培養原生質體的方法
2023-09-20 16:55:10
專利名稱:培養原生質體的方法
本發明講的是一種培養原生質體的方法。更明確地是本發明講的是在一種液體介質中培養原生質體的方法，利用這種方法從原生質體衍生出一種愈傷組織或細胞簇。
原生質體是植物、細菌、真菌等等的脫去細胞壁的細胞。因為原生質體沒有細胞壁，它易於受到諸如細胞融合、基因控制及人工體細胞突變這樣的人工操作。這樣，假如一種完全植物可由被操作的原生質體再生，那麼得到一種具有野生型植物所沒有的有利的特性的植物將是可能的。一種完全植物可由愈傷組織或細胞簇再生，這對許多植物來說都是已知的。這樣，如果一種愈傷組織能由原生質體衍生出來，一株完全植物看來能由愈傷組織再生，依次地能由原生質體再生。
對於象菸草這樣的雙子葉植物，有些技術是已知的，一種完全植物可用這些技術從原生質體再生出來。但對象稻子、小麥和玉米這樣的禾本科植物，據報導僅有玉米和牧草能再生完全植物。至於稻子很少數的技術已有報導如下所述。原生質體的常規培養方法包括把原生質體埋在半固體瓊脂介質中，把原生質體懸浮在液體介質中以及用餵養細胞來培養原生質體的原生質體培養法。但是，已經發現這些技術對培養其它植物象稻子、小麥和玉米的禾本科植物常常沒有什麼效果。例如，如果稻子的原生質體用這些方法中的一種來培養，原生質體就死亡或不生長。
至於稻子的原生質體的培養技術已有報導，由缺乏其硝酸鹽還原酶的細胞得到的一種原生質體衍生出來一個愈傷組織(Wakasa等，J.Plant Physiol，117PP223-231(1984))，一個苗是由一種愈傷組織再生來的，這種愈傷組織是由花粉的愈傷組織得到的原生質體衍生來的(Ohno等，Japanese Journal Of Breeding 35PP54-55(1985))。然而，這些技術利用從特定的愈傷組織釋放出的原生質體，而且這些技術並不是對從各種愈傷組織或組織釋放的各種原生質體都適用的。換言之，這些技術並不是對大多數種類的原生質體都有重複性。
另一方面，許多研究人員已報告說完全植物已從稻子的培養細胞再生來(Nishi等，Nature 219PP.508-509(1968))。然而這些技術並不使用原生質體。此外，已經發現從在這些技術中所使用的具有高度分化能力的細胞得到一種原生質體是困難的，而且培養這種原生質體也是困難的。
這樣，就需要建立一種從原生質體衍生一種愈傷組織或細胞簇的培養原生質體的方法，這種方法對於來源於一種植物的一般的或非特異的細胞的原生質體是有重複性的和可應用的。
因此，本發明的目的是根供一種由原生質體衍生出細胞簇或愈傷組織的培養原生質體的方法，這種方法對於那些從一種植物的普通的或非特異細胞產生的原生質體是有重複性的和可應用的。
在本發明的方法中，原生質體是在一層100到400微米厚的液體介質中培養的。用本方法，原生質體是在稍微有氧條件下培養的。本發明人已經發現這種有氧條件促進了原生質體的生長。
根據本發明的方法，不僅是雙子葉植物的原生質體，甚至單子葉植物的原生質體也能很好地生長而形成愈傷組織或細胞簇。
如上所述，按照本發明的方法，原生質體是在大約100至400微米厚的一層液體介質中培養的，200至300微米更好些。按照本發明的方法，原生質體是在稍微需氧的條件下培養的，這種需氧條件被認為是促進原生質體的生長。如果液體介質的厚度大於400微米，對原生質體所供的氧就變得不充足了。如果小於約100微米，原生質體將受到液體-空氣界面的不利影響。
由於液體的表面張力，要形成這樣一種液體介質的薄層可能是困難的。也就是說如果將小量液體介質放在一個塑料陪替氏培養皿或類似物中，由於它們表面張力介質就變成球狀水珠。本發明人把液體介質放在親水支持體上，從而減少了液體介質的表面張力而完成了製作這樣一種液體介質的薄層。較好的親水支持體包括瓊脂、藻酸及其鹽類以及明膠。這樣把液體介質放在底部表面塗有親水支持體的陪替氏培養皿中就能形成液體介質的薄層。由於親水支持體象原生質體一樣吸收培養介質，最好是親水支持體的厚度能儘可能的薄。這樣，親水支持體令人滿意的厚度不大於1毫米，最好不大於200微米。另一可取的是親水支持體含有象蔗糖、甘露醇及葡萄糖這樣的滲壓劑。此外，親水支持體可以含有植物激素、維生素和其它營養品，這些可象下面介紹的那樣加到液體介質中去。
任何一種常規用於培養原生質體的介質都可以在本發明的方法中使用。例如，如果培養的原生質體為稻的原生質體(屬於稻屬的植物，象Oryza sativa，Oryza glaberrima和Oryza peren-nis等等)，MS介質(Murashige和Skoog，Physiol.Plant 15 PP.473-479(1962))、B5介質(Gaborg等，Exp.Cell Res.50.PP.151-158(1968))、N6介質(Chu等，Scientia Scinica 18 PP.659-663(1975))及R2介質(Ohira等，Plant Cell Physiol.14，PP.1113-1121(1973))都可用作培養介質。同樣，如果所培養的是矮牽牛屬植物的一種原生質NT介質(Nagata和Takebe，Planta 99，PP.12-20(1971))可以使用。介質可以含有象2，4-二氯代苯氧乙酸(以下稱2，4-D)、苄基腺嘌呤、激動素、玉米素、赤黴素及脫落酸這樣的植物激素，菸酸、硫胺素及維生素B6這樣的維生素，蔗糖和甘露醇這樣的糖類和糖醇類以及其它營養品，這些都是常規地加到為培養原生質體的培養介質中的。這些添加劑的濃度可以根據要培養的原生質體的性質和添加劑的性質而適當選擇，例如可為0.1到10毫克/升。本發明人還發現如果介質中含有一種使用過的介質，細胞或原生質體預先在這種介質中培養過，則可進一步促進原生質體的生長。此外，最好把介質的pH調到不大於5.2，更為理想的是3.5-5.2。
培養條件本身可以是常規的，這樣，培養條件可以根據要培養的原生質體的性質作適當選擇。例如，如果要培養的原生質體是稻的原生質體，培養溫度可以是20到30℃，最好是大約26℃，液體介質中原生質體的細胞濃度可以是104到107/毫升，最好是105到5×106/毫升。
本發明的方法可用來培養以任何方法所製備的原生質體。已知有許多釋放各種植物的原生質體的方法。如果要培養的原生質體是稻的一種原生質體，例如，原生質體可以得自以酶溶液處理的稻的愈傷組織，這種酶溶液含有0.1到10%(重量)的纖維素酶(最好是1到5%);0.1到5%(重量)的浸解酶(最好是0.5到2%)，0到5%(重量)的氯化鈣(最好是0.1到1%)，0到5%(重量)的葡聚糖硫酸酯的鉀鹽(最好是0.1到1%)。
本發明在參考以下實例時將更容易理解。應予注意的是，提出以下實例的目的僅在於說明，發明的範圍決不受其限制。
實例1-稻的原生質體的培養原生質體的製備將稻種(稻栽培品種，品種Nihonbare)在70%的乙醇溶液中浸泡一分鐘，再於次氯酸鈉水溶液(氯含量為5%重量比)中浸泡15分鐘。然後將種子用消毒過的蒸餾水洗三遍，播種在含有0.3%(重量)的酪蛋白水解物、2ppm的2，4-D和1ppm的苄基腺嘌呤的N6瓊脂介質上。在26℃下培養三周後，從種子的盾片生成愈傷組織，這些愈傷組織在同樣條件下每四周再進行一次傳代培養。
將這樣得到的愈傷組織懸浮在含有0.3%(重量)的酪蛋白水解物和1ppm的2，4-D的R2液體介質中。細胞於每周進行一次傳代培養。傳代培養後5至7天所得到的細胞簇在下一步中用於製備原生質體。
這樣得到的細胞簇用含有4.0%(重量)的纖維素酶OnozukaRS(可由Yakult藥品公司購得)、1.0%(重量)的浸解酶R-10(可由Yakult藥品公司購得)、0.5%(重量)的氯化鈣、0.5%(重量)的葡聚糖硫酸酯鉀鹽及作為滲壓劑的0.4摩爾的甘露醇的溶液處理。然後將細胞於27℃下在此溶液中輕輕振蕩6小時以得到原生質體，再將含原生質體的酶溶液過濾以除去未消化的細胞簇，將濾液以50g離心5分鐘以沉澱原生質體。沉澱的原生質體以0.4摩爾葡萄糖的水溶液洗三遍並在下一步中培養。
以親水支持體塗布容器的底表面將直徑為35毫米的塑料陪氏培養皿用作培養介質的容器。每一陪氏培養皿的底表面用大約100微升含有作為基本介質的R2介質、R5介質中的維生素和0.4摩爾蔗糖的0.8%瓊脂(Difco公司製造)塗布，以形成一約100微米厚的瓊脂層。
培養稻的原生質體的培養介質的配方由稻(稻栽培品種，品種Sasanishiki)的種子的未成熟的胚胎中衍生出來的愈傷組織放在含有0.3%重量比的酪蛋白水解物和1ppm的2.4-D的R2液體介質中培養。將10毫升培養液加至20毫升同樣成分的新鮮介質中再繼續進行一周一次的傳代培養。將傳代培養後4至7天的傳代培養物過濾以除去細胞。將50微升100ppm的2.4-D、1.37克蔗糖及痕量維生素加至10毫升這樣得到的濾液中，以0.1NHCl把濾液的PH調至4.5。將介質再以膜過濾器過濾以進行消毒，在下一步中用作培養原生質體的介質。
向每一個如上所述的底表面以瓊脂塗布的陪氏培養皿中，加入40至400微升如上所述得到的，含有106原生質體/毫升的介質，並均勻地鋪開，從而形成一層50至500微米厚的液體介質層。將陪氏培養皿密封后，在26℃的暗處培養30天。細胞簇的形成用一倒置顯微鏡觀察。結果見表1。
-無細胞簇形成+形成了一些細胞簇++形成了數百個細胞簇如表1所示，當液體介質的厚度為100至400微米時，觀察到了細胞簇的形成，使用200至300微米厚的液體介質時會得到特別好的結果。
實例2-胡蘿蔔的原生質體的培養由含0.1ppm2.4-D的液體介質中培養的胡蘿蔔下胚軸衍生出的愈傷組織，用含有2%(重量)的纖維素酶Onozuka R-10、1%(重量)的浸解酶R-10、2%(重量)的Driselase(可由Kyowa Hakko公司購得)、0.5%(重量)的氯化鈣及0.7摩爾的甘露醇的溶液來處理。將此混合物於26℃下輕搖3小時以釋放原生質體後再以300篩孔的尼龍篩過濾以除去未消化的細胞簇。濾液在100×g離心5分鐘以沉澱原生質體。沉澱下的原生質體以0.5摩爾甘露醇洗三次。
將這樣得到的原生質體懸浮於含有1ppm2.4-D和0.5摩爾甘露醇的液體介質中，細胞濃度為105/ml。按實例1的作法將含有MS介質的組分和0.5摩爾甘露醇的0.8%的瓊脂塗布在35毫米直徑的塑料陪氏培養皿內。將300微升上面得到的懸浮液加至此陪氏培養皿內並均勻地鋪開。於26℃的暗處進行培養20天。計算生成的細胞簇數，作為對照，將前面的懸浮液加至同樣的陪氏培養皿中，但不用瓊脂塗布培養皿，原生質體也以同樣方式培養。在此情況下懸浮液由於它的表面張力不均勻地鋪開而變成小珠。計算生成的細胞簇。結果見表2。
+形成了數十個細胞簇++形成了數百個細胞簇如表2所示，由於將細胞懸浮液均勻地鋪在瓊脂塗層上，這樣所生成的細胞簇比把細胞懸浮液加到未塗層的陪氏培養皿中要多得多，懸浮液在未塗層的陪氏培養皿中變成了小珠。
實例3-矮牽牛屬植物原生質體的培養將在溫室中生長的矮牽牛屬植物的成熟葉子在70%乙醇溶液中浸泡10秒鐘，然後在0.5%次氯酸鈉水溶液(含氯量為0.5%重量)中浸10分鐘以進行消毒。將葉子以無菌蒸餾水洗三次後，把葉子切成1毫米寬的碎片。取0.5克這樣得到的切碎的葉片加至一含有1%(重量)的纖維素酶Onozuka R-10、0.3%(重量)的浸解酶R-10和0.4摩爾的甘露醇的溶液中，將此混合物於26℃下輕輕振蕩5小時以釋放原生質體。再將混合物以250篩孔的尼龍篩過濾以除去未消化的細胞簇。濾液在100×g離心5分鐘以沉澱原生質體。沉澱下的原生質體以0.4摩爾的甘露醇洗三遍。
將這樣得到的原生質體懸浮在含有1ppm的2.4-D、0.4ppm的苄基腺嘌呤、50毫摩爾糖和0.3摩爾的甘露醇的NT介質中，細胞濃度為105/毫升。將一直徑為35毫米的塑料陪氏培養皿按實例1中的方式用含NT介質組分的0.8%瓊脂塗層。將300微升上面的懸浮液加至此陪氏培養皿中並均勻鋪開。在26℃的暗處進行培養20天，數出所生成的細胞簇數。作為對照，將上面所說的懸浮液加至相同的陪氏培養皿中但不用瓊脂塗層，原生質體按同樣方式培養。在這種情況下，懸浮液不是均勻地鋪開而是由於它的表面張力而變成小珠。數出所生成的細胞簇數。結果示於表3。
+生成了數十個細胞簇++生成了數百個細胞簇如表3所示，由於將細胞懸浮液均勻地鋪在瓊脂塗層上，比把細胞懸浮液加至未塗層的陪氏培養皿中生成的細胞簇要多得多，懸浮液在未塗層的陪氏培養皿中變成了小珠。
權利要求
1.一種培養原生質體的方法特徵在於包括在大約100至400微米厚的液體介質層中培養原生質體。
2.按權利要求
1的方法，其中液體介質層的厚度約為200至300微米。
3.按權利要求
1的方法，其中液體介質層放在一種親水支持體上。
4.按權利要求
3的方法，其中親水支持體是由瓊脂、藻酸及其鹽類以及明膠中選出的一種。
5.按權利要求
4的方法，其中親水支持體的厚度不超過1毫米。
6.按權利要求
5的方法，其中親水支持體的厚度不超過200微米。
7.按權利要求
1的方法，其中原生質體是稻、胡蘿蔔或牽牛屬植物的原生質體。
8.按權利要求
7的方法，其中原生質體是稻的一種原生質體。
9.按權利要求
8的方法，其中稻是Oryza sativa。
10.按權利要求
8的方法，其中介質包括它的基本介質R2、N6、Ms或B5介質。
11.按權利要求
9的方法，其中介質還包括0.1到10毫克/升的2，4-D。
專利摘要
本文敘述是一種在一液體介質中培養原生質的方法。按照本發明的方法，原生質體是在厚約100至400微米的液體介質層中培養的。
文檔編號C12N5/10GK86103374SQ86103374
公開日1986年11月26日 申請日期1986年5月21日
發明者藤村達人, 櫻井基 申請人:三井東化學株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan