曙MtuI、PI誦MxeI、PI國NpuI、PI-PfuI、PI-RmaI、PI國SpbI、PI畫SspI、PI誦FacI、PI-MjaI、PI陽PhoI、Pi-TagI、PI-ThyI、PI-TkoI或PI-TspI的內切核酸酶或包含Zn指DNA結合結構域及DNA切割結構域的嵌合內切核酸酶；iii轉錄終止和聚腺苦酸化區域；d.選擇包含目的DNA分子和編碼DSBI酶的嵌合基因的後代植物(Fl植物)；e.將後代植物與另一植物雜交，由此使用後代植物作為花粉供體；f.選擇包含編碼DSBI酶的嵌合基因的後代植物的群體(F2群體)；和g.選擇在其中DNA分子的亞序列已經通過以同向重複排列的兩個DNA序列間的同源重組^皮缺失的後代植物，並且任選地h.將其中DNA分子的亞序列已經缺失的後代植物與另一植物雜交；和i.得到後代植物(F3植物)的群體並選擇不含編碼切點罕見的DSBI酶的嵌合基因的植物。在本發明的另一個實施方案中，提供用於將植物基因組、特別是植物的核基因組內的靶DNA序列交換為目的DNA序列的方法，該方法包含如下步驟a.在植物細胞基因組內預先選擇位點處誘導第一個雙鏈DNA斷裂，所述預先選擇位點位於靶DNA序列內或位於靶DNA序列附近；b.將目的DNA分子導入植物細胞，該DNA分子包含i.位於兩個側翼DNA區域之間的目的DNA序列，其中所述的側翼DNA區域與植物細胞基因組內靼DNA序列的側翼DNA區域並且優選預先選擇位點的側翼DNA區域具有至少80%序列同源性、優選100%序列同源性；ii.位於側翼DNA區域之間的選擇標記基因或篩選標記基因，該選擇標記基因或篩選標記基因還位於側翼DNA區域之一與以同向重複方式存在的部分側翼DNA區域之間，其中所述的部分側翼DNA區域包含側翼DNA區域之一的一部分；iii.位於側翼DNA區域之一與以同向重複方式存在的部分側翼DNA區域之間的DSBI酶的識別位點；c.選擇包含選擇標記或篩選標記的植物細胞的群體；d.選擇在其中目的DNA序列(和選擇標記或篩選標記)已經藉助側翼DNA區域通過同源重組導入的植物細胞，並從植物細胞再生植物；e.將包含選擇標記基因的再生植物或其後代植物與包含編碼切點罕見雙鏈斷裂誘導("DSBI")酶的嵌合基因的植物雜交，其中該嵌合基因包含如下有效連接的DNA區段i.小孢子特異性啟動子；ii.編碼識別位於目的DNA內的識別位點的雙鏈DNA斷裂誘導酶的DNA區域；iii.轉錄終止和聚腺苷酸化區域；f.選擇包^S^擇標記基因或篩選標記基因和編碼DSBI酶的嵌合基因的後代植物(F1植物)；g.將後代植物與另一植物雜交，由此使用後代植物作為花粉供體；h.選擇包含編碼DSBI酶的嵌合基因的後代植物的幹本(F2和i.選擇這樣的後代植物，在其中選擇標記基因或篩選標記基因通過側翼DNA區域之一與包含側翼DNA區域之一的一部分的部分側翼DNA區域間的同源重組4皮缺失。本發明涉及通過以上所述方法可得到的植物。在本發明的又另一個實施方案中，本發明涉及包含編碼切點罕見的DSBI酶的嵌合基因，如SEQIDNO6中從核苦酸1941至核苷酸3913的嵌合基因的植物，該嵌合基因包含如下有效連接的DNA區段i.小孢子特異性啟動子，如小孢子特異性啟動子片段，如選自SEQIDNo3的核苷酸序列的啟動子或其功能性片段；ii.DNA區域，其編碼識別位於目的DNA內的識別位點的雙鏈DNA斷裂誘導酶，如選自I-Scel、I-Chul、I-Dmol、I-Crel、I-Csml、PI誦FliI、Pt-Mtul、I畫CeuI、I-SceII、I-SceIII、HO、PI畫CivI、PI-CtrI、PI陽AaeI、PI-BSUI、PI-DhaI、PI-DraI、PI-MavI、PI國MchI、PI畫MfuI、PI國MflI、PI畫MgaI、PI-MgoI、PI隱MinI、PI畫MkaI、PI-MleI、PI-MmaI、PI-MshI、PI國MsmI、PI-MthI、PI-MtuI、PI隱MxeI、PI-NpuI、PI畫PfuI、PI國RmaI、PI畫SpbI、PI國SspI、PI曙FacI、PI-MjaI、PI-PhoI、PI國TagI、PI-ThyI、PI-TkoI或PI-TspI的內切核酸酶或包含Zn指DNA結合結構域及DNA切割結構域、特別是包含SEQIDNo1或SEQIDNo2的核苷#列的DNA區域的嵌合內切核酸酶；和iii.轉錄終止和聚腺苷酸化區域。本發明還涉及以上所述的嵌合基因。在本發明的另一個實施方案中，提供如此DNA載體，其藉助在耙序列內或其附近預先選擇位點處誘導雙鏈斷裂而將植物細胞基因組內的靶DNA序列交換為目的DNA序列，該DNA栽體包含a.位於兩個側翼DNA區域之間的目的DNA序列，其中所述的側翼DNA區域與耙DNA序列的側翼DNA區域和預先選擇位點的側翼DNA區域具有至少80%序列同源性、優選100%序列同源性；b.位於側翼DNA區域之間的選擇標記基因或篩選標記基因，該選擇標記基因或篩選標記基因還位於側翼DNA區域之一與以同向重複方式存在的包含側翼DNA區域之一的一部分的部分側翼DNA區域之間；和c.位於側翼DNA區域之一與以同向重複方式存在的部分側翼DNA區域之間的DSBI酶的識別位點。附圖簡述圖1至3代表用於去除導入或已經導入植物細胞內的目的DNA中所選擇亞部分的方法的不同實施方案。這些實施方案僅用於說明目的並且不應當用來以限制性方式解釋權利要求書。圖1是用於將具有所選擇亞部分的目的DNA導入植物細胞並隨後去除目的DNA中所選擇亞部分的方法的示意圖，其中所述的亞部分包含選擇標記基因或篩選標記基因特徵代表任何目的DNA序列；DSB:雙鏈斷裂謙導酶("DSBIE")的識別位點；SMG1:選擇標記基因或篩選標記基因；drs:同向重M列；SMG2:與編碼DSBIE的嵌合基因連接的選擇標記基因或篩選標記基因；MSP:小孢子特異性啟動子；3，轉錄終止和聚腺苷酸化信號；圖2是允許用替換性DNA序列精確替換靼DNA序列的方法的示意圖。DSBI:第一個雙鏈斷裂誘導酶的識別位點；FS1:側翼序列1;FS2:側翼序列2;DSB2:第二個雙鏈斷裂誘導酶的識別位點；SMG1:選擇標記基因1或篩選標記基因1;SMG2:選擇標記基因2或篩選標記基因2;DSBIE:雙鏈斷裂^秀導酶；drl:同向重複序列l(其與作為側翼序列2的一部分的同向重複序列2相似或相同；本文中也稱作"部分側翼DNA區域")；MSP:小孢子特異性啟動子；3，轉錄終止和聚腺苷酸化信號。圖3是與圖2內所示方法類似的允許用替換性DNA序列精確替換靶DNA序列的方法的示意圖。drl在此情況下是這樣的同向重複序列，其是來自側翼序列1的一部分並與同向重複序列2(dr2)相似或相同。發明的詳細實施方案本發明基於如此發現，即可以高效地去除側翼為兩個同向重複序列並位於切點罕見雙鏈DNA斷裂誘導酶的識別位點附近的DNA分子中所選擇序列，這在當包含此DNA的植物首先與包含處於小孢子特異性啟動子控制下的編碼切點罕見雙鏈DNA斷裂誘導酶的嵌合基因的植物雜交並將所得植物的花葯用來對受體植物授粉時實現。因此，本發明在一個實施方案內涉及包含處於小孢子特異性啟動子的控制下的、編碼切點罕見雙鏈DNA斷裂誘導內切核酸酶的嵌合基因的植物的用途，以便通過雜交去除位於切點罕見雙鏈DNA斷裂誘導內切核酸酶的識別位點附近並還位於以同向重複方向存在的兩個序列之間的DNA片段(見圖1)。切點罕見的DSBI內切核酸酶在花葯形成期間於小孢子內的表達足以誘導雙鏈DNA斷裂並因而顯著刺激同向重J^列間的染色體內同源重組，導致去除位於這些同向重複序列之間的序列。也就是說，在本發明的一個實施方案中，提供用於將目的DNA分子導入植物細胞或植物的基因組內，隨後去除該DNA分子的亞序列的方法，該方法包括步驟a.將此目的DNA分子導入植物細胞的基因組，此目的DNA分子包含側翼為同向重複排列的兩個DNA序列的該DNA分子的亞序列，並且還包含至少一個切點罕見雙鏈DNA斷裂誘導(DSBI)酶的識別位點，其中所述的識別位點位於以同向重複排列的兩個DNA序列之間；b.選擇在其中目的DNA分子整合i^基因組內的植物細胞並從植物細胞再生植物；c.將此植物與包含編碼DSBI酶的嵌合基因的第二個植物雜交，其中所述的嵌合基因包含如下有效連接的DNA區段i.小孢子特異性啟動子；ii.編碼識別所述識別位點的切點罕見雙鏈斷裂誘導酶的DNA區域；iii.轉錄終止和聚腺苷酸化區域；d.選擇包含目的DNA分子和編碼DSBI酶的嵌合基因的後代植物(Fl植物)；e.將後代植物與另一植物雜交，由此使用後代植物作為花粉供體；f.選擇包含編碼DSBI酶的嵌合基因的後代植物的群體(F2群體)；和g.選擇在其中目的DNA分子的亞序列已經通過以同向重複排列的兩個DNA序列間的同源重組被缺失的後代植物。如本文中所用，"切點罕見雙鏈DNA斷裂誘導內切核酸酶"是能夠在稱作"識別位點，，的特定核苷酸序列內誘導雙鏈DNA斷裂的酶。切點罕見內切核酸酶，有時又稱作大範圍核酸酶，具有14至40個連續核苷酸的識別位點。因此，切點罕見內切核酸酶具有非常低的切割頻率，即便在較大的植物基因組內亦如此。歸巢內切核酸酶構成此類切點罕見內切核酸酶的一個家族。它們可以由內含子、獨立基因或間插序列編碼，並展示出使之與通常來自細菌限制性^f務飾II型系統更常見的限制酶相區別的醒目結構特性和功能特性。它們的識別位點具有廣泛非對稱性，這與絕大多數限制酶識別位點的特徵性二重對稱相反。已經證實由內含子或內含肽編碼的數種歸巢內切核酸酶可促進它們各自的遺傳元件歸巢至無內含子或無內含肽的等位位點內。通#無內含子或無內含肽的等位基因內產生位點特異性雙鏈斷裂，這些核酸酶產生重組性末端，該重組末端參與了複製編碼序列並在DNA水平引起內含子或間插序列插入的基因轉變過程。充分得到表徵的歸巢內切核酸酶是I-Scel。I-Scel是釀酒酵母(Saccharomycescerevisea)內負責線粒體中內含子移動的位點特異性內切核酸酶。該酶由21SrRNA基因的任選內含子ScLSU.l編碼並在內含子插入位點處誘導雙鏈DNA斷裂，產生帶3，OH突出端的4bp交錯切口。I-SceI內切核酸酶的識別位點延伸超過18bp非對稱性序列(Colleaux等1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:6022-6026)。I-Scel的^J^餅列和與線粒體I-Scel基因等效的通用密碼子已經例如由WO96/14408提供。WO96/14408也公開了仍有功能的I-Scel蛋白的眾多變體。PCT申請PCT/EP04/013122(本文中引用作為參考)提供已經優化用於植物中表達的I-Scel的合成性核普酸序列變體。此合成性I-SceI編碼區的核苷酸序列以UIPAC密碼子描述於SEQIDNo1。UIPAC密碼子的符號具有它們的常用含義，即N-A或C或G或T;!^A或G;Y=C或T;B=C或G或T(非A);V=A或C或G(非T);D=A或G或T(非C);H-A或C或T(非G);K-G或T;M-A或C;S-G或C;W=A或T。其它切點罕見的DSBI酶及它們相應的識別位點的列表提供於WO03/004659的表1內(第17至第20頁)(本文中引用作為參考)。它們包括I-SceI、I-Chul、I-Dmol、I曙CreI、I-Csml、PI-FliI、Pt畫MtuI、I-Ceul、I畫SceII、I-SceIII、HO、PI-CivI、PI-CtrI、PI國AaeI、PI-BSUI、PI畫DhaI、PI-DraI、PI-MavI、PI-MchI、PI-MfuI、PI漏MflI、PI-MgaI、PI誦MgoI、PI-MinI、PI-MkaI、PI畫MleI、PI國MmaI、PI-MshI、PI-MsmI、PI-MthI、PI國MtuI、PI-MxeI、PI-NpuI、PI國PfuI、PI-RmaI、PI-SpbI、PI國SspI、PI-FacI、PI-MjaI、PI-PhoI、Pi-TagI、PI畫ThyI、PI畫TkoI或PI-TspI。此外，可獲得設計基本上識別任何所選擇耙核苷酸序列的客戶定製型切點罕見內切核酸酶的方法。筒而言之，嵌合性限制酶可以使用為識別特定核苷酸序列所^沒計的鋅指結構域與來自天然限制酶如Fokl的非特異性DNA切割結構域的雜合體加以製備。此類方法已經描述於WO03/080809、W094/18313或WO95/09233以及Isalan等，2001，NatureBiotechnology19，656-660;Liu等1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94，5525-5530內。通iWv變體的文庫中選擇而產生客戶定製型大範圍核酸酶的另一個途徑描述於WO2004/067736內。如本文中所用，"側翼為同向重複排列的兩個DNA序列"表示兩個DNA區域分別緊接在待從導入的DNA分子中去除的序列的每一端，其中所述的兩個DNA區域在核苷酸序列上基本上相似。同向重複序列不必完全相同，但是可以在約75%至約100%序列同一性之間變化。重複序列越短，對序列相似性的要求越嚴格。然而，為了恢復DNA序列而不留下痕跡，如下文中所述，以同向重複排列的DNA序列優選應當完全相同。為避免疑問，如果在核苷酸序列上基本上相似的兩個DNA區域包含於雙鏈DNA分子內，則這些DNA序列應當位於同一DNA鏈上，處於相同的5，—3，方向。重複的DNA序列可以是至少10個、50個或100個核苦酸長度，不過，序列當然可以更長。然而，已經發現長度超過300個核苷酸的重複序列不再顯著地增強導致位於同向重複序列之間DNA序列去除的染色體內同源重組。為本發明的目的，表述為百分數的兩個相關性核苷酸序列或氨基,列的"序列同一性"指在兩個優化比對序列內具有完全相同殘基的位置數除以所比較的位置數(x100)。將空位(即對比中一個殘基存在於一個序列內而不存在於另一序列的位置)視作不具有完全相同殘基的位置。兩個序列的對比通過Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch1970)開展。計算機輔助的序列對比可以使用標準軟體程序，如作為WisconsinPackageVersion10.1(GeneticsComputerGroup,Madison,Wisconsin,USA)部分的GAP,利用具有空位生成罰值50和空位延伸罰值3的默認計分矩陣方便地開展。雖然DSBI識別位點優選地位於同向重複的DNA序列之間，但是這既非重要，也非需要。實際上，DSBI識別位點還可能是重複DNA序列中一個序列的一部分。如本文中所用"位於附近"指DSBI的位置距離同向重複DNA序列在500bp、lkbp至10kbp之間。本文中所述的方法需要利用編碼切點罕見雙鏈斷裂誘導酶的嵌合基因，由此內切核酸酶的編碼區處在小孢子特異性啟動子片段的控制下。如本文中所用的"小孢子特異性啟動子區域"或"小孢子特異性啟動子"或"小孢子特異性啟動子片段"是能夠選擇性地、優選是特異性地在在被子植物中，有性繁殖需要產生有活力的雄性配子體和雌性配子體。作為雄性配子體的花粉在花葯內形成並^Jt孢細胞開始，發育成性母細胞。性母細胞發生減數分裂以形成單倍體細胞的四分體，四分體隨後釋放至花葯室。隨著擴張和空泡形成，小孢子的非對稱性有絲分裂產生含有營養細胞和生殖細胞的雙細胞性花粉。在大部分物種內，花葯在雙細胞條件下散發。在WO97/30166(本文中引用作為參考；還見SEQIDNo3)內描述了作為合適小孢子特異性啟動子區域的菸草NTM19基因啟動子區域。其功能性片段已經整合入實施例的嵌合基因(SEQIDNo6)內。小孢子特異性啟動子片段可以包括SEQIDNo3中從位置1至位置954或從位置1至位置993的核苷酸序列或SEQIDNo6中從位置1941至2926的核苷酸序列。如本文中所用"切點罕見雙鏈斷裂誘導內切核酸酶的編碼區"或"切點罕見雙鏈斷裂誘導酶的編碼區"是編碼特徵為切點罕見的DSBI酶，如列。編碼區因此可以包含編碼下表內所列歸巢內切核酸酶中任意Mi^f列的任意核苷酸序列，其中所述的歸巢內切核酸酶可以在提到的登錄號下於公共資料庫內找到(它們在本文中均引用作為參考)tableseeoriginaldocumentpage19tableseeoriginaldocumentpage20顯而易見，為了在小孢子特異性啟動子片段的控制下表達內切核酸酶，應當調整編碼區以侵使用通用密碼子語言編碼以上提到的多肽。編碼區還可以優化用於在植物內表達，並且合成性編碼區具有為滿足如下標準而設計的核苷酸序列a)核苷酸序列編碼有功能的切點罕見雙鏈斷裂誘導內切核酸酶，b)核苷酸序列具有約50%至約60%的GC含量，c)核苷酸序列不包含選自GATAAT、TATAAA、AATATA、AATATT、GATAAA、AATGAA、AATAAG、AATAAA、AATAAT、AACCAA、ATATAA、AATCAA、ATACTA、ATAAAA、ATGAAA、AAGCAT、ATTAAT、ATACAT、AAAATA、ATTAAA、AATTAA、AATACA和CATAAA的核苷i^列；d)核苷酸不包含選自CCAAT、ATTGG、GCAAT和ATTGC的核苷酸序列；e)核苷餅列不包含選自ATTTA、AAGGT、AGGTA、GGTA或GCAGG的序列；f)核苷酸序列不包含由選自G或C的7個連續核苷酸組成的GC段；g)核苷酸序列不包含由選自A或T的5個連續核苷酸組成的GC段；和h)核苷酸序列不包含如此密碼子，其編碼Leu、Ile、Val、Ser、Pro、Thr、Ala並在位置2和3內包含TA或CG雙體(即核苷^列不包含密碼子TTA、CTA、ATA、GTA、TCG、CCG、ACG和GCG)。雙鏈斷裂誘導酶可以包含，但不是必須包含，核定位信號(NLS)[Raikhel，PlantPhysiol.100:1627-1632(1992)及其中的參考文獻，如SV40大T抗原的NLS[Kalderon等Cell39:499-509(1984)。核定位信號可以位於蛋白質內任何地方，但是合適地位於蛋白質的氨基末端。核定位信號可以替換雙鏈斷裂誘導酶中的一個或多個胺基酸。雖然用於去除的方法在本文中描述為涉及導入目的DNA分子的活化步驟隨後去除所選擇亞片段，顯而易見的是本發明的去除方法可以用來去除位於DNA同向重複序列之間的任何序列，只要可以找到或設計出識別在重複DNA序列附近的DSBI識別位點的DSBI酶。還將顯而易見的是，用來描述本方法的術語如"DNA片段的導入"及"從細胞再生植物"不表示該DNA片段必定需要通過轉化技術而導入。實際上對於本領域4支術人員而言立刻明白目的DNA分子還可以通過育種或雜交技術從一種植物導入另一種植物內。然而，將顯而易見的是目的DNA分子可以通過本領域已知的任何方法導入植物細胞，包括農桿菌介導性轉化和DNA直接轉移方法。可以使用任何便利的方法將轉化性DNA分子轉移至植物細胞內，包括但不限於DNA直接轉移。如本文中所用"DNA直接轉移"是將DNA導入植物細胞的任何方法，該方法不涉及利用天然的農桿菌物種並能夠將DNA導入植物細胞。這包括本領域眾所周知的方法，如通過電穿孔法將DNA導入原生質體、通過電穿孔法將DNA導入完整的植物細胞或經部分降解的組織或植物細胞、通過試劑如PEG等的作用將DNA導入原生質體、利用珪晶須以及用包被DNA微粒轟擊。DNA可以通過如在例如PCT/EP04/013122內所述的涉及在預先選擇位點處導入雙鏈斷裂的同源重組或非同源末端連接的方法整合。在本發明的一個特定實施方案中，去除的方法可以與DNA通過定向同源重組而插入、缺失或替換組合地使用，並且在該方法中如此實現定向DNA插入，即使用選擇標記或篩選標記，隨後在包^^it擇標記或篩選標記的植物細胞或植物的群體內！Hi在其中定向DNA插入通過同源重組而發生的植物細胞或植物。當側翼序列和同向重複序列合適地進行選擇時，該方法引起把DNA精確替換成目的DNA，而不存在用來實現替換的目的DNA分子的任何殘留("痕跡")。去除的方法也不需要任何額外的體外培養，因而避免產生體細胞性變異。本方法的示意圖提綱可以在圖2和3內找到。有趣的是，已經觀察到使用如PCT/EP04/013122內所述的藉助同源重組定向插入外源目的DNA的方法，在其中外源DNA確實經同源重組插入的那些轉化事件代表了在其中DNA通過任何手段整合入植物染色體內的事件總群體中的相對高比例(在1%至5%的數量級上)。因此，不需務農賴產生可識別表型的DNA序列(如同源重組後產生的完整選擇標記基因)經同源重組的生成或再造，以鑑定DNA因而通過同源重組得以插入的那些事件。此外，選擇標記基因或篩選標記基因可以包含於側翼DNA序列之間的DNA區域內，隨後分析數目相對較少的轉化的植物細胞或植物，以鑑定在其中定向DNA插入經同源重組而發生的那些轉化事件。因此，在本發明的這個實施方案中，提供用於將植物細胞內的耙DNA序列交換成目的DNA序列(或外源DNA)的方法，該方法包含如下步驟-在細胞基因組內預先選擇位點處誘導第一個雙鏈DNA斷裂，所述預先選擇位點位於靶DNA序列內或位於該耙DNA序列的附近；-將目的DNA分子(或外源DNA)導入植物細胞，由此DNA分子包含如下有效連接的DNA片段i.位於兩個側翼DNA區域之間的目的DNA序列，其中所述的側翼DNA區域與靶DNA序列的側翼DNA區域和預先選擇位點的側翼DNA區域具有至少80%序列同源性、優選100%序列同源性；ii.位於側翼DNA區域之間的選擇標記基因或篩選標記基因，因而選擇標記基因或篩選標記基因還位於側翼DNA區域之一和以同向重複方式存在的所提及側翼DNA區域之一的至少部分的另一個拷貝(又標示為部分側翼序列)之間；iii.位於側翼DNA區域之一與以同向重複方式存在的部分側翼DNA區域之間的DSBI酶的識別位點；-選擇包含選擇標記或篩選標記的植物細胞的群體；-選擇在其中選擇標記或篩選標記已經藉助側翼DNA區域通過同源重組導入的植物細胞，並從植物細胞再生植物；-將包含選擇標記基因的再生植物或其後代植物與包含編碼DSBI酶的嵌合基因的植物雜交，其中該嵌合基因包含如下有效連接的DNA區段■小孢子特異性啟動子；■編碼識別位於目的DNA內的識別位點的雙鏈DNA斷裂誘導酶的DNA區域；■轉錄終止和聚腺苦酸化區域；-選擇包含選擇標記基因或篩選標記基因和編碼DSBI酶的嵌合基因的後4、植物(F1植物)；-將後代植物與另一植物雜交，由此使用後代植物作為花粉供體；-選擇包含編碼DSBI酶的嵌合基因的後代植物的群體(F2群體)；和-選擇所述F2群體內的後代植物，在所述後代植物中選擇標記基因或篩選標記基因通過側翼DNA區域之一與包含側翼DNA區域之一的一部分的部分側翼DNA區域間的同源重組被缺失。因此，如本文中所用"預先選擇位點"指示植物的核基因組內位於耙DNA序列內或附近的特定核普^f列，在該位置內需要插入外源DNA或將靶DNA序列交換。本領域技術人員將能夠選擇識別所選擇M苷i^列的雙鏈DNA斷裂誘導("DSBI")酶或設計此種DSBI內切核酸酶。或者，DSBI內切核酸酶識別位點可以使用任何常用的轉化方法導入或使用在其基因組內具有DSBI內切核酸酶識別位的植物系通過常規育種法導入，並且任何所需要的外源DNA可以隨後導入事先已導入的預先選則耙位點內。在轉化性DNA分子內的雙鏈DNA斷裂可以通過植物可表達的嵌合基因的瞬時導入而方便地誘導，其中所述的嵌合基因包含與編碼雙鏈斷裂誘導酶的DNA區域有效連接的植物可表達啟動子區域。編碼雙鏈斷裂誘導酶的DNA區域可以是合成性DNA區域，如(但不限於)這樣的合成性DNA區域，其中密碼子根據本申請內其它處所述的用於I-Scel編碼區設計方案而選擇。作為蛋白質，內切核酸酶本身還可以例如通過電穿孔法導入植物細胞。然而，內切核酸酶還可以通過將嵌合基因(包含與誘導型植物可表達啟動子有效連接的編碼內切核酸酶的DNA區域)導入植物細胞或植物的基因組，並在導入轉化性DNA分子之前、期間或之後立即提供合適的誘導化合物持續所限時間而以瞬時方式提供。內切核酸酶還可以作為編碼內切核酸酶的RNA前體提供。雙鏈斷裂誘導酶可以包含，但不必須包含，核定位信號(NLS)[Raikhel,PlantPhysiol.100:1627-1632(1992)及其中參考文獻]，如SV40大T抗原的NLSKalderon等Cell39:499-509(1984)。核定位信號可以位於蛋白質內任何地方，但是合適地位於蛋白質的氨基末端。核定位信號可以替換雙鏈斷裂誘導酶中的一個或多個胺基酸。如本文中所用，"靶DNA序列"是通過添加、缺失或置換而修飾的位於植物細胞基因組內的DNA序列。如本文中所用"側翼DNA區域"是分別與靶DNA序列上遊或下遊DNA區域具有同源性的DNA序列。這允許更好地控制外源DNA或目的DNA分子的插入。實際上，通過同源重組的整合將允許外源DNA片段與植物的核基因組在核苷酸水平上精確連接。側翼DNA區域可以在長度上變化，並且應當是至少約10個核苷酸長度。然而，側翼區域可以按照實際可能儘量地長(例如直至約100-150kb，如完整的細菌人工染色體(BAC))。優選地，側翼區域會是約50bp至約2000bp。此外，側翼為外源目的DNA的區域不需要與預先選擇位點的側翼DNA區域完全相同，並且可以與預先選擇位點的側翼DNA區域具有約80%至約100%之間的序列同一性，優選地約95%至約100%序列同一性。側翼區域越長，對同源性要求的嚴格性越低。此外，優選序列同一性在靠^確插入外源DNA的位置處按照實際可能儘量地高。此外，為實現交換靼DNA序列而不改變iB比鄰DNA序列的DNA序列，側翼DNA序列應當優選地與預先選擇位點側翼的DNA區域完全相同。此外，外源目的DNA側翼的區域不必與緊鄰預先選擇位點側翼的區域具有同源性，但是可以與距離預先選擇位點更遠的核基因組的DNA區域具有同源性。外源DNA的插入隨後將導致在預先所選擇插入位點和同源DNA區域之間的耙DNA的去除。也就是說，位於同源區域之間的靼DNA將置換成外源目的DNA。優選地，預先選擇位點和另外提及的識別序列由不同的切點罕見雙鏈斷裂誘導內切核酸酶識別。提及的"部分側翼DNA區域，，指鄰近待缺失且通常包含選擇標記或篩選標記的DNA區域的側翼DNA區域中至少部分的DNA區域。^艮明顯，部分側翼DNA序列也可以在長度上與側翼DNA序列相等或甚至包含更長的側翼DNA序列。"選擇標記或篩選標記"如本文中所用具有本領域的通常含義並包括，但不限於植物可表達的膦絲菌素乙醯轉移酶、新黴素磷酸轉移酶、草甘膦氧化酶、草甘膦耐受EPSP酶、腈水解酶基因、突變的乙醯乳酸合酶或乙醯羥酸合酶基因、/3-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、R-基因座基因、綠色螢光蛋白等。選擇在其中選擇標記或篩選標記和外源DNA分子的剩餘部分已經藉助側翼DNA區域通過同源重組得以導入的植物細胞或植物例如可以通過對如此序列的缺乏進行篩選而實現，其中所述序列存在於轉化性DNA內，但位於側翼DNA區域之外。實際上，來自轉化性DNA但位於側翼DNA區域之外的序列的存在表示著為來源於DNA隨機插入的轉化植物細胞。為此目的，選擇標記或篩選標記可以包含於側翼DNA區域之外的轉化性DNA分子內，轉化性DNA分子隨後可以用於鑑定不具有位於轉化性DNA之外的並且已經藉助側翼DNA區域通同源重組而產生的選擇標記或篩選標記的植物細胞。備選地，轉化性DNA分子可以含有允許對缺少此類基因(負選擇標記基因)進行選擇的、位於側翼DNA區域之外的選擇標記。在本發明的另一個實施方案中，本文中所述的DNA去除方法可以與如此方法組合，即該方法以非同源末端連接為基礎用於在細胞基因組內預先選擇位點處插入DNA。因此，本發明提供用於在基因組內、優選是植物細胞的核基因組內的預定位置處插入所選擇DNA分子的方法，該方法包括如下步驟國在細胞基因組內預先選擇位點處誘導第一個雙鏈DNA斷裂，所述預先選擇位點優選地位於耙DNA序列內；-將外源DNA分子導入植物細胞，因而該DNA分子包含如下有效連接的DNA片段o所選擇目的DNA分子；o在前面或後面具有重複DNA區域的選擇標記基因或篩選標記基因，其中所述的重複DNA區域與位置緊鄰預先選擇位點的基因組DNA區域之一具有至少80%的序列同一性，因而當外源DNA分子通過非同源末端連接在預先選擇位點內插入時，該DNA區域與其基因組拷貝以同向重複方式存在；o切點罕見的DSBI酶的識別位點，位於包含所述重複DNA區域和所述選擇標記基因的外源DNA區域內；-選擇包含選擇標記或篩選標記的植物細胞的群體；-選擇在其中選擇標記或篩選標記已經通過非同源末端連接在預先選擇位點處導入的植物細胞，並從植物細胞再生植物；-將包含選擇標記基因的再生植物或其後代植物與包含編碼DSBI酶的嵌合基因的植物雜交，其中該嵌合基因包含如下有效連接的DNA區段■小孢子特異性啟動子；■編碼識別位於目的DNA內的識別位點的雙鏈DNA斷裂誘導酶的DNA區域；■轉錄終止和聚腺苷酸化區域；-選擇包含選擇標記基因或篩選標記基因和編碼DSBI酶的嵌合基因的後代植物(F1植物)；-將後代植物與另一植物雜交，由此使用後代植物作為花粉供體；-選擇包含編碼DSBI酶的嵌合基因的後代植物的群體(F2群體)；和-選擇所述F2群體內的後代植物，在所述後代植物中選擇標記基因或篩選標記基因通過重複DNA區域和位置緊鄰預先選擇位點的基因組DNA區域間的同源重組朝C缺失。以上提及的方法可以方l更地用於打斷所選擇的任何DNA序列，例如多肽編碼區、編碼生物活性RNA的DNA序列、啟動子區域、調節區、蛋白質或RNA結合的識別位點等。在該實施方案中，在其中DNA分子已經通過非同源末端連接而插入的事件可以例如使用引物序列(識別位於預先選擇位點附近的基因組序列並且還優選地不識別識別外源DNA)和在外源DNA分子內的引物通過PCR反應方便地進行鑑定。在通過非同源末端連接在預先選擇位點處插入外源DNA時，DNA片段將擴增。當外源DNA隨機整合時，不會擴增此DNA片段。可以理解的是本發明的手段和方法可以用於能夠通過花粉繁殖的任何植物內，包括玉米、菸草、穀物植物包括小麥、燕麥、大麥、黑麥、稻、草坪草、高粱、穀子或甘蔗。本發明的方法還可以應用於任何植物(被子植物或棵子植物)，包括但不限於棉花、油菜、歐洲油菜、大豆、蔬菜、馬鈴薯、浮萍屬某些種(Lenmaspp.)、菸草屬某些種(Nicotianaspp.)、擬南芥(Arabidopsis)、紫花苜蓿、大麥、菜豆、玉米、棉花、亞麻、豌豆、芸莒、稻、黑麥、紅花、高粱、大豆、向日葵、菸草、小麥、聲夢、甜菜、西蘭花、甘藍、胡蘿蔔、花椰菜、芹菜、黃瓜、茄子、萵苣、洋蔥、歐洲油菜、胡椒、馬鈴薯、西葫蘆、蘿蔔、菠菜、南瓜、番茄、小胡瓜、扁桃、蘋果、杏、香蕉、黑莓、藍莓、可可、櫻桃、椰子、芟越橘、棗、葡萄、葡萄柚、番石榴、獼猴桃、檸檬、酸橙、芒果、甜瓜、油桃、桔、番木瓜、西番蓮、桃、花生、梨、菠蘿、阿月渾子、李、樹莓、草莓、橘、胡桃和西瓜。本發明的目的還是提供根據本發明方法所產生的植物細胞和植物。本發明的範圍還包括通過傳統育種方法產生的包含DNA插入事件的植物的配子、種子、胚、合子性或體細胞性後代或雜種。此類植物可以含有替代存在而與它們的祖先植物不同。通過本文中所述方法得到的植物可以通過常規育種技術與其它植物進一步雜交，以得到包含根據本發明所得到的定向DNA插入事件的後代植物。如下非限制性實施例描述使用處於小孢子特異性啟動子控制下表達的編碼雙鏈DNA斷裂誘導酶如I-SceI的嵌合基因從所導入DNA分子中去除所選擇亞片段。在實施例中除非另外說明，所有重組DNA技^艮據如在Sambrook等(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY和在Ausubel等(1994)CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocols,USA的第1和2巻內所述的標準方案開展。用於植物分子工作的標準材料和方法描述於BIOSScientificPublicationsLtd(UK)和BlackwellScientificPublications,UK聯合出版的R.D.D.Croy編的PlantMolecularBiologyLabfax(1993)內。對於標準分子生物學技術的其它參考文獻包括Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual,第三版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY、Brown(1998)MolecularBiologyLabFax，第二版,AcademicPress(UK)第I和II巻。用於聚合Sl^式反應的標準材料和方法可以在Dieffenbach和Dveksler(1995)PCRPrimer:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress並在McPherson等(2000)PCR國Basics:FromBackgroundtoBench,第一版，SpringerVerlag，Germany內找到。在說明書和實施例通篇範圍內，提到如下序列SEQIDNol:合成性I-Scel編碼區(UIPAC編碼)的核苷酸序列。SEQIDNo2:合成性I-Scel編碼區的核普酸序列。SQIDNo3:包括啟動子區域的小孢子選擇性NTM19基因的核苷酸序列。SEQIDNo4:pTCV63的T-DNA的核苷,列。SEQIDNo5:pTCV64的T-DNA的核香餅列。SEQIDNo6:pTCV72的T-DNA的核苷酸序列。實施例通過染色體內同源重組(IHR)去除選擇標記基因已經開發出檢測去除所選擇DNA片段的重組分析法，其基於在同向重複序列(egfp序列的一部分；約300bp或約600bp)間的染色體內同源重組(IHR)而去除選擇標記基因(hyg)(2000bp)後恢復e她-6af融合基因。重複序列之一的側翼具有I-Scel(和鋅指Zif268)識別位點，這有可能在重複序列間產生DSB。為了在一個世代轉移至另一個世代期間允許IHR,將I-Scel內切核酸酶置於小孢子特異性啟動子的控制下(pNTM19)。使用標準重組DNA技術，構建以下DNA分子用於如下的實驗1.pTCV63:具有含如下有效連接的DNA構建體的同向重複短序列(300bp):-p35S3:CaMV35S啟動子片段畫egf(短)eGFP編碼序列的第一個部分，包含與隨後名為GFP序列重疊的300bp-I-Scel內切核酸酶的識別位點-含Zn指Zif268的DNA結合蛋白的識別位點-pCsVMV:木薯葉脈花葉病毒啟動子片段畫hyg:潮黴素抗性編碼區-3，35S:3，轉錄終止和聚腺苷酸化信號-gfp(短)eGFP編碼序列的3，部分，包含該質粒的先前egf部分的300bp的同向重複序列，並且在其中編碼區翻譯性地與bar基因編碼區連接。-3'nos:來自胭脂氨酸合酶基因的3，轉錄終止和聚腺苷酸化信號。將該質粒導入才艮瘤農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)並且4吏用得到的菌林(A4330)來產生轉基因菸草植物(G7NT001)。2.pTCV64:具有含如下有效連接的DNA構建體的同向重複長序列(600bp):-p35S3:CaMV35S啟動子-egf(長)eGFP編碼序列的第一個部分，包含與隨後名為gfp序列重疊的600bp-I-Scel內切核酸酶的識別位點-含Zn指Zif268的DNA結合蛋白的識別位點-pCsVMV:木薯葉脈花葉病毒啟動子-hyg:潮黴素抗性編碼區-3，35S:3，轉錄終止和聚腺苷酸化信號-gfp(長)efgp編碼序列的3，部分，包含先前egf構建體的600bp的同向重複序列，並且在其中編碼區翻譯性地與bar基因編碼區連接。畫3，nos:來自胭脂氨酸合酶基因的3,轉錄終止和聚腺苷酸化信號。將該質粒導入根瘤農桿菌並且使用得到的菌林(A4364)來產生轉基因菸草植物(G7NT004)。3pTCV72:-pnos:胭脂氨酸合酶啟動子-neo:新黴素磷酸轉移酶II編碼區-3，ocs:來自章魚鹼合酶基因的3，轉錄終止和聚腺苷酸化信號；-pNTM19:小孢子特異性啟動子片段-I-Scel:內切核酸酶I-Scel的編碼區-3'nos:來自CaMV35S轉錄物的3，轉錄終止和聚腺苷酸化信號。將該質粒導入根瘤農桿菌並且使用得到的菌林(A4331)來產生轉基因菸草植物(G7NT005)。從G7NT001和G7NT004各自的三個獨立的單拷貝轉化菸草系中，使用G7NT005作為雄性植物開展與包含編碼I-Scel的嵌合基因的兩個獨立的單拷貝轉化系(G7NT005)雜交，其中所述的嵌合基因處於小孢子特異性啟動子控制下，因而後代系如下所示G7NT001國0001xG7NT005國0001>04TDNT000001G7NT001-0002xG7NT005-0001>04TDNT000002G7NT001國0003xG7NT005-0001>04TDNT000003G7NT001-0001xG7NT005-0002>04TDNT000004G7NT001-0002xG7NT005-0002〉04TDNT000005G7NT001-0003xG7NT005-0002>04TDNT000006G7NT004-0001xG7NT005-0001>04TDNT000007G7NT004-0002xG7NT005-0001>(無後代)G7NT004-0003xG7NT005-0001>04TDNT000012G7NT004-0001xG7NT005-0002〉04TDNT000008G7NT004-0002xG7NT005國0002>04TDNT000010G7NT004-0003xG7NT005隱0002>04TDNT000011從每一雜交中，將200粒種子播種在Km(200mg/L)培養基上、將200粒種子播種在Hyg(50mg/L)培養基上並且將200粒種子播種在Km(200mg/L)+Hyg(50mg/L)培養基上以檢驗轉基因的正常傳遞。對於大多數雜交而言存在相當正常的不同轉基因的轉移(注意對於某些雜交，遇到汙染問題和種子質量問題(見下表))tableseeoriginaldocumentpage32G7NT005-0002對於這12種雜交中的每一種，將少量KmK+HygK後代植物轉移運至溫室以作為WTSR1植物的授粉者使用。對於這些12種雜交，每次使用三林KmR+HygR植物作為根據如下方案的WTSR1授粉者SRlx04TDNT000001-001-002-003SRlx04TDNT000002國001-002-003SRlx04TDNT000003-001-002-003SRlx04TDNT000004畫001-002-003SR1x04TDNT000005畫001-002-003SRlx04TDNT000006掘-002-003SRlx04TDNT000007曙001-002-003SRlx04TDNT000012-001-002-003SRlx04TDNT000008-001-002-003SRlx04TDNT000010掘-002-003SR1x04TDNT00001l畫OOl-002-003從這些雜交的每一後代中(見下表)，將50粒種子播種在非選擇性基質上以測定萌發頻率，將50粒種子播種在卡那黴素基質上以測定NTM19-I-Scel基因的傳遞率並且將約4000粒種子播種在PPT基質上以測定從一個世代轉移至另一世代期間的IHR頻率。也呈現KmK的PPTR幼苗數決定著NTM19-IScel內切核酸酶所誘導的DSB是否影響從一個世代轉至另一世代期間的IHR頻率。對22個後代的後代分析結果匯總於表A、B和C內。NTM19-I-Scel對從一個世代轉移至另一世代期間的IHR頻率存在極強烈的影響，因為全部PPTK幼苗也呈Km^應當指出大部分的PPT"和GFPF幼苗沒有進一步發育成植物並且因GFP的毒性效應而死亡。表A:tableseeoriginaldocumentpage35表B:tableseeoriginaldocumentpage36*同時播種本表內提到的後代。由於漂白劑過度強烈的滅菌作用，存在不良的和不規則的萌發(對於大多數系<50%).**意味著PPTR和GFP1幼苗勤種子數低估至少因子2，因為大多數系的萌發頻率小於50%。200680011307.5轉溢也被29/3251;表C:tableseeoriginaldocumentpage37此外，全部PPTR和GFPF幼苗確實是潮黴素敏感的，這表明A膽基因的確已經通過在IHR基因座內的染色體間重組被去除。雜交HygR幼苗lt/對HygR篩選的PPTK和GFPF幼苗數tableseeoriginaldocumentpage38從18個後代群體的分離分析中，可以得出結論，NTM19-I-Scel對從一個世代轉移至另一世代期間的IHR頻率存在極強烈的影響，因為全部PP"幼苗也呈KmK。SR1(雌性)與04TDNT00000X-00Y間的雜交的後代通常將分離成25%僅具有NTM19-IScel內切核酸酶25%僅具有IHR構建體25%同時具有NTM19-I-Scel內切核酸酶+IHR構建體25%既沒有NTM19-I-Scel內切核酸酶，也沒有IHR構建體全部PPI^幼苗也呈Kn^的事實表明，全部IHR重組僅發生在含有處於NTM19小孢子特異性啟動子控制下的I-Scel內切核酸酶和IHR構建體的部分內。我們的結果表明，在最佳情況下多達11%的含有NTM19-IScel內切核酸酶+IHR構建體的小孢子已經發生了導致缺陷性e她-6flr融合基因恢復的染色體內同源重組(SR1x04TDNT000006-001)。由於在僅含有IHR構建體的部分中沒有得到產生功能性e她-^r基因的IHR重組，我們可以得出結論，即自發性IHR(在小孢子內缺乏定向DSB誘導情況下)沒有發生，或如果自發性IHR的確發生，則它沒有導致缺陷性e她-6w融合基因恢復。相反，小孢子內DSB誘導的IHR允許導致陷性eg分-6flr融合基因恢復的更精確的染色體內同源重組。序列分析顯示在通過小孢子內DSB誘導的IHR介導去除選擇標記後，沒有留下痕跡。權利要求1.用於將目的DNA分子導入植物細胞或植物的基因組內，隨後去除所述目的DNA分子的亞序列的方法，包括步驟a.將所述目的DNA分子導入所述植物細胞的基因組內，所述目的DNA分子包含側翼為同向重複排列的兩個DNA序列的所述DNA分子的所述亞序列並且還包含至少一個切點罕見雙鏈DNA斷裂誘導(DSBI)酶的識別位點，其中所述識別位點位於以同向重複排列的所述兩個DNA序列附近，優選地位於它們之間；b.選擇在其中所述目的DNA分子整合進入基因組內的植物細胞並從所述植物細胞再生植物；c.將所述植物與包含編碼DSBI酶的嵌合基因的第二個植物雜交，其中所述嵌合基因包含如下有效連接的DNA區段i.小孢子特異性啟動子；ii.編碼識別所述識別位點的雙鏈DNA斷裂誘導酶的DNA區域；iii.轉錄終止和聚腺苷酸化區域；d.選擇包含所述目的DNA分子和編碼DSBI酶的所述嵌合基因的後代植物(F1植物)；e.將所述後代植物與另一植物雜交，由此使用所述後代植物作為花粉供體；f.選擇包含編碼DSBI酶的所述嵌合基因的後代植物的群體(F2群體)；和g.選擇在其中所述DNA分子的亞序列已經通過以同向重複排列的所述兩個DNA序列間的同源重組被缺失的後代植物。2.權利要求l所述的方法，還包括步驟h.將在其中所述DNA分子的所述亞序列已經缺失的所述後代植物與另一植物雜交；和i.得到後代植物的群體(F3植物)並選擇不含有編碼切點罕見的DSBI酶的所述嵌合基因的植物。3.權利要求1或2所述的方法，其中所述目的DNA分子的所述亞序列包含選擇標記基因或篩選標記基因。4.權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述DSBI酶是選自I-SceI、I國ChuI、I-Dmol、I畫CreI、I誦CsmI、PI曙FliI、Pt畫MtuI、I-Ceul、I國SceII、I-SceIII、HO、PI誦CivI、PI畫CtrI、PI-AaeI、PI-BSUI、PI-DhaI、PI-DraI、PI-MavI、PI-MchI、PI-MfuI、PI-MflI、PI-MgaI、PI-MgoI、PI-MinI、PI-MkaI、PI-MleI、PI-MmaI、PI畫MshI、PI-MsmI、PI-MthI、PI-MtuI、PI-MxeI、PI-NpuI、PI-PfuI、PI-RmaI、PI-SpbI、PI-SspI、PI-FacI、PI-MjaI、PI-PhoI、PI-TagI、PI陽ThyI、PI畫TkoI或PI畫TspI的內切核酸酶或包含Zn指DNA結合結構域和DNA切割結構域的嵌合內切核酸酶。5.權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述的DSBI酶是I-SceI。6.權利要求1至5中任一項所述的方法，其中編碼所述雙鏈DNA斷裂誘導酶的所述DNA區域包含SEQIDNo1或SEQIDNo2的核普酸序列。7.權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述的小孢子特異性啟動子包含選自SEQIDNo3的核苷^列的啟動子片段或其功能性片段。8.權利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述目的DNA分子的所述亞序列側翼為所述DSBI酶的兩個識別位點。9.權利要求1至8中任一項所述的方法，其中編碼DSBI酶的所述嵌合基因包含SEQIDNo.6中從核苷酸1941至3913的核苷酸序列。10.用於將植物基因組內的靶DNA序列交換成目的DNA序列的方法，包括如下步驟a.在植物細胞基因組內預先選擇位點處誘導第一個雙鏈DNA斷裂，所述預先選擇位點位於所述靶DNA序列內或位於所述靼DNA序列附近；b.將目的DNA分子導入所述的植物細胞，所述的DNA分子包含i.位於兩個側翼DNA區域之間的所述目的DNA序列，其中所述的側翼DNA區域與所述植物細胞基因組內所述靶DNA序列的側翼DNA區域並且優選所述預先選擇位點的側翼DNA區域具有至少80%序列同源性；ii.位於所述側翼DNA區域之間的選擇標記基因或篩選標記基因，所述選擇標記基因或篩選標記基因還位於側翼DNA區域之一與以同向重複方式存在的至少部分的所述側翼DNA區域之一的另一拷貝之間，其中所述另一拷貝標示為部分側翼DNA序列；iii.位於側翼DNA區域之一與以同向重複方式存在的所述部分側翼DNA區域之間的DSBI酶的識別位點；c.選擇包含所述選擇標記或篩選標記的植物細胞的群體；d.選擇在其中所述選擇標記或篩選標記已經藉助所述側翼DNA區域通過同源重組而導入的植物細胞並從所述植物細胞再生植物；e.將包含所述選擇標記基因的所述再生植物或其後代植物與包含編碼DSBI酶的嵌合基因的植物雜交，所述嵌合基因包含如下有效連接的DNA區段iv.小孢子特異性啟動子；v.編石馬可識別位於所述目的DNA內的所述識別位點的雙鏈DNA斷裂i秀導酶的DNA區域；vi.轉錄終止和聚腺苷酸化區域；f.選擇包含所述選擇標記基因或篩選標記基因和編碼DSBI酶的所述嵌合基因的後代植物(F1植物)；g.將所述的後代植物與另一植物雜交，由此使用所述後代植物作為花粉供體；h.選擇包含編碼DSBI酶的所述嵌合基因的後代植物的群體(F2群體)；和i.選擇如此的後代植物，在所述後代植物中所述的選擇標記基因或篩選標記基因通過在所述側翼DNA區域之一與包含所述側翼DNA區域之一的一部分的部分側翼DNA區域之間的同源重組被缺失。11.權利要求10所述的方法，其中在所述預先選擇位點處的所述第一個雙鏈斷裂通過導入第一個DSBI酶誘導，所述的第一個DSBI酶不識別位於所述目的DNA內的DSBI酶的所述識別位點。12.權利要求11所述的方法，其中所述的第一個DSBI酶和識別位於所述目的DNA內的所述識別位點的所述DSBI酶是選自I-SceI、I-ChuI、I隱DmoI、I-CreI、I-CsmI、PI-FliI、Pt國MtuI、I畫CeuI、I國SceII、I畫SceIII、HO、PI-CivI、PI-CtrI、PI-AaeI、PI國BSUI、PI誦DhaI、PI國DraI、PI國MavI、PI畫MchI、PI-MfuI、PI畫MflI、PI-MgaI、PI-MgoI、PI-MinI、PI-MkaI、PI畫MleI、PI國MmaI、PI畫MshI、PI國MsmI、PI-MthI、PI-MtuI、PI-MxeI、PI-NpuI、PI-PfuI、PI畫RmaI、PI-SpbI、PI-SspI、PI-FacI、PI-MjaI、PI國PhoI、PI陽TagI、PI畫ThyI、PI國TkoI或PI-TspI的兩種不同DSBI酶或是包含Zn指DNA結合結構域和DNA切割結構域的嵌合內切核酸酶。13.權利要求10至12中任一項所述的方法，其中識別位於所述目的DNA內的DSBI酶的所述識別位點的所述DSBI酶是I-Scel。14.權利要求13所迷的方法，其中編碼所述雙鏈DNA斷裂誘導酶的所述DNA區域包含SEQIDNo1或SEQIDNo2的核苷斷列。15.權利要求10至14中任一項所述的方法，其中所述小孢子特異性啟動子包含選自SEQIDNo3的核苷酸序列的啟動子或其功能性片段。16.權利要求10至15中任一項所述的方法，其中編碼DSBI的所述嵌合基因包含SEQIDNo.6中從核苷酸1941至3913的核苷i^f列。17.植物，其通過權利要求1至9中任一項所述的方法可得到。18.植物，其通過權利要求10至16中任一項所述的方法可得到。19.包含編碼DSBI酶的嵌合基因的植物，所述嵌合基因包含如下有效連接的DNA區段i.小孢子特異性啟動子；ii.編碼可識別位於所述目的DNA內的所述識別位點的雙鏈DNA斷裂誘導酶的DNA區域；iii.轉錄終止和聚腺苷酸化區域。20.權利要求19所述植物，其中所述小孢子特異性啟動子包含選自SEQIDNo3的核苷,列的啟動子片段或其功能性片段。21.權利要求19所述植物，其中編碼所述雙鏈DNA斷裂誘導酶的所述DNA區域包含SEQIDNo1或SEQIDNo2的核苷酸序列。22.權利要求19所述植物，其中編碼DSBI酶的所述嵌合基因包含SEQIDNo.6中從核苷酸1941至3913的核苷酸序列。23.嵌合基因，其包含如下有效連接的DNA區段i.小孢子特異性啟動子；ii.編碼可識別位於所述目的DNA內的所述識別位點的雙鏈DNA斷裂誘導酶的DNA區域；和iii.轉錄終止和聚腺苷酸化區域。24.權利要求23所述嵌合基因，其中所述DNA區域編碼選自I-Scel、I-Chul、I-Dmol、I國CreI、I-Csml、PI-FliI、Pt畫MtuI、I-CeuI、I國SceII、I畫SceIII、HO、PI-CivI、PI-CtrI、PI-AaeI、PI-BSUI、PI-DhaI、PI國DraI、PI-MavI、PI-MchI、PI國MfuI、PI-MflI、PI畫MgaI、PI-MgoI、PI畫MinI、PI畫MkaI、PI-MleI、PI-MmaI、PI誦MshI、PI誦MsmI、PI畫MthI、PI-MtuI、PI-MxeI、PI-NpuI、PI國PfuI、PI國RmaI、PI-SpbI、PI-SspI、PI誦FacI、PI-MjaI、PI誦PhoI、Pi-TagI、PI-ThyI、PI畫TkoI或PI-TspI的雙鏈DNA斷裂誘導酶或包含Zn指DNA結合結構域和DNA切割結構域的嵌合內切核酸酶。25.權利要求23所述嵌合基因，包含SEQIDNo1或SEQIDNo2的核苷酸序列。26.權利要求23至25中任一項所述嵌合基因，其中所述小孢子特異性啟動子包含選自SEQIDNo3的核苷酸序列的啟動子片段或其功能性片段。27.用於通過在所述靶序列內或在其附近的預先選擇位點處誘導雙鏈斷裂而將植物細胞基因組內的靶DNA序列替換成目的DNA序列的DNA栽體，所述DNA載體包含a.位於兩個側翼DNA區域之間的所述目的DNA序列，其中所述的側翼DNA區域與所述耙DNA序列的側翼DNA區域和所述預先選擇位點的側翼DNA區域具有至少80%序列同源性；b.位於所述側翼DNA區域之間的選擇標記基因或篩選標記基因，所述選擇標記基因或篩選標記基因還位於側翼DNA區域之一與以同向重複方式存在的包含所述側翼DNA區域之一的一部分的部分側翼DNA區域之間；和c.位於所述側翼DNA區域之一與以同向重複方式存在的所述部分側翼DNA區域之間的DSBI酶的識別位點。全文摘要本發明描述用於使用處於小孢子特異性啟動子控制下表達切點罕見雙鏈斷裂誘導DNA內切核酸酶通過在兩個同向重複DNA序列間的染色體內重組而從DNA分子內精確去除所選擇亞片段的方法。本方法可以應用於用來將植物細胞和植物內的靶DNA片段精確交換成目的DNA片段的方法內。文檔編號C12N15/82GK101155921SQ200680011307公開日2008年4月2日申請日期2006年3月31日優先權日2005年4月4日發明者K·達倫,R·魯伊特申請人:拜爾生物科學公司