鈷胺素的分析方法和試劑盒的製作方法

2023-09-21 00:10:50

專利名稱：鈷胺素的分析方法和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及測定體液中鈷胺素或維生素B12的分析方法，具體地說是分析鈷胺素代謝活性庫的分析方法。
背景技術：
鈷胺素或維生素B12是一種水溶性維生素，是食物中維生素B複合物的一部分。其核心分子由環繞基礎鈷原子的四個吡咯(pyrole)單元的咕啉環構成。鈷胺素是唯一一種動物或植物不能合成的微生物，必須在腸道中從食物吸收。其可存儲在肝中。它由微生物尤其是厭氧細菌和酵母菌合成。
鈷胺素在體內有輔酶的功能，鈷胺素酶催化三種類型的反應(i)分子內的重排，例如從L-甲基丙二酸單醯輔酶A形成琥珀醯輔酶A；(ii)甲基化，例如通過甲基化高半胱氨酸形成甲硫氨酸和(iii)在一些微生物中將核糖核苷酸還原成脫氧核糖核苷酸。在哺乳動物中，已知只有兩種酶促反應，就是上述(i)和(ii)中提到的，需要鈷胺素作為輔酶。
在消化過程中，一種稱為結合咕啉的唾液蛋白(在本領域中也稱為R-結合劑或轉運鈷胺素蛋白I和II)，下文稱為HC，在上消化道結合鈷胺素形成可經過胃的複合物。在迴腸中胰酶消化鈷胺素-結合咕啉(holo-HC)複合物，釋放出的鈷胺素隨後與稱為內因子的蛋白(由胃黏膜分泌)結合，形成另一複合物。在迴腸末端壁中鈷胺素一內因子複合物與特異性受體結合，其後被一釋放因子分離，鈷胺素被主動傳送通過迴腸膜，進入血流。
在身體中鈷胺素不以顯著量的游離形式循環。約99％左右的鈷胺素結合於一種轉運鈷胺素蛋白(TC-III)或白蛋白。
據信將鈷胺素送遞給靶組織的蛋白是運鈷胺素蛋白II(TC II)，一種關鍵的痕量蛋白，沒有它鈷胺素就不能穿透細胞膜。除了這種重要代謝功能外，血流中只有6-25％的鈷胺素結合於TC II，大部分鈷胺素是由HC運輸的。TC II是一種45kDa的單鏈多肽，主要見於血清、精液和腦脊髓流。結合於TC II或holo-TC II的鈷胺素附著於細胞膜上的特異性受體，而且一旦結合holo-TC II複合物就由胞飲作用進入細胞。
TC II由肝、脈管內皮、腸細胞、巨噬細胞和成纖維細胞合成，主要以apo-TCII(即不結合鈷胺素)循環。其半衰期很短，約90分鐘。
總血漿鈷胺素中至多1/4與TC II結合。其餘的與上述其它運鈷胺素蛋白或白蛋白結合。
由於鈷胺素必須從食物中攝取，任何導致胃功能損傷的病症，例如胃腸炎或導致胃萎縮的病症，或不能產生結合咕啉、內因子、釋放因子、TC II或TC II受體，都可能導致鈷胺素攝取受損和缺乏。
某些人群，如老人、孕婦、患慢性或急性胃腸炎患者、某些自身免疫疾病患者、有惡性貧血家族史的人和AIDS患者特別容易缺乏鈷胺素。
鈷胺素不足的臨床表現多種多樣，但主要包括貧血、巨成紅細胞血症和神經系統功能結構紊亂。約60％診斷為鈷胺素不足的人有貧血，但大部分觀察到的臨床信號只有神經症狀。約10％患者有精神病症狀，約40％患者有神經和精神症狀。
早期診斷出鈷胺素不足對確保患者良好預後非常重要，因為鈷胺素缺乏的一些表現(尤其是神經精神作用)是不可逆的(若沒有檢測到)，且用鈷胺素治療能很快減輕。
因此需要一種便利、有效的方法來精確地評估個體鈷胺素水平，以確定個體是否患有鈷胺素不足。
已用總血漿鈷胺素(即與運鈷胺素(TC)蛋白I、II和III任一結合的鈷胺素及其類似物)的測定來評估鈷胺素的不足。這種方法得到一寬的基礎濃度分布(被視為在人群中是正常的)，從而產生較寬的參考範圍。然而在個體中，認為鈷胺素的個體正常範圍是非常窄的。已觀察到，雖然當個體有代謝活性的鈷胺素濃度超出其自身正常範圍時，它們的總血漿鈷胺素含量依舊認為在人群的正常範圍中。這種情況下，就不能檢測出鈷胺素的不足。顯然這種不可靠的方法是不理想的，且認為這種血清或血漿分析方法的診斷靈敏性和特異性均很低。
已開發和使用了依賴於鈷胺素生長的微生物的微生物分析方法，來測定血漿鈷胺素濃度，但除了確定恰當參考範圍有困難外，這些方法需要提取和轉化鈷胺素，這既耗時麻煩又不適於快速實驗室篩選。
其它鈷胺素不足的分析方法包括測定血漿中需要鈷胺素進行轉變的代謝物的累積。在鈷胺素不足個體的血漿中丙二酸二甲酯和血漿高半胱氨酸的水平升高(Chanarin，巨成紅細胞貧血(The megaloblastic anaemia)；London，Blackwell ScientificPublications，1991)，而且使與維生素B12相關的良性候選分子不足。已表明基於高半胱氨酸評估的方法是複雜而不實用的，而且精確性和靈敏性也很差。而基於丙二酸二甲酯測定的方法是精確而可靠的，但非常笨重而且還需要結合氣相層析/質譜分析的分析手段，因此價格昂貴也不適於常規的臨床篩選(Nexo等人(1994)Seand.J.Clin.Lab.Invest.5461-76)。
已有人建議用TC II結合的鈷胺素測定來替代血漿總鈷胺素測定，其能提供鈷胺素不足可能性的可靠臨床指示(Herbert等人，(1990)Am.J.Hematol.34132-139；Wickramasinghe和Fida(1993)J.Clin.Pathol.46537-539；美國專利4680273)。然而這種測定holo-TC II濃度的方法必須計算，不是直接得到的(計算血漿總鈷胺素與TC II去除後血漿鈷胺素濃度之間的差異，評估holo-TC II濃度)。
可用硫酸銨(Carmel(1974)Am.J.Clin.Pathol.62367-372)、微矽(microsilica)(Herzlich Hubert(1988)Lab.Invest.58332-337；Wickramasinghe Fida(1993)J.Clin.Pathol.46537-539)、微型細玻璃(Vu等人(1993)Am.J.Hematol.42202-211)或固定的抗TC II多克隆抗體(Lindemans等人(1983)Clin.Chim.Acta 13253-61)吸收來去除這種TC II。總血漿和去除部分中鈷胺素的濃度可用本領域熟知的方法來測定，如放射和酶免疫分析方法。由於這些方法複雜而費時，它們不適於自動化或非自動化常規篩選，而且還因為所用吸收材料的特異性程度低，導致不能充分分離holo-TC II和holo-HC，造成對holo-TC II評估過高。吸附材料批與批之間的差異也將引入其它誤差，最重要的是從一大容積減去另一大容積會導致不能接受的不精確性和不可靠性。
另一評估TC II的方法涉及利用其親油性將TC II與其它血清成分(包括TC I和TC III)分離。因此Kapel等人(1988)Clin.Chim.Acta 172297-310，Benhayoun等人(1988)Acta Haematol.89195-199和Toft等人(1994)Scand.J.Clin.Lab.Invest.5462分別公開了用肝素瓊脂糖、矽膠或纖維素將TC II與其它運鈷胺素蛋白分離的方法。然而由於它們依靠相同的吸附材料，這些方法也與間接方法有相同的缺點。而且由於holo-TC II的低血漿濃度，使這些方法不適合於與已有的鈷胺素定量方法聯合。holo-TC II的正常範圍為35-160pM，低於35pM的測定值通常被認為表明鈷胺素不足。大部分血漿鈷胺素常規方法報導的分析靈敏度約為40pM，但實際上常常高得多，典型地約為90pM。因此，血漿holo-TC II的正常水平低於或接近鈷胺素定量常規方法的靈敏度界限。
當前認可的可能是最精確的測定TC II結合鈷胺素的方法，包括用矽吸附TCII，然後用免疫分析方法(Kuemmerle等人(1992)Clin.Chem.38/102073-2077)或用微生物分析方法(後者能明顯產生最好的結果)分析結合組分中鈷胺素的含量。這種方法要求在整個工作日中僅進行20次分析。這種方法非常昂貴且不實際，也不太適用於常規臨床診斷實驗室的研究。
因此迫切需要改進測定體液中有代謝活性的鈷胺素水平的方法，鑑於鈷胺素不足的可能性與鈷胺素水平相關，該方法應能適用於常規臨床診斷應用。

發明內容
所以，本發明第一方面提供了一種用於測定體液的無細胞樣品中結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II的分析方法，包括使體液的無細胞樣品與選擇性結合於脫輔基形式的運鈷胺素蛋白II和結合咕啉的固定化鈷胺素或其相似物或片段接觸，從而將運鈷胺素蛋白II的脫輔基形式和結合咕啉與結合鈷胺素的形式分開，或抑制運鈷胺素蛋白II或結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II的特異性結合配體隨後識別運鈷胺素蛋白II的脫輔基形式和結合咕啉，隨後使所述的樣品與固定的或可固定的運鈷胺素蛋白II或結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II運鈷胺素蛋白接觸，將結合配體的組分與未結合配體的組分分開，和測定其中的結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II的含量。在該方面的一個實施例中，進行了所述的配體結合組分與所述的配體未結合組分的分離，從而至少使結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II的濃度增加3倍。
在該方面的一個實施例中，該分析能測定濃度低至9pM的結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II。
在該方面的一個實施例中，特異性結合配體選自多克隆或單克隆抗體、抗體片段、多肽、寡肽、小有機化學物、DNA或RNA的特異性結合序列、或細胞表面受體。
在該方面的一個實施例中，這些特異性結合配體表現出對運鈷胺素蛋白II的高度選擇性和特異性，並表現出對其它脫輔基或結合鈷胺素的形式的運鈷胺素蛋白質或其它結合鈷胺素的蛋白質的低親和性。
在該方面的一個實施例中，通過改變溫度或pH，使所述的鈷胺素從結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II分子中釋放出來。優選釋放出的鈷胺素的測定，是通過競爭性免疫分析方法進行的，將樣品中分離出的鈷胺素與固定於某一支持物的鈷胺素配體相結合，並加入帶標記的鈷胺素，所述帶標記的鈷胺素與分離出的鈷胺素競爭性結合於所述的固定化的鈷胺素配體上。
在該方面的一個實施例中，分析方法還包括將其上固定有運鈷胺素蛋白II或結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II結合配體的固相支持物，與待研究的樣品和非固定的配體接觸；
其中所述的固定化配體能結合於運鈷胺素蛋白II或結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II、所述的非固定化配體或所述運鈷胺素蛋白II或結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II與非固定化配體的複合物；以及所述的非固定化配體能結合於至少一種所述的固定化配體、運鈷胺素蛋白II或結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II和所述的固定化配體與運鈷胺素蛋白II或結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II的複合物；其中如果所述的分析方法是夾心分析的話，至少一種所述的配體對結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II是特異性的，如果所述的分析是競爭分析，則所述的固定化配體對結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II和其競爭者是特異性的；被運鈷胺素蛋白II或結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II、所述的非固定化配體、或所述的非固定化配體與運鈷胺素蛋白II或結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II的複合物結合的所述的固定化配體的比例，取決於所述樣品中存在的結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II的量；和當結合或未結合時，所述的非固定化配體能產生可直接或間接檢測的信號；將結合的組分與未結合的組分分開；和直接或間接測定結合於固定化配體的非固定化配體，即結合組分，或未結合於固定化配體並在溶液中的非固定化配體，即未結合組分；其中可分開、同時或順序進行樣品和所述的非固定化配體與固相支持物的接觸，而且如果是分開或順序進行的，它們可以任何順序接觸。
在該方面的一個實施例中，運鈷胺素蛋白II結合配體的親和性常數至少為109M-1，優選大於1011M-1。
在該方面的一個實施例中，結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II或運鈷胺素蛋白II結合配體與咕啉的交叉反應性程度在0.1％和1％之間。
在該方面的另一個實施例中，結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II或運鈷胺素蛋白II結合配體與咕啉的交叉反應性程度小於0.1％。
在該方面的一個實施例中，使含結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II複合物的樣品與固相接觸，該固相上結合有帶標記的配體，該配體能夠識別固定化配體與結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II相結合位點；所述樣品中的結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II與所述帶標記的配體競爭性結合所述的結合位點，從而在該系統平衡後，從所述的固相支持物置換出的帶標記的配體的量和溶液中可檢測的帶標記的配體的量以及初始樣品中存在的結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II的量之間存在直接的比例關係；通過測定結合於或未結合於所述固相支持物的帶標記的配體的量，來直接或間接檢測帶標記的配體。
在該方面的一個實施例中，結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II含量的測定是通過使含結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II的樣品與其上固定有結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II的固相支持物和帶標記的、非固定化結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II特異性結合物接觸，樣品中游離的結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II和固定化結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II競爭結合於帶標記的非固定化配體；和測定結合於固相和殘留在溶液中的帶標記的配體，從而確定結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II的濃度。
在該方面的一個實施例中，結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II含量的測定是通過使含結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II的樣品與帶標記的結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II和固定化配體接觸，所述的帶標記的和不帶標記的結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II複合物競爭結合於固定化配體，達到平衡後，結合於固定化配體的帶標記的結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II的量與樣品中結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II量呈比例關係。
在該方面的分析方法中，體液的無細胞樣品選自精液、腦脊液、羊膜水或從血液衍生的樣品。
在該方面的一個實施例中，從血液衍生的樣品是血清或血漿。
在該方面的一個實施例中，結合組分通過沉澱、離心、過濾或層析方法，與所述的未結合組分分開。
在該方面的一個實施例中，可檢測配體標記有可用發光、化學發光、比色法、螢光、放射活性或酶活性測定的信號標記。
在該方面的一個實施例中，分析校準是用結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II標準品進行的。這些標準品是人、天然或重組體結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II。
本發明的第二個方面是一種用於上述分析方法的試劑盒，包括選擇性結合於脫輔基形式運鈷胺素蛋白II和結合咕啉的固定的鈷胺素或其相似物或片段；固定的或可固定的運鈷胺素蛋白II或結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II的特異性結合配體。
在該方面的一個實施例中，該試劑盒還包括結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II溶液。
在該方面的另一個實施例中，該試劑盒還含有用於使結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II釋放鈷胺素的pH調節劑。
在該方面的還有一個實施例中，該試劑盒還含有運鈷胺素蛋白II或結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II的標記過的特異性結合配體，其中所述標記過的配體可用發光、化學發光、比色法、螢光、放射活性或酶活性檢測。
本發明的第三個方面是結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II的用途，用預定濃度的結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II，在本發明第一方面的分析方法中，作為體液的無細胞樣品中鈷胺素結合的運鈷胺素蛋白II分析的校準劑。
特異性結合配體指一種憑藉其特異性化學結構或構象(而不是簡單地憑藉一般的物理-化學特性，如親油性，其可能對體液樣品中的許多成分是共同的)結合於TC II(即apo-TC II和holo-TC II)或holo TC II的配體。適用於本方法的配體的結合親和性或特異性宜使樣品中TC II或holo-TC II濃縮3倍，較佳的是5倍，更佳的是10倍，最佳的是大於10倍，因此這種方法在holo-TC II低於正常範圍以及在亞正常範圍時，能提供精確的和可靠的holo-TC II值。這種靶分子的分離和濃縮在現有方法(不能從HC或holo-HC中有效分離TC II或holo-TC)中是不可能辦到的。若能將TC II或holo-TC II濃縮至少3倍使得在進行分析時可用自動化分析裝置。若無這種濃縮步驟，樣品中存在的分析物的濃度可能低於檢測下限。這些自動分析裝置操作時通常要求150μl或以上總容積中樣品為40-100μl。因此，分析時低濃度的分析物甚至會被進一步稀釋。然而用本發明的分析方法，可將分析物至少濃縮3倍。通常用這種自動分析裝置的控制範圍為100-700pM，靈敏度的下限約為40pM，但實際下限約為90pM，5倍濃縮有利於測定低至18pM的holo-TC II，而10倍濃縮有利於測定低至9pM的holo-TC II。由於本發明有利於10倍以上的濃縮，技術人員易於理解靈敏度程度的提高使這種方法成為一種非常有效的技術。
濃縮分析物的能力使得可用這些自動化步驟進行分析，這是本發明分析方法的一個重要優點。
濃縮宜從600μl體液樣品開始，得到150μl、較佳的是得到100μl、更佳的是得到60μl以下用於分析(可任選地用自動步驟)的體積。
可在本發明的方法中採用任何TC II特異性結合配體，作為捕獲、濃縮和分離配體或檢測配體，並按本發明具體實施例可以脫輔基和holo兩種形式結合於TCII，或可將其特異地或擇優地結合於holo形式。TC II結合配體較佳地將表現出對TC II的高度選擇性和特異性，並且對其它TC蛋白質(即脫輔基或holo形式的TCI或III)或任何其它鈷胺素結合蛋白表現低親和性或較佳地基本無親和性。如果TC II結合配體是holo-TC II特異性結合配體，將表現出相同的特性，而且其它要求為對脫輔基TC II的低親和性或較佳地基本無親和性。
TC II或holo-TC II結合配體通常分別為對TC II或holo-TC II有親和性的其它結合配體可以是DNA或RNA的特異性結合序列。
如果結合配體是抗體，其可以是多克隆的，但較佳的是單克隆的。可產生比多克隆抗體具有更大親和性和均一性的單克隆抗體，從而降低了與體液中其它成分(尤其是其它運鈷胺素蛋白和其它適合的構象，即靶分析物的脫輔基形式)的交叉反應性。單克隆抗體提供較多克隆抗體更好的均一性和再現性，確保了更好的精確度，這對分析如此低濃度的分析物而言是非常重要的。另外，也可以是例如F(ab)、F(ab′)2或F(v)片段等抗體片段。抗體或抗體片段可以是單價或二價的，可通過雜交瘤技術產生或是合成來源，用重組DNA技術或化學合成生成。可用例如單鏈抗體或其它抗體衍生物或模擬物。抗體可針對合適的TC II或holo-TC II蛋白的任一表位、組分或結構。
Quadros等人(1996)Biochem.Biophys.Res.Commun.222149-154M Lean等人(1997)Blood 89(1)235-242中公開了可用於本發明結合配體的適合抗體。
可類似地採用能結合TC II脫輔基和holo形式或擇優地或特異性結合holo-TC II形式的受體分子。適合的受體是細胞表面或膜結合TC II或holo-TC II受體，種交叉反應性指這些受體分子來自任何種類哺乳動物，但這些受體來源較佳的是人或牛。雖然較佳的是以相對純化形式分離的受體分子，也可考慮採用濃縮形式的含受體的細胞膜或混合的膜組分。這些受體或含受體的膜或膜組分較佳地可從腎、胎盤或腫瘤細胞分離獲得。沉澱細胞通常不能作為受體的來源。但沉澱細胞可作為結合咕啉的受體來源。
如Seligman等人，J.Biol Chem 2531766-1772(1978)和Nexo等人，BiochemBiophys Act 628190-200(1980)所述，可得到富含TC-II受體的膜組分。通常將組織(如人胎盤或兔肝)切成小片，在三羥甲基氨基甲烷緩衝液(pH7.4，含0.15MNaCl和10mM EDTA)中勻漿化，隨後25,000×g離心30分鐘。為除去殘留的血液，至少重複一次勻漿化/離心。進一步用去汙劑(如Ammonyx-LO、Triton X-100或Chapso)提取這種膜組分，4℃100,000×g離心30分鐘澄清。將上清液作為TC-II受體的來源。
適合的擇優結合holo-TC II複合物的受體分子的例子是62kDa單鏈糖蛋白，其作為非共價同型二聚體存在，見於所有組織的細胞膜上(Rothenberg Quadros(1996)Balliere′s Clinical Haematology 8(3)499-514；WO 96/085150)。另一個適用於本發明分析方法的蛋白質是gp300，它是一種600kDa介導胞吞作用的膜蛋白，在吸收性上皮細胞中表達，如Moestmp等人(1996)Proceedings National AcademyScience 938612-8617中所公開和描述的腎近端小管細胞。這種受體是LDL受體，能結合脫輔基和holo兩種形式的TC II。
當用細胞表面受體時，可通過偶聯將其固定在一表面，如玻珠或薄板，或可將含受體的細胞膜組分製成能發揮受體作用的小泡或薄板。
當配體被固定時，例如在固體的表面，如濾膜或薄板的表面或管腔內，但特別優選的是固定在微粒上，如微球上(例如Dyno Industrier ASA，Norway生產的)。這些微粒是多孔的或無孔的，而且如果需要可以，例如通過用磁性反應性材料(如超順磁性氧化鐵晶體)收集這些微粒。這些磁性反應性微玻珠可從Dyno IndustrierASA和Dynal AS，Norway Bang Particles，USA和Prolabo，France購得。相對於固定的配體而言，當欲固定配體時，在實施本發明的方法中可將配體偶聯於特異性結合對(如生物素/鏈黴親和素)的一成員，並且將該結合對的另一成員任選地結合於底物、團粒，或從未結合的組分分離出結合配體的成分前，將配體或配體TC II或配體holo-TC II複合物固定。
本領域熟知固定親和性分子，如用於分離的抗體或抗體片段，例如任選地通過接頭將配體結合於或偶聯於任何熟知的固相支持物或基質(已廣泛用於柱上的分離或固定)，而且還可用本領域任何已知的方法。這些固相可以採取顆粒、薄板、凝膠、濾紙、膜、纖維或毛細管或微量滴定槽、管或孔板形式，通常可用玻璃、矽、膠乳或聚合物製成。將配體結合到固相支持物的方法是本領域熟知和文獻中有廣泛描述。
可用常規方法將配體偶聯於底物或特異性結合對的一個成員。
如果該分析是作為競爭性結合分析進行的，本發明的方法通常包括在樣品中加入一標記的化合物，它競爭結合該配體。通常，在這一方面優選採用標記的holo-TC II。所用的標記可以是任何能直接或間接檢測出的標記，如生色團(該術語包括螢光團)、放射性標記(通常共價結合或螯合)、酶或酶的底物、磁性標記等。
一優選實例是，本發明的方法包括使固定的或可固定的TC II或holo-TC II結合配體與研究的樣品接觸；將配體結合的組分與未結合配體的組分分開；將結合組分中結合的鈷胺素與holo-TC II分子分離，較佳地通過分離釋放的鈷胺素的濃度至少為初始樣品中holo-TC II濃度的3倍，較佳地為5倍和更佳地為10倍。
本發明這方面的含義是TC II或holo-TC II的分離和濃縮，從而使得在該方法中可採用鈷胺素檢測的標準方法。如上所述，無這種濃縮步驟時，本領域的分級步驟不適合於鈷胺素的測定，因為鈷胺素存在的量太低。可採用任何適合的方法從holo-TC II中釋放鈷胺素，但通常可採用加熱或改變周圍介質的pH。用KCN處理可將不同形式的鈷胺素轉化成光敏感性較弱的維生素B12。在本發明的方法中可用任何適合的游離鈷胺素測定的方法，例如通過在存在帶標記的配體(與分離的鈷胺素競爭結合於固定的結合伴侶)時，使固定的鈷胺素結合伴侶與樣品中分離的鈷胺素接觸進行競爭分析。Kuemmerk等人(1992)Clin.Chem 382073-2077中舉例描述的方法就是適合的。美國專利No.5451508中公開了另一測定游離鈷胺素的方法，其包括一種免疫分析技術。
在本發明的一實例中，優選固定TC II結合配體，並結合於holo和脫輔基TCII。
在另一優選實例中，本發明的分析方法包括使帶固定TC II或holo-TC II結合配體的固相支持物與待研究的樣品和非固定的配體接觸，所述的固定化配體能結合於TC II或holo-TC II、所述的非固定化配體、或所述的TC II或holo-TC II與所述的非固定化配體的複合物，而且所述的非固定化的配體能結合於至少一個所述的固定化配體、TC II或holo-TC II、以及所述的固定化配體與TC II或holo-TC II的複合物；如果所述的分析方法是一種夾心分析，至少一種所述的配體對holo-TC II是特異性的，如果所述的分析是競爭性分析，則所述的固定化配體對holo-TC II和其競爭者是特異性的；因此被TC II或holo-TC II、所述的非固定化配體、或所述的非固定化配體與TC II或holo-TC II的複合物結合的所述的固定化配體的比例，取決於所述的樣品中存在的holo-TC II的量，和當結合或未結合時，所述的非固定化配體能直接或間接產生可檢測的信號；將結合組分與未結合組分分開；和直接或間接測定結合於固定化配體的非固定化配體，即結合組分，或未結合於固定化配體並在溶液中的非固定化配體，即未結合組分；可分開、同時或順序進行樣品和所述的非固定化配體與固相支持物的接觸，如果是分開或順序進行的，它們可以任一順序進行接觸。
本發明方法的其它優選實例包括測定非固定的配體，其直接或間接結合或任選地不能直接或間接結合於固定的配體。當非固定的配體與holo-TC II競爭結合於固定的配體時，未結合的非固定配體的高水平表明樣品中holo-TC II的高濃度，未結合的非固定配體的低水平則表明樣品中holo-TC II的低濃度。當非固定的配體結合於TC II或holo-TC II(其進而結合於固定的配體)時，結合的非固定配體的高水平表明樣品中holo-TC II的高濃度，而結合的非固定配體的低水平則表明樣品中holo-TC II的低濃度。
在本發明的方法中，通過測定含有脫輔基和holo-TC II以及脫輔基和holo-HC(結合咕啉或TC I和III)二者的身體樣品中存在的holo-TC II複合物，或結合於TC II分子的鈷胺素的量，來確定鈷胺素的代謝活性庫。
可用固定的鈷胺素或模擬物或其片段(能選擇性結合於脫輔基形式的TC II和結合咕啉(HC))進行初步的分離步驟。在這種初步步驟中，用固定鈷胺素、模擬物或其片段結合脫輔基形式的TC II和HC蛋白質，並將其從holo-TC II和holo-HC複合物中分離出來。
在這種實驗中，然後按本發明的任一實例所述進行分離的holo形式的TC II的分析，但顯然，通過不解離複合物的方法進行holo-TC II複合物的測定，再測定釋放的鈷胺素是最有用的。對技術人員而言顯然的是，如果初步步驟進行上述的備選優選實施例時，夾心分析中需要至少一種對holo-TC II(而不是對holo-TC II)的特異性配體，這和競爭分析中需要至少一種對holo-TC II及其競爭者(而不是對TC II)的特異性配體的需求已不再相關，因為脫輔基形式的TC II已被捕獲，不在存在了。因此，固定的或非固定的配體對holo-TC II或TC II或其競爭者可以是特異性的。
固定的鈷胺素應不表現出任何明顯的與其支持物分離的傾向，因為這可能導致與脫輔基-TC II結合併將其轉化成holo-TC II。生物素醯化的鈷胺素以非常穩定方式結合於其上帶有親和素(avadin)/鏈黴親和素的固體表面，以這種方法將鈷胺素限制在支持物上便於進行該步驟。事實上，當採用生物素醯化鈷胺素時，可以非固定的形式加入到分析的樣品中，其結合於脫輔基形式的TC II和HC。然後使樣品與其上固定有生物素的結合伴侶(如親和素)的固體表面接觸。然後形成的親和素-生物素醯化鈷胺素-TC II的複合物易於從樣品中分離出來。
在本發明的實施初步分離步驟的一個實例中，通過使樣品與固定化TC II配體(其捕獲holo-TC II複合物，在溶液中留下結合咕啉)接觸，然後使被固定的bolo-TC II與第二TC II配體(帶標記，因此可探測)接觸，隨後測定holo-TC II庫。適合的TC II結合配體的例子是不重疊的單克隆抗體，或真正的TC II的特異性多克隆抗體也適用於此捕獲和檢測實例，因為可識別TC II分子上不同的表位。
在本發明的另一進行初步分離步驟的實例中，holo-TC II分子與帶標記的非固定配體競爭結合於固定的配體，因此可由帶標記的非固定配體結合於或沒有結合於固定配體的量來計算holo-TC II的量。
在本發明的初步分離步驟的一優選實例中，脫輔基TC II和脫輔基HC結合於鈷胺素、模擬物或其片段發生在某一位點上，或以抑制後續的TC II的非固定配體或結合伴侶對固定的結合鈷胺素的識別和結合的方式發生。在該實例中，在進行本發明的分析前，無需從結合的脫輔基形式分離出holo-TC II和holo-HC。在該實例中，非固定結合伴侶或配體針對的位點非常重要，應該是當脫輔基TC II和脫輔基HC在鈷胺素、模擬物或其片段上固定時，TC II上被掩蔽或屏蔽或其它不可能接近的表位。
初步分離步驟是否包括採用TC II的結合配體或總分離(即從樣品中分離出所有脫輔基和holo TC II蛋白質)之前是否採用固定化鈷胺素、模擬物或其片段進行初步步驟，不是本方法的需要，且其能滿足從至少含有一部分所需蛋白質′TC II亞組的樣品中分離出某成分。
因此在一些實例中，選擇結合伴侶或配體及結合條件，以完成所有選定的「亞組」的後續分離。在這種情況中，未結合組分可視為基本無TC II或holo-TC II蛋白質，即至少80％、90％或95％無TC II或holo-TC II，取決於選擇何種成分為組分分離的基礎。
在其它實例中，選擇結合伴侶和結合條件使得樣品中只有TC II蛋白的一部分被分離到一組分中。在這種情況下，應以部分分離來計算建立該分析的標準校準曲線。在在這點上，可用本領域熟知的標準方法確定產生檢測holo-TC II濃度的標準校準曲線。
因此，如果在組分分離步驟中採用TC II結合配體，至少一部分結合TC II的鈷胺素將在結合組分中，樣品中結合於分子(如HC或白蛋白)而非TC II的鈷胺素將在未結合組分中(即未分離的組分)。結合組分中的TC II可以是脫輔基和holo形式，而且還可以與鈷胺素以外的類鈷胺素物質或模擬物複合。
如果需要，本發明的方法還可包括一初步分離步驟，其中使樣品與固定的或可固定的結合咕啉(脫輔基和holo形式或僅holo/形式)的特異性結合配體接觸。在該方法中，可減少holo-HC衍生的結合TC II的鈷胺素測定中的錯誤影響，而且可採用TC II或holo-TC II的特異性結合配體(對結合咕啉有一些結合親和力)。
另外，如上所述由於血清中脫輔基和holo形式的TC II濃度非常低，在本發明的操作中具有特別高特異性和親和性的配體或結合伴侶是必須的。同樣，本發明配體所需的親和性常數取決於該配體是否對TC II或holo-TC II的特異性，而且也可將其用作捕獲或檢測配體，因為TC II的血清濃度約為0.5-1nM，而holo-TC II的血清濃度僅為35-160pM。所以，TC II捕獲配體的親和力常數至少為109M-1，較佳地為2×109M-1以上，更佳地為1010M-1才理想。對於holo-TC II捕獲配體，親和力常數至少為1010M-1，較佳地是2×1010M-1以上，更佳地是1011M-1以上才理想。顯然，由於分析中的濃度影響，檢測結合劑所需的親和力常數可小於捕獲配體的。
holo-TC II或TC II結合配體與HC的交叉反應性程度應小於1％，較佳地為0.1％-1％之間，最佳地小於0.1％。類似地，holo-TC II結合配體表現出的與脫輔基TC II的交叉反應性宜為不超過1％，較佳地應在0.1％-1％之間，更佳地它們的交叉反應性應小於0.1％。
通過使用這種高親和性的配體，它們的功能超過了單純的捕獲和/或檢測配體，在從分析樣品中分離和濃縮TC II蛋白質中它們起了至關重要的作用。TC II或holo-TC II結合配體應將配體至少濃縮3倍，較佳地為5倍，更佳地為至少10倍。
在另一替換分析而不是競爭分析的分析技術實例中，將含holo-TC II複合物的樣品與一固相接觸，該固相上結合有能識別固定化配體(如holo-TC II)上的相同結合位點的帶標記的配體。樣品中的holo-TC II與結合的帶標記的配體競爭位點，從而在系統平衡後從固相支持物置換出的帶標記配體的量和溶液中可檢測的量以及初始樣品中存在的holo-TC II的量之間有一直接的正比例關係。可直接或間接測定帶標記的配體，而且可以結合於或未結合於固相支持物的帶標記配體量確定。實際上，在該實例中先前非固定化的配體在加入樣品前與固定的配體結合，但這種結合併不意味著該配體以任何形式被固定。
另一優選實例涉及將含holo-TC II的樣品與其上固定有holo-TC II的固相支持物和帶標記的非固定holo-TC II特異性結合劑接觸。樣品中游離的holo-TCII和固定的holo-TC II與帶標記的非固定配體競爭結合，測定與固相結合的或溶液中殘留的帶標記的配體，可計算holo-TC II的濃度。在本發明一特別優選的實例中，帶標記的非固定holo-TC II結合配體是一種抗體。
在另一實例中，將含感興趣分析物的樣品與帶標記的holo-TC II和固定的配體接觸。帶標記的和不帶標記的holo-TC II競爭結合於固定化配體，達到平衡後，結合於固定化配體的帶標記的holo-TC II的量與感興趣樣品中holo-TC II的量呈間接正比例。另外，可直接或間接測定帶標記holo-TC II，而且可測定結合於或未結合於固相支持物的帶標記holo-TC II的量。
在本發明的另一實例中，將holo-TC II複合物特異性的非固定的但為可固定的配體(如，與生物素或特異性結合對的另一成員偶聯的配體)與樣品接觸，形成holo-TC II/非固定配體複合物。然後可用已知的方法從溶液中將配體/holo-TC II複合物沉澱下來分離後作分析。
在本發明的另一實例中，將兩種帶標記的結合伴侶加入到樣品中(任選在初步步驟後，如除去樣品中脫輔基形式的TC II和HC)。在該實例中，結合伴侶是帶標記的holo-TC II或其模擬物或片段和其帶標記的結合伴侶，如帶標記的抗體。在該實例中，僅在標記彼此密切接近時(即兩種帶標記的結合伴侶彼此結合時)，標記才產生可檢測的信號。因此，當加入到樣品中時，holo-TC II的帶標記的結合伴侶與樣品中不帶標記的holo-TC II結合(不產生可檢測的信號)，或與帶標記的holo-TC II或其模擬物、片段或與帶標記的TC II結合伴侶結合的變體結合(產生可檢測的信號)。標記試劑，如Amersham閃爍接近分析中所用的(如美國專利No.4568649中所述)，適合用於本實例，而且這種方法的高靈敏度非常適合這種分析物以低濃度存在的分析。因此，例如當結合對的一個成員是用β-發射核子(如I125或H3)標記時，另一成員則用適合的閃爍分子標記。發射的β粒子在水環境中喪失其能量，除非閃爍體在1.5μm以內並要求兩帶標記的伴侶彼此結合，產生檢測的信號。這兩種帶標記的伴侶彼此結合的概率可用樣品中存在的holo-TC II的濃度來確定，產生的信號越大，樣品中holo-TC II的濃度越低。
如本文所述，術語「測定」或「評估」包括樣品中結合holo-TC II或TC II的鈷胺素的量或濃度的絕對值的定量，和半定量和定量評估或測定。也可得到結合於TC II的鈷胺素的水平或量的指數、比例、百分比或類似指標(如相對於總鈷胺素)。
用於本發明分析方法的身體樣品可以是任何含鈷胺素的樣品，如體液或組織樣品，或懸浮液等。較佳地，樣品是身體樣品，如精液、腦脊髓液或羊膜水，但通常為從血液衍生的樣品。在這種情況中，用於分析的樣品較佳地為無細胞的，血清或血漿。在用於本發明的分析方法前，可先處理樣品，例如添加緩衝液或其它水性介質進行稀釋和存儲或保藏，例如在分析前預冷或冷凍。
在本發明的實踐中，可用適當的方法從未結合組分中分離出結合組分，如沉澱、離心、過濾、層析方法等。
為避免疑問，術語「鈷胺素」與本文所用的「維生素B12」同義，包括體內存在的和有代謝活性的(當適當存在時)所有形式的維生素B12(維生素B12、5-6-二甲基-苯並咪唑基維生素B12、甲基鈷胺素、5′-脫氧醯苷鈷胺素)。
如上所述在本發明的方法中，結合TC的鈷胺素可通過檢測結合於分離的holo-TC II的配體進行測定，或用holo-TC II的帶標記的競爭者作競爭分析來測定，其中holo-TC II與帶標記的競爭者競爭結合於結合配體；或通過檢測自分離的holo-TC II釋放出的鈷胺素來測定。
可用任何常規的方法常規標記可檢測的配體，例如用產生信號的標記物標記，該標記可用例如發光、化學發光、比色評估、螢光、放射活性或酶活性來測定。事實上，本發明的方法中可採用本領域已知的任何產生信號的標記物。
僅作舉例用，本發明中可用於標記可檢測結合配體的產色或螢光化合物的適當例子為，蒽醌、偶氮染料、吖嗪染料(如噁嗪和噻嗪)、三嗪、天然色素如卟啉、藻膽蛋白(包括藻紅蛋白和藻青蛋白)、葉綠素和它們的模擬物或衍生物、類胡蘿蔔素、acrinidine、氧雜蒽(包括螢光素和羅丹明)、靛藍染料、噻噸、香豆素、聚甲炔(包括二和三芳基次甲基和它們的肽菁和金屬酞花青衍生物)。
類似地，可用範圍廣泛的放射化合物作為本發明所用試劑的產生信號標記部分，其中有標記碘-125-化合物。
另外，可將結合配體與天然或合成化合物(能產生可用已知方法測定到的化學發光信號)偶聯。適合的化學發光化合物包括螢光素、草酸酯、1，2-二噁乙烷、魯米諾或其衍生物，但不限於此。如果適合，可用過氧化氫、酶，如螢光素酶，或其它化學劑從所用的產生信號分子中產生化學發光信號。
強陰離子信號產生分子最好不要用於本發明的方法中，因為它們趨向於與樣品中可能存在的血清蛋白質(如人血清白蛋白(HSA))結合。可以用的特別適合的例子是異硫氰酸螢光素、羅丹明B或N-(試滷靈-4-羰基)哌啶-4-羧酸-N-羥基琥珀醯亞胺-酯或resos。
按本發明方法的一實例，可從體液樣品中分離出含至少一部分TC II，通過將該體液與TC II特異性結合配體反應，然後從餘下的樣品中分離出TC II結合組分，從而分離和濃縮其中的靶分析物。在本發明的一實例中，可用針對holo-TC II的可檢測結合配體來測定分離的結合組分中存在的TC II-鈷胺素複合物。在與TCII結合配體接觸之前、同時或之後，和在從剩餘樣品中分離出TC II結合組分之前或之後，將holo-TC II結合配體與待研究的樣品接觸。
相應地，可從剩餘的樣品中分離出含鈷胺素的組分(如包括holo-TC II和holo-HC)，通過待研究的體液與固定的或受限的(tethered)鈷胺素或其模擬物或片段(其結合於脫輔基-TC II和脫輔基-HC)反應，並與含holo-TC II和holo-HC的剩餘樣品的結合組分中分離。然後可用可檢測的TC II結合配體來檢測分離組分中存在的TC II-鈷胺素複合物。在與結合鈷胺素接觸之前、同時或之後和在與剩餘樣品中結合組分分離之前或之後，可將可探測的結合TC II的配體與待研究的樣品接觸。
在-些實例中，可將脫輔基和/或holo-TC II/HC複合物的一種或其它成分的固定化配體加樣到柱上。然後將含有TC II鈷胺素複合物的體液加樣到柱中，與結合的配體接觸。
衝洗或洗滌柱，並可用洗脫液(如果需要)從柱上釋放出結合組分便利其收集。如果未結合組分的含量是或也是要分析的(關於其它成分)，可用緩衝液或介質(用校準微量移液管加入)洗滌此柱，以確保加入和收集己知的精確體積。所加入的體積宜在3％所需(即校準)體積以內，更佳的在1或2％以內。同樣地，如果在檢測前要從柱上釋放出待分析組分，應用校準微量移液管加入用於釋放複合物的洗脫液。
在另一實例中，可將用於分離樣品某組分的結合配體固定在特定的固相支持物(如膠乳或聚合物小珠)上。為了有助於操作和分離，可用磁性小珠，事實上這是本發明的一個優選實例。本文所用的術語「磁性」指當將其置於磁場時能具有磁矩的支持物。換而言之，含磁性顆粒的支持物可通過磁性聚集方便地移動，從而提供了一種快速、簡單和有效的方法在配體結合後來分離這些組分。
因此用本發明的方法，通過施加一磁場(例如用永久磁鐵)可將吸附有TC II-鈷胺素複合物的磁性顆粒移到一適當表面上。通常在裝有樣品混合物的容器一邊加一磁鐵，使顆粒聚集在容器壁上，從而分離它們以作進一步分析。
特別優選的超順磁性顆粒是Sintef在歐洲專利申請106873中列舉的實例，如可避免反應中顆粒的磁性凝集和聚集。熟知的由Bang Particles(US)製造的磁性小珠特別適用於本發明。
通常，除評估的樣品外，含有已知holo-TC II複合物成分的校準樣品也在進行本發明的分析方法中得到評估，其的測定值可用於繪製校準曲線，從該曲線可確定研究樣品的結合TC Il的鈷胺素含量。用於holo-TC II複合物測定的校準樣品的性質、轉化或調節因素的選擇可多種多樣，取決於例如用於分析的結合和分離步驟中的具體配體，和影響樣品結合和分離的方法的其它方面，如緩衝液組成、分析條件等。通常，所用的校準樣品的holo-TC II含量為0-300pmo/l。結合TC II的鈷胺素通常可測得的參考範圍為30-160pmol/l。
bolo-TC II校準用標準通常是人、天然或重組holo-TC II。將holo-TC II作為校準物用於holo-TC II的分析是新穎的，構成本發明的另一方面。
從另一角度來看，本發明提供一種用於診斷分析的試劑盒，所述的試劑盒包括固定的或可固定的TC II或holo-TC II的特異性結合配體；較佳地，已知濃度的holo-TC II溶液和更佳地是具有某一範圍holo-TC II複合物濃度的一套溶液；任選地，使holo-TC II釋放鈷胺素的分離試劑；和任選地，帶標記的配體。
本發明的分析方法測定鈷胺素的代謝活性庫，通過測定holo-TC II複合物或分離holo-TC II複合物，然後測定與其相關的鈷胺素，從而提供一種在發生鈷胺素不足臨床表現之前或之後，測定鈷胺素不足的方便方法。這種分析方法可方便地在症狀發生之前使用，因為它能精確地預測鈷胺素的負平衡值。
現用以下非限制性的實施例和


本發明

圖1是holo-TC II的標準曲線；其中「cpm」表示「每分鐘計數」。
圖2是一顯示血清總鈷胺素和holo-TC II濃度關係的圖，其中「totVitB12。和圖3中的「totVB12」表示「總維生素B12」；和圖3是一顯示血清總鈷胺素和holo-HC濃度關係的圖。
具體實施例方式
實施例1將TC II特異性抗體(如單克隆或多克隆抗體)固定在可磁化顆粒上。將一份血清(100-500μl)與等體積的PBS混合，讓它們與過量的固定化抗體和過量的標記有I125的非重疊性抗holo-TC II抗體(如單克隆抗體)反應15分鐘。用強磁鐵沉澱磁性顆粒，除去上清液，並用PBS洗滌顆粒。
測定放射性，用內插法在標準曲線上確定樣品中holo-TC II的濃度。
實施例2將TC II特異性抗體(如單克隆或多克隆抗體)固定在可磁化顆粒上。將一份血清(600μl)與等體積的PBS混合，讓它們與抗體反應30分鐘。用強磁鐵沉澱磁性顆粒，除去上清液。用PBS洗滌顆粒一次，然後依次用含氰化鉀(100μM)的氫氧化鈉(0.3M)、二硫蘇糖醇(15mM)和固定量的總體積為100μl的維生素B12(標記有I125或Co57)處理15分鐘，釋放出結合於固定化holo-TC II的鈷胺素，同時將所有形式的鈷胺素轉化成維生素B12，並與固定量的帶標記維生素B12混合。加入在100μl硼酸鹽緩衝液中的限定量內因子(Intrinsic Factor)，讓它們反應10分鐘。用強磁鐵沉澱磁化顆粒，除去150μL上清液，測定放射性。從標準曲線上確定血清樣品中結合TC II的鈷胺素濃度。
另外，可用Abbot′s IMx方法或類似方法測定釋放的鈷胺素。
實施例3將TC II特異性抗體(如單克隆或多克隆抗體)固定在可磁化顆粒上。在一份血清(100-500μl)與等體積PBS的混合物中加入固定量的I125標記的holo-TCII和限定量的固定化抗holo-TC II抗體。培育15分鐘後，用強磁鐵沉澱磁性顆粒。用PBS洗滌，測定放射性。從標準曲線上確定holo-TC II的濃度。
實施例4將重組體holo-TC II固定在可磁化顆粒上。在一份血清(100-500μl)與等體積PBS的混合物中加入固定量的固定化holo-TC II和過量的holo-TC II特異性抗體(如單克隆或多克隆抗體)，其上標記有I125。培育15分鐘後，用強磁鐵沉澱磁性顆粒。用PBS洗滌，測定放射性。從標準曲線上確定holo-TC II的濃度。
實施例5在一份血清(100-500μL)中加入過量生物素醯化的鈷胺素，以結合所有脫輔基TC II和脫輔基HC。培育10分鐘後，用包被有親和素的磁性顆粒處理血清樣品10分鐘。用強磁鐵沉澱這些顆粒。回收上清液，與兩種非重疊性單克隆抗TCII抗體(一種標記有I125，另一種與生物素偶聯)混合。10分鐘後，加入包被有親和素的磁性顆粒，使其結合生物素醯化的加合物10分鐘。隨後，用強磁鐵沉澱顆粒，用PBS洗滌。測定放射性，用內插法在標準曲線上確定holo-TC II的濃度。
實施例6
與實施例5相同，但將脫輔基TC II缺失的血清與固定量的I125標記的holo-TC II和限定量的TC II抗體(固定在可磁化顆粒上)混合。培育15分鐘後，用強磁鐵沉澱顆粒。
用PBS洗滌顆粒，測定放射性。
實施例7將鈷胺素固定在可磁化微粒體上，如用共價偶聯或用生物素-(鏈黴)親和素。通常，室溫暗處用1μM生物素醯化的鈷胺素培育包被有鏈黴親和素的可磁化微球30分鐘。用磁鐵沉澱小珠，用PBS洗滌2次，以1％在PBS+5mg/ml HAS中重懸。在一份血清(100-500μL)中加入等體積的PBS和1/10體積的包被有鈷胺素的磁化微球。室溫、暗處將混合物培育30分鐘，從而結合所有脫輔基TC II和脫輔基HC。用磁鐵沉澱顆粒，回收上清液，與兩種非重疊性單克隆抗TC II抗體(一種標記有I125，另一種與生物素偶聯)混合。10分鐘後，加入包被有(鏈黴)親和素的磁性顆粒，使其結合生物素醯化的加合物10分鐘。隨後，用磁鐵沉澱顆粒，用PBS洗滌。測定放射性，用內插法在標準曲線上確定holo-TC II的濃度。
實施例8與實施例7相同，但將過量的生物素醯化的鈷胺素直接加入到血清樣品+PBS中，以結合所有脫輔基TC II和脫輔基HC。培育10分鐘後，室溫、暗處用包被有(鏈黴)親和素的磁化微球處理血清樣品30分鐘。
實施例9將對人TC II特異性的兔抗體(表觀結合常數＞5×109M-1)固定在1μm包被有羊抗兔IgG抗體(Indica Diagnostics)的可磁化微球上。將49位健康自願者的各400μL血清樣品與等體積的PBS和40μL固定化抗體(1％)混合。將混合物置於室溫、暗處1小時，然後用磁鐵沉澱微球。用冰冷的緩衝液(PBS+0.02％Tween20)洗滌沉澱物一次，隨後將其重懸在50μL磷酸緩衝液中(其中含有50mM二硫蘇糖醇、0.001％氰化鉀和固定量的57Co-CN-鈷胺素(Amersham)，pH7.5)。使其在室溫維持30分鐘，其後加入25μL 0.5M氫氧化鈉，15分鐘後加入以硼酸緩衝液(pH8.6)配的300μL固定在葡聚糖上的內因子(足以結合50％指示劑)。室溫、暗處1小時後，1000g離心諸樣品，4℃、10分鐘，小心移去上清液，在PackardRiastar上計數沉澱。在用8種與樣品相同處理的校準劑(0-500pM的holo TC II)建立的標準曲線上確定結合TC II的鈷胺素的濃度。還用Abbot IMx B12分析方法來分析37份血清樣品的血清總鈷胺素。
圖1顯示了holo-TC II的標準曲線，圖2顯示了37位健康自願者中血清總鈷胺素與holo-TC II濃度之間的關係。表明相關性低，r2＝0.50。相反，holo-HC與血清總鈷胺素的相關性高，r2＝0.96(圖3)。49位健康自願者的平均holoTC濃度為64±28pM，95％參考範圍為23-127pM。
本分析的CV為10％，分析靈敏度(0-校準劑-3s.d.)低於10pM，而且不會與結合咕啉交叉反應。
權利要求
1.一種用於測定體液的無細胞樣品中結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II的分析方法，其特徵在於，所述的方法包括使體液的無細胞樣品與固定在可磁化顆粒上的運鈷胺素蛋白II或結合咕啉的固定化鈷胺素或片段接觸，從而將脫輔基的運鈷胺素蛋白II或結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II的特異性結合配體接觸，通過施加磁場將結合配體的組分與未結合配體的組分分開，和測定所述結合配體的組分中結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II的含量。
2.如權利要求1所述的分析方法，其特徵在於，其中進行了所述的配體結合組分與所述的配體未結合組分的分離，從而至少使結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II的濃度增加3倍。
3.如權利要求1所述的分析方法，其特徵在於，所述的分析能測定濃度低至9pM的結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II。
4.如權利要求1所述的分析方法，其特徵在於，所述的特異性結合配體表現出對運鈷胺素蛋白II的高度選擇性和特異性，並表現出對脫輔基或結合鈷胺素形式的運鈷胺素蛋白或其它結合鈷胺素的蛋白質的低親和性。
5.如權利要求1所述的分析方法，其特徵在於，所述的特異性結合配體選自多克隆或單克隆抗體、抗體片段、多肽、寡肽、DNA或RNA的特異性結合序列、或細胞表面受體。
6.如權利要求1所述的分析方法，其特徵在於，所述特異性結合配體是與運鈷胺素蛋白II結合的單克隆抗體。
7.如權利要求1所述的分析方法，其特徵在於，通過改變溫度或pH，使所述的鈷胺素從結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II分子中釋放出來。
8.如權利要求7所述的分析方法，其特徵在於，所述的釋放出的鈷胺素的測定，是通過競爭性免疫分析方法進行的，在帶標記的鈷胺素存在下，將樣品中分離出的鈷胺素與固定化的鈷胺素配體相結合，所述帶標記的鈷胺素與分離出的鈷胺素競爭性結合於所述的固定化的鈷胺素配體上。
9.如權利要求8所述的分析方法，其特徵在於，所述標記的配體用可用發光、化學發光、比色法、螢光、放射活性或酶活性測定的信號標記。
10.如權利要求8所述的分析方法，其特徵在於，所述標記的配體用可用化學發光測定的信號標記。
11.如權利要求1所述的分析方法，其特徵在於，所述的運鈷胺素蛋白II結合配體的親和性常數至少為109M-1。
12.如權利要求1所述的分析方法，其特徵在於，所述的運鈷胺素蛋白II結合配體的親和性常數大於1011M-1。
13.如權利要求1所述的分析方法，其特徵在於，所述的結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II或運鈷胺素蛋白II結合配體與咕啉的交叉反應性程度在0.1％和1％之間。
14.如權利要求1所述的分析方法，其特徵在於，所述的結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II或運鈷胺素蛋白II結合配體與咕啉的交叉反應性程度小於0.1％。
15.如權利要求1所述的分析方法，其特徵在於，所述的體液的無細胞樣品選自精液、腦脊液、羊膜水或從血液衍生的樣品。
16.如權利要求15所述的分析方法，其特徵在於，所述的從血液衍生的樣品是血清或血漿。
17.如權利要求1所述的分析方法，其特徵在於，其中的分析校準是用結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II標準品進行的。
18.如權利要求17所述的分析方法，其特徵在於，所述的標準品是人、天然或重組體結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II。
19.如權利要求1所述的分析方法，其特徵在於，所述的方法包括將固定在可磁化顆粒上的運鈷胺素蛋白II的單克隆抗體，與血清或血漿樣品接觸，通過施加磁場使結合配體的組分與未結合配體的組分分離，並通過改變pH，使所述的鈷胺素從結合鈷胺素的運鈷胺素蛋白II分子中釋放出來，在帶標記的鈷胺素存在下，將釋放出的鈷胺素與固定化的鈷胺素結合配體相結合，所述帶標記的鈷胺素與分離出的鈷胺素競爭性結合於所述的固定化的鈷胺素配體上；其中所述標記的配體用可用化學發光測定的信號標記。
全文摘要
本發明提供一種分析方法，用於測定身體樣品中結合運鈷胺素蛋白II(TC II)的鈷胺素，包括使無細胞體液樣品與固定的或可固定的TC II特異性結合配體或結合鈷胺素的TCII(holo TC II)相接觸，將配體結合組分與配體未結合組分相分開，並測定其中holo－TC II或TC－II結合的鈷胺素含量。
文檔編號G01N33/53GK1530659SQ20041000554
公開日2004年9月22日 申請日期1999年9月20日 優先權日1998年9月18日
發明者E·松德哈根, L·奧寧, E 松德哈根 申請人:愛克西斯-希爾德聯合股份有限公司