甘氨酸的測定方法與甘氨酸測定試劑盒的製作方法

2023-09-20 10:16:00 1

專利名稱：甘氨酸的測定方法與甘氨酸測定試劑盒的製作方法
甘氨酸的測定方法與甘氨酸測定試劑盒
技術領域：
本發明涉及食品檢驗測定技術領域，更具體地，本發明涉及甘氨酸測定方法及其試齊U盒。
背景技術：
甘氨酸為非人體必需胺基酸。甘氨酸有獨特的甜味，能緩和酸、鹼味，掩蓋食品中添加糖精的苦味並增強甜味。人體若攝入甘氨酸的量過多，不僅不能被人體吸收利用，而且會打破人體對胺基酸的吸收平衡而影響其它胺基酸的吸收，導致營養失衡而影響健康。甘氨酸不能被人體利用，只能分解轉化為熱能，這樣會增加肝臟負擔。而分解產物中的含氮化合物要通過尿液排出體外，又會增加腎臟負擔。如果大量、長期食用這類食品，可能造成肝腎損傷。部分含乳飲料企業為提高產品中蛋白質含量，在生產加工中違規使用甘氨酸，對青少年及兒童的正常生長發育很容易帶來不利影響。按照我國《食品添加劑使用衛生標準》GB2760規定，甘氨酸在作為食品添加劑只允許在調味劑與豆奶中使用，且最高限量為每公斤1克，但在含乳飲料中不允許使用。

發明內容[要解決的技術問題]本發明的目的是提供一種甘氨酸的測定方法。本發明的另一個目的是提供一種甘氨酸測定試劑盒。[技術方案]本發明是通過下述技術方案實現的。本發明的方法是一種採用二倍擴增法、酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)與酶(偶)聯法(Couple Reaction)的聯用技術，利用測定還原型煙醯胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處的吸光度變化測定甘氨酸的方法。本發明甘氨酸測定方法的的技術原理是根據下述氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶、 輔酶A-穀胱甘肽還原酶的系列催化反應完成 甘氨酸+2輔酶氰化氫合成酶氰化氫+ 二氧化碳+2還原型輔酶二氧化碳+過氧化氫+乙醯輔酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+輔酶A+氧輔酶A+穀胱甘肽+輔酶輔酶A-穀胱甘肽還原酶輔酶A-穀胱甘肽+還原型輔酶本發明的方法利用氰化氫合成酶(hydrogen cyanide synthase ；EC 1.4.99.5) 酶(偶)聯丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase ；EC 1. 2. 3. 6)、輔酶A-穀胱甘肽還原酶 (CoA-glutathione reductase ；EC 1. 8. 1. 10)酶促反應終點法。氰化氫合成酶酶解甘氨酸反應產生二氧化碳，再通過(偶)聯合丙酮酸氧化酶、輔酶A-穀胱甘肽還原酶的作用，最終將輔酶(在MOnm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，這樣可以通過測量340nm處吸光度上升的
5程度，可以測算甘氨酸的濃度大小。本發明是通過下述技術方案實現的。本發明涉及一種甘氨酸的測定方法。該甘氨酸測定方法的步驟如下A、樣品準備A. 1標準樣品的製備將一定量的甘氨酸溶於水或緩衝液中，再將甘氨酸濃度調整到1毫摩爾/升，得到的溶液作為標準樣品；A. 2待測樣品的製備待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像製備標準樣品一樣溶於水或緩衝液中；A. 3空白樣品所述的水或緩衝液作為空白樣品，其甘氨酸濃度為0毫摩爾/升；B、試劑溶液的製備分別移取或稱取緩衝液、穩定劑、輔酶、氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶、輔酶A-穀胱甘肽還原酶、過氧化氫、乙醯輔酶A與穀胱甘肽，然後將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是 20-500mmol/L、0. 001_7mol/L、0. l_5mmol/L、1000-80000U/ L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；C、待測樣品與在步驟B)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制可以不設副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；D、在與步驟C)同樣的條件下測定步驟A)標準樣品的吸光度隨時間的變化；E、在與步驟C)同樣的條件下測定在步驟A)空白樣品的吸光度隨時間的變化；F、數據處理由步驟C-E)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據下式計算得到
甘氨酸的含量
ΔΑ (樣品)-ΔΑ (空白)
甘氨酸含量= -叉標準濃度(mmol/L)
ΔΑ (標準)-ΔΑ (空白)式中Δ A(樣品)表示步驟C)得到的待測樣品的吸光度變化；Δ A(空白)表示步驟Ε)得到的空白樣品的吸光度變化；Δ A (標準)表示步驟D)標準樣品的吸光度變化。根據本發明，在所述的甘氨酸測定方法中，所述的緩衝液應該理解是能夠使其測定介質的PH基本保持穩定(一般是6. 5-8. 5)的溶液。如果該ρΗ高於8. 5或ρΗ低於6. 5， 則該測定方法使用的酶的活性達不到預期的活性效果，因此需要添加更多的介質與酶，才有可能達到預期的活性效果。在本發明中，所述的緩衝液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液、咪唑-鹽酸緩衝液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液、硼砂-鹽酸緩衝液、巴比妥鈉-鹽酸緩衝液、硼酸-硼砂緩衝液、二乙醇胺緩衝液或「PBS」緩衝液的緩衝液。優選地，所述的緩衝液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩衝液、 磷酸鹽緩衝液或「PBS」緩衝液。更優選地，所述的緩衝液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩衝液或磷酸鹽緩衝液。根據本發明，在所述的甘氨酸測定方法中，所述的穩定劑應該理解是一種能保護試劑中的介質(底物)與酶，使其不會隨著時間推移而改變其性質，進而失去活性的物質， 它會使得試劑具備很長的活性壽命，通常長達數月，甚至一、二年。如果沒有所述的穩定劑， 則試劑的活性在溶液中只能維持數十小時，頂多數天，就會逐漸失去活性而不再具備檢測性能。在本發明中，所述的穩定劑使用量是0.01-7mol/L。如果所述的穩定劑使用量不夠， 則試劑活性的壽命就會縮短；如果所述的穩定劑使用量過高，則會增加成本。在本發明中，所述的穩定劑是一種或多種選自硫酸銨、氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉或疊氮鈉防腐劑的穩定劑。優選地，所述的穩定劑例如是一種或多種選自硫酸銨、氯化鈉、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉或疊氮鈉的穩定劑。更優選地，所述的穩定劑例如是一種或多種選自甘油、硫酸銨或雙乙酸鈉的穩定劑。在本發明中，所述的輔酶是一種或多種選自NADP+、NAD+或thio_NAD+的輔酶。根據一種本發明的優選實施方式，本發明使用全自動生化分析儀測定甘氨酸時， 待測樣品、所述標準樣品與所述空白樣品由該分析儀在設定條件下(參數)自動取樣，然後在下述條件下進行測定測定方法為二點終點法/終點法，溫度37°C，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測甘氨酸樣品與試劑的體積比例為1/10-1/500，反應方向為正反應，延遲時間1/0分鐘，檢測時間4/5分鐘。根據另一種本發明的優選實施方式，本發明使用的試劑溶液配製成如下雙劑試劑由所述的緩衝液、穩定劑、輔酶、過氧化氫、乙醯輔酶A與穀胱甘肽組成的試劑1 ；由所述的緩衝液、穩定劑、氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶與輔酶A-穀胱甘肽還原酶組成的試劑2 ；其中輔酶、氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶、輔酶A-穀胱甘肽還原酶、過氧化氫、乙醯輔酶A、穀胱甘肽在試劑1或試劑2中的位置是不限定的。根據另一種本發明的優選實施方式，本發明使用的試劑配製成如下三劑試劑由所述的緩衝液、穩定劑、輔酶、過氧化氫、乙醯輔酶A與穀胱甘肽組成的試劑1 ；由所述的緩衝液、穩定劑、丙酮酸氧化酶與輔酶A-穀胱甘肽還原酶組成的試劑2;由所述的緩衝液、穩定劑與氰化氫合成酶組成的試劑3 ；其中輔酶、氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶、輔酶A-穀胱甘肽還原酶、過氧化氫、乙醯輔酶A、穀胱甘肽在試劑1、試劑2或試劑3中的位置是不限定的。在本發明甘氨酸測定方法中使用的測定儀器可以是紫外/可見光分析儀，例如上海精密儀器儀表有限公司銷售的紫外可見分光光度計、天津喀納斯光學分析儀器有限公司銷售的723可見分光光度計；半自動生化分析儀，例如上海偉思醫用設備有限公司的BTS-330半自動生化分析儀；全自動生化分析儀，例如由邁瑞公司以商品名BS-300、奧林帕斯公司以商品名AU400、東芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000或貝克曼公司以商品名CX20銷售的全自動生化分析儀。
本發明還涉及甘氨酸測定試劑盒。該甘氨酸測定試劑盒由下述粉狀試劑組成，在使用時用水將它們溶解得到具有下述濃度範圍的可直接使用的液體試劑緩衝液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L輔酶0.l-5mmol/L氰化氫合成酶1000-80000U/L丙酮酸氧化酶1000-80000U/L輔酶A-穀胱甘肽還原酶1000-80000U/L過氧化氫l-100mmol/L乙醯輔酶Al-100mmol/L穀胱甘肽l-100mmol/Lo根據一種本發明的優選實施方式，本發明的甘氨酸測定試劑盒試劑1 緩衝液1OOmmo1/L穩定劑500mmol/L輔酶1.25mmol/L過氧化氫15mmol/L乙醯輔酶A5mmol/L穀胱甘肽5mmol/L ；組成如下的試劑2 緩衝液IOOmmo1/L穩定劑500mmol/L氰化氫合成酶16000U/L丙酮酸氧化酶18000U/L輔酶A-穀胱甘肽還原酶12000U/L。根據另一種本發明的優選實施方式，本發明的甘氨酸測定試劑試劑1 緩衝液IOOmmo1/L穩定劑500mmol/L輔酶1. 25mmol/L過氧化氫15mmol/L乙醯輔酶A5mmol/L穀胱甘肽5mmol/L ；組成如下的試劑2 緩衝液IOOmmo1/L穩定劑500mmol/L
丙酮酸氧化酶18000U/L輔酶A-穀胱甘肽還原酶12000U/L;組成如下的試劑3 緩衝液IOOmmol/L穩定劑500mmol/L氰化氫合成酶16000U/L。根據另ー種本發明的優選實施方式，在本發明的甘氨酸測定試劑盒中，所述的緩 衝液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液、咪唑-鹽酸緩 衝液、磷酸氫ニ鈉-檸檬酸緩衝液、硼砂-鹽酸緩衝液、巴比妥鈉-鹽酸緩衝液、硼酸-硼砂 緩衝液、ニ乙醇胺緩衝液或「PBS」緩衝液的緩衝液。優選地，所述的緩衝液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩衝液、 磷酸鹽緩衝液或「PBS」緩衝液。更優選地，所述的緩衝液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(TriS-HCl)緩衝 液或磷酸鹽緩衝液。在本發明中，所述的穩定劑是一種或多種選自硫酸銨、氯化鈉、乙ニ醇、丙ニ醇、甘 油或雙乙酸鈉或疊氮鈉防腐劑的穩定劑。優選地，所述的穩定劑例如是一種或多種選自硫酸銨、氯化鈉、丙ニ醇、甘油、雙乙 酸鈉或疊氮鈉的穩定劑。更優選地，所述的穩定劑例如是一種或多種選自甘油、硫酸銨或雙乙酸鈉的穩定 劑。在本發明中，無論是單劑試劑、雙劑試劑或三劑試劑，在本發明測定甘氨酸的方法 中，所述的輔酶可以是ー種或多種選自NADP+、NAD+或thio-NAD+的輔酶。使用本發明的甘氨酸測定試劑盒時，可以使用紫外/可見光分析儀，例如上海精 密儀器儀表有限公司銷售的紫外可見分光光度計、天津喀納斯光學分析儀器有限公司銷售 的723可見分光光度計；半自動生化分析儀，例如上海偉思醫用設備有限公司的BTS-330半 自動生化分析儀；全自動生化分析儀，例如由邁瑞公司以商品名BS-300、奧林帕斯公司以 商品名AU400、東芝公司以商品名120、日立公司以商品名7600、雅培公司以商品名CB8000 或貝克曼公司以商品名CX20銷售的全自動生化分析儀。在採用本發明方法測定甘氨酸吋，根據實驗要求進行多次試驗，然後將得到的這 些試驗結果按照下式計算出精密度(CV)S= V E (X-Xi)Vn-I式中又—試驗結果平均值；Xi-各次試驗結果；n-試驗次數.N彡10CV = S/ X * 100%將得到的這些試驗結果按照下式計算出相對極差
權利要求
1.一種利用二倍擴增法、酶比色法及酶聯法技術的甘氨酸濃度測定方法，其測定的技術原理是根據下述氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶、輔酶A-穀胱甘肽還原酶的系列催化反應完成甘氨酸+2輔酶氰化氫合成酶氰化氫+ 二氧化碳+2還原型輔酶二氧化碳+過氧化氫+乙醯輔酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+輔酶A+氧輔酶A+穀胱甘肽+輔酶輔酶A-穀胱甘肽還原酶輔酶A-穀胱甘肽+還原型輔酶
2.一種甘氨酸的測定方法，其特徵在於該方法的步驟如下 2. 1樣品準備2. 1. 1標準樣品的製備將一定量的甘氨酸溶於水或緩衝液中，再將其濃度調整到1毫摩爾/升； 2. 1.2待測樣品的製備待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像製備標準樣品一樣溶於水或緩衝液中； 2. 1.3空白樣品所述的水或緩衝液作為空白樣品，其甘氨酸濃度為0毫摩爾/升； 2. 2試劑溶液的製備分別移取或稱取緩衝液、穩定劑、輔酶、氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶、輔酶A-穀胱甘肽還原酶、過氧化氫、乙醯輔酶A與穀胱甘肽，然後將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是 20-500mmol/L、0. 001_7mol/L、0. l_5mmol/L、1000-80000U/L、 1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；2. 3待測樣品與在步驟2. 2)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制，可以不設副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；2. 4在與步驟2. 3)同樣的條件下測定步驟2. 1. 1)標準樣品的吸光度隨時間的變化； 2. 5在與步驟2. 3)同樣的條件下測定在步驟2. 1. 3)使用的水或緩衝液作為空白溶液的吸光度隨時間的變化；2.6數據處理由步驟2. 3-2. 5)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據下式計算得到甘氨酸的含量
3.根據權利要求1、2所述的測定方法，其特徵在於使用全自動生化分析儀測定時，待測樣品、所述標準樣品與所述空白樣品由該分析儀在設定條件下自動取樣，然後在下述條件下進行測定測定方法為終點法，溫度37°C，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測甘氨酸樣品與試劑的體積比例為1/10-1/500，反應方向為正反應，延遲時間1/0分鐘，檢測時間4/5分鐘。
4.根據權利要求1、2或3所述的測定方法，其特徵在於，所述的穩定劑是一種或多種選自硫酸銨、氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉、疊氮鈉等防腐劑的穩定劑；所述的緩衝液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液、咪唑-鹽酸緩衝液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液、硼砂-鹽酸緩衝液、巴比妥鈉-鹽酸緩衝液、硼酸-硼砂緩衝液、二乙醇胺緩衝液或「PBS」緩衝液的緩衝液；所述的輔酶是一種或多種選自NADP+、 NAD+ 或 thio-NAD+ 的輔酶。
5.根據權利要求1、2或3所述的測定方法，其特徵在於5. 1所述的試劑溶液配製成如下單劑試劑它是由所述的緩衝液、穩定劑、輔酶、過氧化氫、乙醯輔酶A、穀胱甘肽、氰化氫合成酶、 丙酮酸氧化酶與輔酶A-穀胱甘肽還原酶組成的；5. 2所述的試劑溶液配製成如下雙劑試劑試劑1，它是由所述的緩衝液、穩定劑、輔酶、過氧化氫、乙醯輔酶A與穀胱甘肽組成的；試劑2，它是由所述的緩衝液、穩定劑、氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶與輔酶A-穀胱甘肽還原酶組成的；其中輔酶、氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶、輔酶A-穀胱甘肽還原酶、過氧化氫、乙醯輔酶A、穀胱甘肽在試劑1或試劑2中的位置是不限定的。5.3所述的試劑配製成如下三劑試劑試劑1，它是由所述的緩衝液、穩定劑、輔酶、過氧化氫、乙醯輔酶A與穀胱甘肽組成的；試劑2，它是由所述的緩衝液、穩定劑、丙酮酸氧化酶與輔酶A-穀胱甘肽還原酶組成的；試劑3，它是由所述的緩衝液、穩定劑與氰化氫合成酶組成的；其中輔酶、氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶、輔酶A-穀胱甘肽還原酶、過氧化氫、乙醯輔酶A、穀胱甘肽在試劑1、試劑2或試劑3中的位置是不限定的。
6.一種甘氨酸測定試劑盒，其特徵在於6. 1它由下述粉狀試劑組成，在使用時用水將它們溶解得到具有下述濃度範圍的可直接使用的液體試劑緩衝液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L輔酶0.l-5mmol/L氰化氫合成酶1000-80000U/L丙酮酸氧化酶1000-80000U/L輔酶A-穀胱甘肽還原酶1000-80000U/L過氧化氫l-100mmol/L乙醯輔酶Al-100mmol/L穀胱甘肽l-100mmol/Lo6. 2根據權利要求6. 1所述的甘氨酉髮測定試劑盒，其特徵在於它有組成如下的試劑1 緩衝液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L輔酶0. l-5mmol/L過氧化氧1-lOOmmol/L乙醯輔酶A1-lOOmmol/L穀胱甘肽1-lOOmmol/L ； 組成如下的試劑2 緩衝液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L氰化氧合成酶1000-80000U/L丙酮酸氧化酶1000-80000U/L輔酶A-穀胱甘肽還原酶1000-80000U/L。·6. 3根據權利要求6. 1所述的甘氨酸測定試劑盒，其特徵在於它有組成如下的試劑1 緩衝液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L輔酶0. l-5mmol/L過氧化氧1-lOOmmol/L乙醯輔酶A1-lOOmmol/L穀胱甘肽1-lOOmmol/L ； 組成如下的試劑2 緩衝液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L丙酮酸氧化酶1000-80000U/L輔酶A-穀胱甘肽還原酶1000-80000U/L ； 組成如下的試劑3 緩衝液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L氰化氧合成酶1000-80000U/L。
全文摘要
本發明涉及利用二倍擴增法、酶比色法及酶聯法技術的甘氨酸含量的測定方法、試劑的組成及成分，其測定的技術原理是依據氰化氫合成酶、丙酮酸氧化酶、輔酶A-穀胱甘肽還原酶的系列催化反應完成，本發明還涉及一種甘氨酸測定試劑盒。本發明的測定方法靈敏度高、誤差小，因此本發明的測定方法與試劑盒可以廣泛地應用於食品檢驗。
文檔編號G01N33/68GK102298043SQ20101021551
公開日2011年12月28日 申請日期2010年6月25日 優先權日2010年6月25日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司