一種實時螢光rt-pcr檢測脊髓灰質炎病毒的試劑盒的製作方法
2023-09-20 10:06:30
專利名稱：一種實時螢光rt-pcr檢測脊髓灰質炎病毒的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及脊髓灰質炎病毒檢測技術，具體地說，涉及一種實時螢光RT-PCR檢測脊髓灰質炎病毒的試劑盒。
背景技術：
脊髓灰質炎(poliomyelitis)是一種古老的疾病，是由脊髓灰質炎病毒引起的一種急性傳染性疾病，其臨床表現多種多樣，主要有發熱、咽痛和肢體疼痛等，部分病人可發生弛緩性麻痺。脊髓灰質炎病人，由於脊髓前角運動神經元受損，與之有關的肌肉失去了神經的調節作用而發生萎縮，同時皮下脂肪，肌腱及骨骼也萎縮，使整個機體變細。流行時以隱匿感染和無癱瘓病例為多。由於兒童發病比例較成人為高，在普種疫苗前以嬰幼兒患病為主，故又稱小兒麻痺症(Infantile paralysis)。人是脊髓灰質炎病毒唯一的自然宿主，本病通過直接接觸傳染，是一種傳染性很強的接觸性傳染病，隱形感染者以及輕症癱瘓型病人是本病的主要傳染源，在大規模流行時，隱性感染與臨床病例的比例超過100:1。脊髓灰質炎病毒以糞-口感染為主要傳播方式，發病前3飛天至發病後1周患者鼻咽部分泌物及糞便均可排出病毒，少數病倒糞便帶毒時間可長達3、月；密切生活接觸，不良衛生習慣都可導致病毒的大面積擴散。脊髓灰質炎的感染以隱性感染(佔99%以上)為主，以發熱，咽痛，肢體疼痛等非特異性症狀為主要臨床表現，嚴重可以出現癱瘓以及機體萎縮等前角神經元受損的症狀。癱瘓病例中，90%以上發生於5歲以前。經濟發達的國家和地區環境衛生和個人衛生習慣的進步導致感染的年齡往往推遲，年長兒和青年人仍然是易感者，目前夏季流行在年長小兒中呈現一定的上升趨勢。本病廣泛分布於全世界，溫帶地區流行高峰在5 10月，熱帶地區終年可見。1988 年世界衛生組織提出2000年全球消滅脊髓炎，1989年又提出消滅本病的行動計劃，由於減毒活疫苗的應用，發病率已明顯下降。雖然我國已經響應世界衛生站組織號召進行了強制接種免疫，但是我國仍為流行地區。且近些年來，脊髓灰質炎減毒疫苗突變導致的脊髓灰質炎感染事件時見報導，而水產食品以及蔬菜引發的脊髓灰質炎病毒感染已經引起食品安全部門的關注。脊髓灰質炎病毒的核酸為單股正鏈RNA，已知基因組的長度約為7. 5kD。按其抗原性不同，將脊髓灰質炎病毒分為1、2、3等3個血清型。它們的理化性質基本相同，RNA的鹼基組成也很相似。以上3個血清型的病毒RNA之間在核苷酸水平上有36% 52%的同源性。三種血清型的病毒都可以致病，其中導致癱瘓病例的主要是1型。脊髓灰質炎初起時與傷風感冒相類似，與其他病毒(柯薩奇病毒、埃可病毒、EB病毒、流行性腮腺炎病毒、淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒、流行性乙型腦炎病毒)感染所致的腦膜炎、化膿性腦膜炎、結核性腦膜炎、真菌性腦膜炎以及腦膜炎型鉤端螺旋體病等相鑑別。以及感染性多發性神經根炎或稱格林-貝爾症候群(Guillain-Barre 『 s syndrome)臨床不易鑑別。目前對於脊髓灰質炎的臨床實驗室檢測主要分為三種，包括病毒分離培養，血清學檢測以及核酸檢測，其中以血清學和核酸檢測為主要手段，血清學檢測的診斷指標為發病後1個月內從患者腦脊液或血中查到抗脊髓灰質炎病毒IgM抗體者；或恢復期患者血清中特異性IgG抗體滴度比急性期有4倍升高者；或腦脊液中特異性IgG抗體明顯升高，血液與腦脊液IgG抗體滴度比例失常或倒置(在血腦屏障無損傷時，血腦脊液為200—400 1)者均有診斷價值。相對來說抗體的產生雖然具有診斷價值，但是對感染的早期判斷一般採取更敏感快速的PCR方法進行診斷。近幾年國內外相繼報導了檢測PVs的巢式rt-PCR、常規RT-PCR等快速檢測方法，隨著分子生物學技術的發展，實時螢光PCR技術已廣泛應用於病毒特徵性核酸的檢測。 實時螢光PCR技術是近年來發展迅速的一種核酸檢測技術，使用一種帶有核電偶聯裝置 (CCD)的PCR擴增儀，通過檢測螢光信號的動態變化實時反映PCR的每個循環的擴增水平。CCD能夠按照一定的程序周期性地發出特定波長的激發光，收集檢測螢光信號，並通過軟體分析匯總到工作站得到擴增曲線。一步法實時螢光RT-PCR技術是實時螢光PCR的一種 (Martel 1, M. , J. Gomez, J. Esteban, S. Sauleda, J. Quer, B. Cabot, R. Esteban, and J. Guardia. 1999. High-throughput real-time reverse transcription—PCR quantitation of hepatitis C virus RNA. J. Clin. Microbiol. 37:327 - 332；Lee Cff, Suarez DL. 2004. Application of real-time RT-PCR for the quantitation and competitive replication study of H5 and H7 subtype avian influenza virus. J Virol Methods. 119 O) : 151-8。)，它是一種直接快速檢測RNA的方法，與檢測DNA的實時螢光PCR相比，不同之處在於前者在反應體系中增加了逆轉錄酶，同時多了一個逆轉錄反應步驟；相同之處在於兩者在反應體系中均有一條兩端分別標記螢光報告基團和淬滅基團的探針，探針結構完整時，螢光報告基團發出螢光的能量轉移給淬滅基團，呈現淬滅效應。 如果擴增過程中有靶序列的存在，擴增的過程中探針分子逐漸被水解切斷，螢光報告基團與淬滅基團相互解離，阻斷了二者間螢光共振能量轉移效應，螢光報告基團發出螢光信號。 隨著擴增的進行，螢光信號隨著目的片段的擴增而呈現線性增強。傳統的RT-PCR由兩個單獨的反應程序或步驟完成，第一步是通過逆轉錄酶作用， 將RNA逆轉錄成cDNA ；第二步是在Taq酶作用下，以第一步中形成的cDNA為模板進行PCR 擴增。與傳統的RT-PCR相比較，一步法實時螢光RT-PCR技術具有如下優點1、將逆轉錄和 PCR擴增兩個在不同反應管中分開進行的二個反應程序合併成一個反應程序，在一個PCR 反應管中完全閉管完成檢測過程，大大節省了反應時間；2、通過對擴增曲線以及對數增長期的循環閾值(Ct)的分析，摒棄普通PCR方法受多種因素幹擾的終點分析方法，能夠對檢測樣品進行準確定量分析，從而有效監測藥物治療的效果；3、將RNA逆轉錄、DNA擴增與檢測三過程融合為一體，可以實時、動態監測RNA擴增的全過程，省掉了 PCR產物後處理過程， 大大縮短了結果分析時間，使得該方法更加快捷、方便；4、由於採取一種封閉的檢測模式， 從而減少了氣溶膠汙染和由此造成的假陽性；5、由於在普通RT-PCR基礎上增加了一條可與模板互補配對的螢光探針，進一步提高了檢測靶多核苷酸的特異性。因此，該技術在RNA 樣品的檢測和分析中，已逐漸取代傳統的RT-PCR方法，得到十分廣泛的應用。我國食品與藥品管理局(SFDA)已經批准了諸如Hiv-l、HCV等病原體的一步法實時螢光RT-PCR檢測試劑盒的生產與臨床應用。因此，通過一步法實時螢光RT-PCR方法開發一種檢測脊髓灰質炎病毒的試劑盒在技術上是可行的，它的應用將極大滿足脊髓灰質炎病毒快速檢測與監測工作的需要。眾所周知，在使用已知的一步法實時螢光RT-PCR技術檢測和定量分析樣品中某特定靶核酸的實踐中，為了減少和避免檢測結果的假陰性或假陽性，提高定量分析的準確性，一個關鍵性的基本技術環節是如何基於已知的靶多核苷酸序列設計、篩選及製備適當的引物和寡核苷酸探針。本發明人在此基礎上利用一步法實時螢光RT-PCR技術發明了一種檢測脊髓灰質炎病毒的試劑盒，應用於脊髓灰質炎病毒的檢測和分析。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種能提高定量分析的準確性的實時螢光RT-PCR檢測脊髓灰質炎病毒的試劑盒。為了實現上述目的，本發明採用如下技術方案
1)使用適當的核酸分析軟體分別對已知的脊髓灰質炎病毒POl基因的核苷酸序列進行同源性比較，通過嚴格的比對分析，在找出同源區段的基礎上，進一步使用適當的引物設計軟體(例如Primer Express 3)選擇並設計寡核苷酸引物和探針。由於所設計的引物和探針均具有互補於脊髓灰質炎病毒的序列，而且與其他病原體的核苷酸序列沒有同源性， 也不包括任何常見的核酸內切酶的酶切位點，所以避免了脊髓灰質炎病毒檢測的假陰性和假陽性，提高了檢測的可靠性和準確度。初步選擇引物探針之後我們將引物探針分別進行進一步的序列比對，通過比對工具(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/) 的blastnr中進行同源性檢索,棄掉與基因組其它部分同源性比較高的引物，也就是有可能形成錯配的引物。尤其選取跟脊髓灰質炎病毒同源性較高的腸道病毒序列進行進一步比較，完全排除3 『端的同源性，確保引物探針的特異性。2)使用DNA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物，用分子篩和快速蛋白質液相層析法(FPLC)純化後進行氨解處理。同樣合成所需的探針序列，氨解處理後分別在其5』端標記作為螢光發生基團(報告基團)的6-FAM amidite,並在其3』端標記藉助活性連接臂偶聯上作為螢光淬滅或抑制基團的BHQ。以FPLC層析法純化螢光標記的探針。然後，使用變性條件下的聚丙烯醯胺凝膠(20%)電泳法和分光光度法物理鑑定所合成的引物和探針。3)適宜於一步法實時螢光RT-PCR擴增的反應體系。反應體系包括逆轉錄酶、熱啟動Taq酶、2』 -脫氧核苷三磷酸、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結合的正向引物、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結合的反向引物、能夠與靶多聚核苷酸結合併且兩末端分別結合有螢光發生基團和螢光淬滅基團的寡核苷酸探針、含有鎂離子的緩衝液。4)從待測樣本中提取RNA，分別加入前述的反應體系中，直接經一步法RT-PCR擴增，從螢光擴增曲線判斷是否存在脊髓灰質炎病毒。本發明所得實時螢光RT-PCR檢測脊髓灰質炎病毒的試劑盒，包括RNA提取試劑、 脊髓灰質炎RT-PCR反應體系、陰性質控品和陽性質控品；所述脊髓灰質炎RT-PCR反應體系包括脊髓灰質炎引物探針混合液、RT-PCR反應液和RT-PCR酶系；所述脊髓灰質炎引物探針混合液中脊髓灰質炎正向引物的序列為5』-GATGATTGCCTATGGTGATGATG-3' (SEQ NO. 1)，脊髓灰質炎反向引物的序列為5』_ TCCTGATTGGGCTAGGAGACT -3，(SEQ NO. 2);所述脊髓灰質炎引物探針混合液中正、反向引物向5』和3』端方向各延伸10個鹼基。所述脊髓灰質炎引物探針混合液中脊髓灰質炎寡核苷酸探針的序列為
5』- AATTGCATCCTACCCCCATGAGGTTGAC -3』 (SEQ NO. 3)；
在上述試劑盒中，所述脊髓灰質炎正、反向引物的濃度均為5 15 pmol/反應，探針的濃度為5 15 pmol/反應。在上述試劑盒中，所述RT-PCR酶系由逆轉錄酶、熱啟動Taq酶、RNasin, dNTPs和酶系稀釋液組成。所述逆轉錄酶用量為1. 5 3. 5U/反應、熱啟動Taq酶用量為3 7U/ 反應、RNasin用量為15 25U/反應、dNTPs濃度為0. 20mmol/L。在上述試劑盒中，酶系稀釋液為一般市售的酶系稀釋液；陰性質控品為生理鹽水； 脊髓灰質炎陽性質控品為含有脊髓灰質炎基因序列的重組假病毒，假病毒通過市售的逆轉錄病毒包裝系統構建而成。相對於利用質粒DNA作為陽性模版的標準品來說，由逆轉錄病毒構建的陽性指控品完全模擬了實際情況，為衣殼和包膜包裹的RNA片段，可以為實驗的全過程，包括病毒核酸的提取，RNA至DNA的逆轉錄，以及最後的核酸擴增進行陽性參照。陽性質控品濃度均為IX IO6拷貝/ml。在上述試劑盒中，所述RT-PCR反應液包括一步法RT-PCR反應緩衝液和DEPC水， 其中一步法 RT-PCR 反應緩衝液包含 10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)、150 mmol/L KCl, 2. Ommo 1/L MgCl20在上述試劑盒中，其中用於PCR擴增的最佳反應溫度和時間為50°C逆轉錄 15min，1個循環；94°C lOmin，1個循環；最後95°C 15s，55 60°C 45s，45個循環(收集熒
光信號)。在上述試劑盒中，試劑盒的待檢樣品優選是糞便、腦脊液及血清等樣品。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明提供了使用一步法實時螢光 RT-PCR技術檢測樣品中脊髓灰質炎病毒的試劑盒，其基本原理是利用一對寡核苷酸的特異性引物和一條寡聚核苷酸的特異性探針，在逆轉錄酶(RT酶)、熱啟動Taq酶、RNA酶抑制劑 (RNasin)、高質量的脫氧核糖核苷三磷酸(dNIPs)以及Mg2+等RT-PCR反應緩衝液中，通過 DA7600、ABI7500等市售的螢光PCR擴增儀實現靶多核苷酸的循環擴增，從而達到快速、實時、定量檢測靶多核苷酸的目的。本發明分別針對脊髓灰質炎病毒Pol基因設計特異性引物和探針，可檢測出脊髓灰質炎病毒，包括I、II、III型，但不能檢測出腸道病毒EV71，科薩奇病毒Α16，乙型腦炎病毒，流感病毒A型，流感病毒B型，埃可病毒樣本或其他呼吸道病原體樣本，說明本試劑盒具有很好的特異性。本發明提供的一步法實時螢光RT-PCR檢測試劑盒可以檢測糞便、腦脊液及血清等樣品中的脊髓灰質炎病毒；可為靈敏、快速早期診斷脊髓灰質炎病毒感染提供可靠的實驗證據。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過本發明的試劑盒實現對咽拭子、鼻咽分泌物等呼吸道樣本以及血清等樣品中的脊髓灰質炎病毒進行早期快速診斷。本試劑盒可以檢測出脊髓灰質炎病毒的最低濃度為1.0Χ102 copies /ml，說明本試劑盒具有非常好的靈敏度。
圖1顯示脊髓灰質炎陽性質控品和陰性質控品的檢測結果。從左到右曲線分別代表，脊髓灰質炎病毒II型，I型，III型，以及陽性質控品，陰性質控品未見曲線。陽性質控品擴增曲線有明顯指數增長期，成S型，可明確判定為陽性。陰性質控品擴增曲線平直或斜向下且與基線無交叉，沒有Ct值，可明確判定為陰性。圖2顯示特異性參考品的檢測結果。以腸道病毒EV71，科薩奇病毒A16，乙型腦炎病毒，流感病毒A型，流感病毒B型、埃可病毒感作為特異性參考品；以去離子水及健康人血清作為陰性質控品，結果顯示均為陰性結果；6份特異性參考品的擴增曲線平直或斜向下且與基線無交叉，沒有Ct值，可明確判定為陰性。圖3顯示靈敏度參考品的檢測結果。從左到右曲線分別為1. OXlO5 copies /ml、1. OXlO4 copies /mlU. OXlO3 copies/mlU. OXlO2 copies /mlU. OXlO1 copies /ml 的含有脊髓灰質炎病毒假病毒組成靈敏度參考品，生理鹽水作為陰性對照未見曲線。5份靈敏度參考品中除了濃度為 1.0X101 copies /ml的脊髓灰質炎假病毒樣品外擴增曲線平直或斜向下且與基線無交叉， 沒有Ct值，可明確判定為陰性。其餘樣本均可明確判定為陽性。
具體實施例方式下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發明。實施例1 脊髓灰質炎病毒檢測試劑的研製
1、引物和探針的設計通過對已報導脊髓灰質炎病毒的核酸序列進行序列比對分析， 以脊髓灰質炎病毒Pol基因為擴增靶位點，選擇無二級結構且高度保守的區段，根據引物探針設計的基本原則，利用軟體和人工設計多對引物和探針。2、臨床樣本的選擇根據國內外相關文獻報導表明，可以糞便、腦脊液及血清等樣
P
ΡΠ
3、反應體系的建立與優化
樣品的準備以構建的含有目的擴增區域的假病毒作為脊髓灰質炎病毒檢測的陽性質控品；以腸道病毒EV71，科薩奇病毒A16，乙型腦炎病毒，流感病毒A型，流感病毒B型、埃可病毒感作為特異性參考品；以去離子水及健康人血清作為陰性質控品，分別提取上述陽性質控品與特異性參考品的RNA，陰性質控品待用。引物探針的篩選以上述1中設計的多組引物探針分別檢測上述的陽性質控品與陰性參考品的RNA，經反覆試驗，篩選出特異性、靈敏度和重複性好的最佳引物探針組合。 (如序列表中 SEQ ID NO 1 SEQ ID NO :3)。引物探針濃度的優化在反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從2pmol/ 反應至15pmol/反應梯度的引物和從2pmol/反應至15pmol/反應濃度梯度的探針進行PCR 反應，經多次重複試驗發現引物和探針濃度在5 15 pmol/反應之間均可，其中最佳的引物濃度為5pmol/反應、探針濃度為5pmol/反應。鎂離子濃度的優化在反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從lmmol/L 至2. 5mmol/L濃度梯度的鎂離子進行PCR反應，經多次重複試驗，最終確定最佳的鎂離子濃度為 2. Ommol/Lο
熱啟動Taq酶用量的優化在25 μ L反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從IU (酶單位)至8U濃度梯度的酶用量/反應進行PCR反應，經多次重複試驗，最終確定最佳的熱啟動Taq酶用量為3 7U/反應。RT酶用量的優化在25 μ L反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從IU(酶單位)至8U濃度梯度的酶用量/反應進行PCR反應，經多次重複試驗，最終確定最佳的RT 酶用量為1. 5 3. 5U/反應。RNasin用量的優化在25 μ L反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從5U (酶單位)至40U濃度梯度的酶用量/反應進行PCR反應，經多次重複試驗，最終確定最佳的 RNasin用量為15 25U/反應。dNTPs濃度的優化在反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從0. lmmol/L 至0. 25mmol/L濃度梯度的dNIPs進行PCR反應，經多次重複試驗，最終確定最佳的dNIPs 濃度為 0. 20mmol/Lo反應溫度的優化根據酶的活性和靶多核苷酸的長度，主要對退火溫度和延伸時間進行了優化，經多次重複試驗，最終確定最佳的反應溫度和時間為50°C逆轉錄15min，l 個循環；94°C 10min，l個循環；最後95°C 15s，55 60°C 45s，45個循環(收集螢光信號)。實施例2 脊髓灰質炎病毒檢測試劑盒及其使用
1、製備包括下列組成成分的試劑盒RNA提取液(50ml /管)1管、脊髓灰質炎引物探針混合液(50 μ 1/管)1管、RT-PCR反應液(720 μ 1/管)1管、RT-PCR酶系(150 μ 1/管)1 管，陰性質控品(200 μ 1/管)1管，脊髓灰質炎陽性質控品1管。2、標本採集、運送和保存
由臨床醫師根據實際情況進行標本採集，可檢測的標本包括，咽拭子、鼻咽分泌物、血清。採集方法如下①糞便樣品取適量標本按比例製備樣品懸液，離心取上清，密封保存， 低溫送檢；②腦脊液採集時間為出現神經系統症狀後3d內，採集量為1. 0 2. Oml0採集後立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4°C下送達實驗室，-20°C以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存於_70°C以下冰箱。；③血清無菌採集靜脈血約1ml，分別於室溫和4°C靜置2 小時和1小時後，離心(8，000 rpm，5分鐘)分離並收集血清標本。標本可立即用於測試，也可以保存於-70°C待測，保存期為6個月。標本運送採用 0°C冰壺。3、檢測步驟
(I)RNA提取
取上述類型的樣本各100 μ (樣品不足ΙΟΟμΙ時請補加適量生理鹽水重懸)，放置於 1.5ml滅菌離心管，加入200μ1 Trizol試劑及ΙΟΟμΙ氯仿，用振蕩器強力振蕩20秒後靜置 3分鐘；
2 8°C下12，OOOrpm離心lOmin，吸取上清至另一乾淨的1. 5ml離心管；
加入0. 2ml氯仿，蓋緊蓋子，手動用力顛倒搖動15s (不可用振蕩器)，室溫孵育2 3
min ；
2 8°C下12000rpm離心15 min後，取最上層的上清液至另一乾淨的1. 5ml離心管； 加入0. 5ml預冷的異丙醇，緩慢顛倒充分混勻後，一 20°C靜置15min，2 8 °C， 12000rpm離心10 min，小心棄盡上清液；加入Iml預冷的70 %的冰冷乙醇，手動顛倒數次洗滌沉澱，2 8°C，8000rpm離心 5min，小心棄盡上清液；
空氣或真空乾燥5 10 min，加入50μ1 DEPC H2O, 55 60° C下孵育lOmin，手指輕輕彈打管底，使其充分溶解，直接用於實驗或-70°C保存備用。(2) PCR反應與結果分析
分別取脊髓灰質炎RT-PCR反應液17 μ 1.RT-PCR酶系3 μ 1配製成脊髓灰質炎反應體系。取陰性質控品、陽性質控品各5 μ 1，加入脊髓灰質炎反應體系使用市售的螢光定量PCR儀(如ΑΒΙ7500)進行PCR擴增。PCR循環條件是50°C逆轉錄15min，1個循環；94°C 10min，l個循環；最後95°C 15s，55 60°C 45s，45個循環(收集螢光信號)。反應結束後保存檢測數據文件。根據PCR擴增結果所得到的曲線，分析實驗結果。 如擴增曲線有明顯指數增長期，則判定為陽性，否則為陰性。實施例3 應用脊髓灰質炎病毒檢測試劑盒檢測樣品
以實施例1中的陽性質控品、陰性質控品、特異性參考品作為待檢樣本，按照實施例2 的方法分別檢測這些樣本，陽性質控品檢測結果為陽性，陰性質控品和特異性參考品檢測結果均為陰性(參見圖1，2)。實施例4 脊髓灰質炎病毒檢測試劑盒靈敏度實驗
分別由濃度為 1. OXlO5 copies /ml、1. OXlO4 copies /mlU. OXlO3 copies/ml、 1.0X102 copies /ml、l.OXlO1 copies /ml的含有脊髓灰質炎病毒假病毒組成靈敏度參考品，按照實施例2的方法分別檢測這5份樣本，檢測結果表明，本試劑盒的靈敏度為 1. OXlO2 copies /ml (見圖 3)。
權利要求
1.一種實時螢光RT-PCR檢測脊髓灰質炎病毒的試劑盒，包括RNA提取試劑、脊髓灰質炎RT-PCR反應體系、陰性質控品和陽性質控品，其特徵在於，所述脊髓灰質炎RT-PCR反應體系包括脊髓灰質炎引物探針混合液、 RT-PCR反應液和RT-PCR酶系；所述脊髓灰質炎引物探針混合液中脊髓灰質炎正向引物的序列為 5，-GATGATTGCCTATGGTGATGATG-3，，脊髓灰質炎反向引物的序列為5，-TCCTGATTGGGCTAGGAGACT -3』 ；所述脊髓灰質炎引物探針混合液中脊髓灰質炎寡核苷酸探針的序列為5』_ AATTGCATCCTACCCCCATGAGGTTGAC -3』 。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述脊髓灰質炎引物探針混合液中正、 反向引物向5』和3』端方向各延伸10個鹼基。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述脊髓灰質炎正、反向引物的濃度均為5 15 pmol/反應，探針的濃度為5 15 pmol/反應。
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述RT-PCR酶系由逆轉錄酶、熱啟動 Taq酶、RNasin, dNTPs和酶系稀釋液組成。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於，所述逆轉錄酶用量為1.5 3. 5U/ 反應、熱啟動Taq酶用量為3 7U/反應、RNasin用量為15 25U/反應、dNTPs濃度為 0. 20mmol/Lo
6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述陽性指控品為含有脊髓灰質炎病毒檢測靶標的假病毒懸液。
全文摘要
本發明公開了一種實時螢光RT-PCR檢測脊髓灰質炎病毒的試劑盒，包括RNA提取試劑、脊髓灰質炎RT-PCR反應體系、陰性質控品和陽性質控品，所述脊髓灰質炎RT-PCR反應體系包括脊髓灰質炎引物探針混合液、RT-PCR反應液和RT-PCR酶系。本試劑盒能快速、實時、定量檢測靶多核苷酸，可檢測出脊髓灰質炎病毒，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。可以檢測糞便、腦脊液及血清等樣品中的脊髓灰質炎病毒；可為靈敏、快速早期診斷脊髓灰質炎病毒感染提供可靠的實驗證據。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過本發明的試劑盒實現對咽拭子、鼻咽分泌物等呼吸道樣本以及血清等樣品中的脊髓灰質炎病毒進行早期快速診斷。
文檔編號C12R1/93GK102344971SQ20111020069
公開日2012年2月8日 申請日期2011年7月18日 優先權日2011年7月18日
發明者李明, 杜紅延, 陳華雲, 陳瑤, 高秀潔 申請人:南方醫科大學