一種牡丹原生質體的提取方法
2023-09-20 16:53:10 2
專利名稱：一種牡丹原生質體的提取方法
技術領域：
本發明涉及一種牡丹原生質體的提取方法。
背景技術：
牡丹為芍藥科芍藥屬多年生落葉亞灌木，是我國傳統名花，富麗堂皇，國色天香， 自古就有富貴吉祥、繁榮昌盛的寓意，不僅是中國人民喜愛的花卉，而且也受到世界各國人 民的珍愛。而且牡丹不僅有觀賞價值，還具有很高的藥用價值。牡丹品種作為產業發展的基礎，需要不斷的推陳出新，培育出具有不同花色、花 型、花香、花期的新品種，在提高牡丹觀賞性的基礎上，延長花期、耐溼熱、抗乾燥寒冷等特 性，適合牡丹的園藝化栽培，適應現代化社會發展的需求。但是在牡丹新品種的培育過程 中，傳統的育種方法繁殖率低，周期長，品種選育定向性差，育種有效性低。目前，從植物中 提取原生質體，以此為材料進行轉基因和突變育種，是培育植物新品種的新方法，提取得到 的原生質體由於去掉了細胞壁，每個細胞都有可能發育成一個植株，大大提高了其繁殖系 數。但目前傳統的原生質體提取方法應用在牡丹各類外植體上，提取困難或提取的原生質 體活力較差，一般不超過60%，給牡丹轉基因和突變育種工作造成了阻礙。
發明內容
本發明的目的是提供一種牡丹原生質體的提取方法，以提高牡丹原生質體的活 力。為了實現以上目的，本發明所採用的技術方案是一種牡丹原生質體的提取方法， 其步驟如下
1)取胚已進入成熟期的牡丹種子，酒精浸泡、滅菌，接種在PH為4.8-6. 5的MS培養基 中，誘導牡丹成熟胚萌發；
2)取步驟1)萌發5-10天的子葉和/或下胚軸，切碎，接入pH為4.8-6. 5的MS培養基 中，變溫培養連續繼代兩次以上，獲得愈傷組織，所述變溫培養即每天在0-10°C條件下暗培 養8-10小時，在15-30°C條件下光照培養14-16小時；
3)取步驟2)得到的愈傷組織，置於pH為4.8-6. 5的酶液中1848°C震蕩12-16小時 游離原生質體，
4)將游離原生質體後的酶液用100-800目濾網過濾，濾液離心棄上清液，加入&(12洗 液混勻，然後從溶液底部注入蔗糖溶液，離心取得處於中間部分的牡丹原生質體。步驟1)所述MS培養基中含有6-苄基腺嘌呤(6-ΒΑ)0. Γ . 0 mg/L，萘乙酸(NAA) 0. 05 1. Omg/L,蔗糖 2-5% 和瓊脂 0. 7-0. 8% ；
步驟2)所述MS培養基中含有6-苄基腺嘌呤(6-BA) 0. Γ . 5 mg/L, 2,4- 二氯苯氧乙 酸(2，4-D) 0. 5 3 mg/L，蔗糖 2-5% 和瓊脂 0. 6-0. 8% ；
步驟3)所述酶液為含有以下組分及含量的水溶液纖維素酶1% 3%，半纖維素酶 0. 5% 1%，果膠酶0. 5% 2%，甘露醇0. 3-0. 7 mol/L，2_(N_ 嗎啡啉)乙磺酸(MES)O. 05-0. 3%，CaCl2O. 01-0. 2 mol/L ；
步驟4)所述蔗糖濃度為12-28%。本發明牡丹原生質體的提取方法，對牡丹愈傷組織的培養採用變溫培養，培養的 時常變溫使組織細胞在冷熱交替的刺激下，變得疏鬆易分散，有利於原生質體在游離過程 中保持較高的活力，得到高活力的牡丹原生質體，最終提取得到的牡丹原生質體經染色法 鑑別其活力在85%以上，適合採用突變、轉基因和細胞融合等遺傳操作誘導新品種；另外配 合優選的酶液，在愈傷組織細胞質壁分離過程中，避免其活力損失。
具體實施例方式實施例1
本實施例的牡丹原生質體提取方法如下步驟
1)取胚已進入成熟期的牡丹種子，用70%的酒精浸泡30s，0.1%的氯化汞滅菌9分鐘， 接種在PH為4. 8的MS培養基中，誘導牡丹成熟胚萌發，其中MS培養基中含有6-苄基腺嘌 呤(6-BA) 0. lmg/L，萘乙酸(NAA) 0. 05mg/L，蔗糖2%和瓊脂0. 7% ；也可以採用常規的MS培
養液；
2)取步驟1)萌發5天幼嫩的子葉，切成0.5cm片段，接入pH為4. 8的MS培養基中， 連續繼代兩次，獲得有利於原生質體游離的鬆軟易分散的愈傷組織，其中MS培養基中含有 6-苄基腺嘌呤(6-BA)0. 1 mg/L, 2,4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D)0. 5mg/L,蔗糖2%和瓊脂0. 6% ； 也可以採用常規的MS培養液；其中愈傷組織的培養採用變溫培養，即在1°C條件下暗培養8 小時，在15°C條件下光照培養16小時；
3)取步驟2)得到的愈傷組織，置於pH為4.8的酶液中採用恆溫搖床28°C震蕩12小時 游離原生質體，其中酶液為含有以下組分及含量的水溶液纖維素酶1%，半纖維素酶0. 5%， 果膠酶 0. 5%，甘露醇 0. 3 mol/L, 2- (N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)O. 05%, CaCl2 0. 01 mol/L ；也 可以採用常規的酶液；
4)將游離原生質體後的酶液用100目濾網過濾去除未消化的組織，濾液SOOrpm離心 棄上清液，加入0. 16 mol/L CaCl2洗液，輕輕混勻後，從溶液底部注入12%的蔗糖溶液，500 rpm離心，牡丹原生質體處於上部CaCl2洗液與下部蔗糖溶液之間，棄去上下溶液得到牡丹 原生質體。將取得的原生質體用0. 1%酚藏花紅溶液(在0. 4 mol/L甘露醇中)染色法鑑別原 生質體活力，獲得牡丹原生質體活力達89%。實施例2
本實施例的牡丹原生質體提取方法如下步驟
1)取胚已進入成熟期的牡丹種子，用70%的酒精浸泡30s，0.1%的氯化汞滅菌9分鐘， 接種在PH為5. 8的MS培養基中，誘導牡丹成熟胚萌發，其中MS培養基中含有6-苄基腺嘌 呤(6-BA)0. 5mg/L，萘乙酸(NAA)O. 2mg/L，蔗糖3%和瓊脂0. 8%，也可以採用常規的MS培養 液；；
2)取步驟1)萌發8天幼嫩的子葉和下胚軸，切成0.5cm片段，接入pH為5. 8的MS培 養基中，連續繼代三次，獲得有利於原生質體游離的鬆軟易分散的愈傷組織，其中MS培養 基中含有6-苄基腺嘌呤(6-BA) 1.0 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 1.8 mg/L，蔗糖3%和瓊脂0. 7%，也可以採用常規的MS培養液；其中愈傷組織的培養採用變溫培養，即在5°C條 件下暗培養9小時，在23°C條件下光照培養14小時；
3)取步驟2)得到的愈傷組織，置於pH為5.8的酶液中採用恆溫搖床22°C震蕩14小時 游離原生質體，其中酶液為含有以下組分及含量的水溶液纖維素酶2%，半纖維素酶0. 7%， 果膠酶 1. 2%，甘露醇 0. 5 mol/L，2- (N-嗎啡啉)乙磺酸(MES) 0. 2%, CaCl2 0. 1 mol/L ；也 可以採用常規的酶液；
4)將游離原生質體後的酶液用400目濾網過濾去除未消化的組織，濾液SOOrpm離心 棄上清液，加入0. 16 mol/L CaCl2洗液，輕輕混勻後，從溶液底部注入22%的蔗糖溶液，500 rpm離心，牡丹原生質體處於上部CaCl2洗液與下部蔗糖溶液之間，棄去上下溶液得到牡丹 原生質體。將取得的原生質體用0. 1%酚藏花紅溶液(在0. 4 mol/L甘露醇中)染色法鑑別原 生質體活力，獲得牡丹原生質體活力達87%。實施例3
本實施例的牡丹原生質體提取方法如下步驟
1)取胚已進入成熟期的牡丹種子，用70%的酒精浸泡30s，0.1%的氯化汞滅菌9分鐘， 接種在PH為6. 5的MS培養基中，誘導牡丹成熟胚萌發，其中MS培養基中含有6-苄基腺嘌 呤(6-BA) 1. Omg/L，萘乙酸(NAA) 1. Omg/L，蔗糖5%和瓊脂0. 75% ；也可以採用常規的MS培
養液；
2)取步驟1)萌發10天的下胚軸，切成0.5cm片段，接入pH為6. 5的MS培養基中， 連續繼代兩次，獲得有利於原生質體游離的鬆軟易分散的愈傷組織，其中MS培養基中含有 6-苄基腺嘌呤(6-BA) 1. 5 mg/L, 2,4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) 3mg/L,蔗糖5%和瓊脂0. 8% ； 也可以採用常規的MS培養液；其中愈傷組織的培養採用變溫培養，即在10°C條件下暗培養 10小時，在30°C條件下光照培養15小時；
3)取步驟2)得到的愈傷組織，置於pH為6.5的酶液中採用恆溫搖床18°C震蕩16小時 游離原生質體，其中酶液為含有以下組分及含量的水溶液纖維素酶3%，半纖維素酶1. 0%， 果膠酶2%，甘露醇0. 7mol/L，2- (N-嗎啡啉)乙磺酸(MES) 0. 3%, CaCl2 0. 2 mol/L ；也可以 採用常規的酶液；
4)將游離原生質體後的酶液用800目濾網過濾去除未消化的組織，濾液SOOrpm離心 棄上清液，加入0. 16 mol/L CaCl2洗液，輕輕混勻後，從溶液底部注入28%的蔗糖溶液，500 rpm離心，牡丹原生質體處於上部CaCl2洗液與下部蔗糖溶液之間，棄去上下溶液得到牡丹 原生質體。將取得的原生質體用0. 1%酚藏花紅溶液(在0. 4 mol/L甘露醇中)染色法鑑別原 生質體活力，獲得牡丹原生質體活力達90%。
權利要求
1.一種牡丹原生質體的提取方法，其特徵在於其步驟如下1)取胚已進入成熟期的牡丹種子，酒精浸泡、滅菌，接種在PH為4.8-6. 5的MS培養基 中，誘導牡丹成熟胚萌發；2)取步驟1)萌發5-10天的子葉和/或下胚軸，切碎，接入pH為4.8-6. 5的MS培養基 中，變溫培養連續繼代兩次以上，獲得愈傷組織，所述變溫培養即每天在0-10°C條件下暗培 養8-10小時，在15-30°C條件下光照培養14-16小時；3)取步驟2)得到的愈傷組織，置於pH為4.8-6. 5的酶液中1848°C震蕩12-16小時 游離原生質體，4)將游離原生質體後的酶液用100-800目濾網過濾，濾液離心棄上清液，加入&(12洗 液混勻，然後從溶液底部注入蔗糖溶液，離心取得處於中間部分的牡丹原生質體。
2.根據權利要求1所述的牡丹原生質體的提取方法，其特徵在於步驟1)所述MS培 養基中含有6-苄基腺嘌呤(6-ΒΑ)0. Γ . 0 mg/L，萘乙酸(ΝΑΑ)Ο. 05 1. Omg/L，蔗糖2-5%和 瓊脂 0. 7-0. 8%ο
3.根據權利要求1所述的牡丹原生質體的提取方法，其特徵在於步驟2)所述MS培 養基中含有6-苄基腺嘌呤(6-ΒΑ)0. Γ . 5 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0. 5 3 mg/L, 蔗糖2-5%和瓊脂0. 6-0. 8%。
4.根據權利要求1所述的牡丹原生質體的提取方法，其特徵在於步驟3)所述酶液 為含有以下組分及含量的水溶液纖維素酶1% 3%，半纖維素酶0.59Tl%，果膠酶0.5% 2%，甘露醇 0. 3-0. 7 mol/L，2- (N-嗎啡啉)乙磺酸(MES) 0. 05-0. 3%, CaCl2O. 01-0. 2 mol/ L0
5.根據權利要求1所述的牡丹原生質體的提取方法，其特徵在於步驟4)所述蔗糖濃 度為12-沘％。
全文摘要
本發明公開了一種牡丹原生質體的提取方法，首先誘導牡丹種子萌發，取5-10天的子葉和/或下胚軸，培養愈傷組織，培養過程中採用變溫培養，即每天在0-10℃條件下暗培養8-10小時，在15-30℃條件下光照培養14-16小時；然後用酶液從愈傷組織中游離原生質體，再分離、提純得到牡丹原生質體。本發明牡丹原生質體的提取方法，對牡丹種子的萌發及愈傷組織的培養採用變溫培養，時常變溫使組織細胞在冷熱交替的刺激下，變得疏鬆易分散，有利於原生質體在游離過程中保持較高的活力，得到高活力的牡丹原生質體，最終提取得到的牡丹原生質體經染色法鑑別其活力在85%以上，適合採用突變、轉基因和細胞融合等遺傳操作誘導新品種。
文檔編號C12N5/04GK102120981SQ201010566240
公開日2011年7月13日 申請日期2010年11月30日 優先權日2010年11月30日
發明者史國安, 孔祥生, 張改娜, 江志華 申請人:河南科技大學