一種分離裸子植物花粉粒原生質體的方法
2023-09-20 17:03:25 2
專利名稱：一種分離裸子植物花粉粒原生質體的方法
技術領域：
本發明涉及一種分離植物花粉粒原生質體的方法，特別涉及一種分離裸子植物花粉粒原生質體的方法。
背景技術：
由於花粉粒具有結構簡單、群體數量大、易於離體操作等特徵，因而被認為是生物技術領域理想的細胞體系。植物花粉粒的壁通常由纖維素、果膠質等組成的內壁和孢粉素組成的外壁構成，其中內壁可通過酶解的方法去除，而外壁中的孢粉素則缺乏有效的可使之降解的酶。
花粉粒原生質體是指去掉花粉壁的由質膜包圍的原生質，不僅是外源基因的良好受體，還具有原生質體及單倍體的特點以及能夠與體細胞原生質體融合等性質，使得研究者對其產生極大興趣，但是迄今為止還沒有分離裸子植物花粉原生質體的有效方法和技術，從而導致與裸子植物相關的生物學研究相對被子植物而言比較滯後。
發明內容
本發明的目的是提供一種較快速分離裸子植物花粉粒原生質體的方法。
本發明所提供的分離裸子植物花粉粒原生質體的方法是用含1.5％-3％纖維素酶和0.8％-2％離析酶的酶解液酶解裸子植物花粉粒5-7小時，得到裸子植物花粉粒原生質體；所述百分數為質量百分含量。
為了獲得更好的酶解效果，所述酶解液是以含0.01％硼酸和0.01％-0.03％氯化鈣的10％-15％蔗糖溶液配製的。
所述裸子植物花粉粒與酶解液的質量比可為1/20-1/5。
所述酶解的溫度可為24-27℃。
為了加快酶解速度可將加入裸子植物花粉粒的酶解液在60-150rpm的搖床上振蕩。
酶解5-7小時後，通過離心法收集得到的沉澱即為裸子植物花粉粒原生質體。所述離心的轉速可為1000-2000r/min。
所述纖維素酶可為市售的各種纖維素酶(尤以cellulase R-10(Yakult Honsha Co.Ltd)效果最佳)，所述離析酶可為市售的各種離析酶(尤以macerozyme R-10(Yakult Honsha Co.Ltd)效果最佳)。
本發明特別適用於松杉綱、銀杏綱以及蘇鐵綱的裸子植物，其中松杉綱中效果較突出的有白皮松、青扦、紅松、油松、雲杉、冷杉等松科裸子植物，銀杏綱的代表是銀杏，蘇鐵綱的代表為蘇鐵。
上述百分比濃度均為質量百分比濃度。
本發明的方法利用纖維素酶酶解花粉內壁的纖維素成分，利用離析酶降解花粉內壁中的果膠質等組分，利用蔗糖維持溶液的滲透壓，利用硼酸及氯化鈣保護原生質體膜的穩定性，並使得所得到的原生質體在較長時間內保持活性狀態。該方法快速、簡單易行，可獲得大量具有活性的裸子植物的花粉粒原生質體，具有較大的實際應用價值。
說明書附1為分離到的白皮松花粉粒原生質體在螢光顯微鏡下的觀察結果圖2為分離到的青扦花粉粒原生質體在螢光顯微鏡下的觀察結果具體實施方式
如無特別指明，以下實施例中的百分比濃度均為質量百分比濃度。
實施例1、分離白皮松花粉粒原生質體包括以下步驟1)將成熟的白皮松花粉粒室溫下進行乾燥後，-20℃保存備用；2)配製含0.01％硼酸(H3BO3)和0.01％氯化鈣(CaCl2)的15％蔗糖溶液；3)用步驟2)的溶液配製含2％纖維素酶(cellulase R-10，Yakult Honsha Co.Ltd)和1.5％離析酶(macerozyme R-10，Yakult Honsha Co.Ltd)的酶解液；4)將步驟1)的白皮松花粉粒500μg在室溫下回溫後，置於步驟3)的酶解液20ml中，25℃ 120rpm的搖床上振蕩酶解6小時；5)1000-2000r/min離心收集沉澱，得到180μg沉澱，該沉澱即為白皮松花粉粒原生質體，將該沉澱懸浮於10ml步驟2)的蔗糖溶液中，得到含有白皮松花粉粒原生質體的懸浮液；6)鏡檢向步驟5)的懸浮液中加入0.5ml濃度為0.1g/l的FDA溶液(該FDA溶液是由丙酮按質量體積比配製成濃度為0.1g/l的母液)，用螢光顯微鏡進行鏡檢，結果如
圖1所示。白皮松花粉原生質體的分離率高達70％，而且有活性的原生質體佔90％以上，說明該方法可快速有效分離得到白皮松花粉粒原生質體。
實施例2、分離青扦花粉粒原生質體包括以下步驟1)將成熟的青扦花粉粒室溫下進行乾燥後，-20℃保存備用；
2)配製含0.01％硼酸(H3BO3)和0.03％氯化鈣(CaCl2)的12％蔗糖溶液；3)用步驟2)的溶液配製含3％纖維素酶(cellulase R-10，Yakult Honsha Co.Ltd)和2％離析酶(macerozyme R-10，Yakult Honsha Co.Ltd)的酶解液；4)將步驟1)的青扦花粉粒500μg在室溫下回溫後，置於步驟3)的酶解液20ml中，25℃ 120rpm的搖床上振蕩酶解6.5小時；5)1500-2000r/min離心收集沉澱，得到210μg沉澱，該沉澱即為青扦花粉粒原生質體，將該沉澱懸浮於10ml步驟2)的蔗糖溶液中，得到含有青扦花粉粒原生質體的懸浮液；6)鏡檢向步驟5)的懸浮液中加入0.5ml濃度為0.1g/l的FDA溶液，用螢光顯微鏡進行鏡檢，結果如圖2所示。青扦花粉原生質體的分離率高達65％，而且有活性的原生質體在總原生質體中佔92％以上，說明該方法可快速有效分離得到有活性的青扦花粉粒原生質體。
權利要求
1.一種分離裸子植物花粉粒原生質體的方法，是用含1.5％-3％纖維素酶和0.8％-2％離析酶的酶解液酶解裸子植物花粉粒5-7小時，得到裸子植物花粉粒原生質體；所述百分數為質量百分含量。
2.根據權利要求1所述的分離裸子植物花粉粒原生質體的方法，其特徵在於所述酶解液是以含0.01％硼酸和0.01％-0.03％CaCl2的10％-15％蔗糖溶液配製的；所述百分數為質量百分含量。
3.根據權利要求1或2所述的分離裸子植物花粉粒原生質體的方法，其特徵在於所述裸子植物花粉粒與酶解液的質量比為1/20-1/5。
4.根據權利要求1或2所述的分離裸子植物花粉粒原生質體的方法，其特徵在於所述酶解溫度為24-27℃。
5.根據權利要求1或2所述的分離裸子植物花粉粒原生質體的方法，其特徵在於酶解5-7小時後，通過離心法收集得到的沉澱即為裸子植物花粉粒原生質體；所述離心的轉速為1000-2000r/min。
6.根據權利要求1或2所述的分離裸子植物花粉粒原生質體的方法，其特徵在於所述裸子植物為松杉綱、銀杏綱以及蘇鐵綱的裸子植物。
7.根據權利要求6所述的分離裸子植物花粉粒原生質體的方法，其特徵在於所述松杉綱為松科裸子植物；所述銀杏綱裸子植物為銀杏；所述蘇鐵綱裸子植物為蘇鐵。
8.根據權利要求7所述的分離裸子植物花粉粒原生質體的方法，其特徵在於述松科裸子植物為白皮松、青扦、紅松、油松、雲杉、冷杉。
全文摘要
本發明公開了一種分離裸子植物花粉粒原生質體的方法，其目的是提供一種較快速分離裸子植物花粉粒原生質體的方法。本發明的分離裸子植物花粉粒原生質體的方法，是用含1.5％－3％纖維素酶和0.8％－2％離析酶的酶解液酶解裸子植物花粉粒5－7小時，得到裸子植物花粉粒原生質體。本發明的分離裸子植物花粉粒原生質體的方法快速、簡單易行，可獲得大量具有活性的裸子植物花粉粒原生質體，具有較大的實際應用價值。
文檔編號C12N5/04GK1763179SQ200410083788
公開日2006年4月26日 申請日期2004年10月22日 優先權日2004年10月22日
發明者林金星, 房克鳳 申請人:中國科學院植物研究所