脊髓灰質炎病毒的檢測方法

2023-09-20 09:56:45 7

專利名稱：脊髓灰質炎病毒的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種脊髓灰質炎病毒的檢測方法，特別是一種採用RT-PCR方法檢測脊髓灰質炎病毒的方法。
背景技術：
脊髓灰質炎病毒是引起脊髓灰質炎的病毒，該疾病傳播廣泛，是一種急性傳染病。 脊髓灰質炎病毒屬於微小核糖核酸病毒科的腸道病毒屬。全世界每年由於腸道感染引起痢疾的病例多達40億人次，死亡人數多達220萬人，成為全球疾病之首。脊髓灰質炎病毒體積較小，約22 30nm，具有單鏈RNA基因組，是缺少外膜的腸道病毒。其按免疫性可分為三種血清型，其中I型最容易導致癱瘓，也最容易引起流行。脊髓灰質炎是一種急性病毒性傳染病，其臨床表現多種多樣，包括程度很輕的非特異性病變，無菌性腦膜炎(非癱瘓性脊髓灰質炎)和各種肌群的弛緩性無力(癱瘓性脊髓灰質炎)。脊髓灰質炎病人，由於脊髓前角運動神經元受損，使與之有關的肌肉失去了神經的調節作用而發生萎縮，同時皮下脂肪，肌腱及骨骼也萎縮，最終使整個機體變細。脊髓灰質炎病毒可在水體中存活，其主要通過糞口途徑傳給其唯一天然宿主—— 人類，因此，對飲用水、環境水源乃至各級汙水中汙染病毒的檢測，是預防控制疾病，評估水源衛生質量、環境衛生情況的一項有價值的工作。然而，在對飲用水、環境水源和各級汙水中檢測脊髓灰質炎病毒存在著諸多問題，如病毒含量低、幹擾因子複雜等都給檢測方法帶來了巨大的挑戰。脊髓灰質炎病毒的檢測方法有電鏡觀察、細胞培養、核酸雜交等，但是電鏡觀察、 核酸雜交的靈敏度相對都很低，還不能單獨用於檢測；細胞培養法的操作繁瑣，需時間較長，一般需要一周才能觀察到細胞的病理反應。因此，發展快速、靈敏度高、操作簡單的分子生物學檢測方法及其試劑盒對於脊髓灰質炎病毒的檢測和預防具有重要意義。

發明內容
本發明的目的在於克服現有傳統檢測技術的不足之處，提供一種脊髓灰質炎病毒的檢測方法.
PCR是一種體外DNA擴增技術，在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，使 DNA片段在數量上呈指數增加，從而在短時間內獲得我們所需的大量的特定基因片段。脊髓灰質炎病毒的PCR檢測方法通過應用PCR擴增原理，根據已知病毒基因序列設計出特異性很強的引物，以極低濃度的病毒RNA為模板擴增出特異的基因片段，從而達到檢測病毒的目的。根據上述原理，本發明採用如下技術方案
一種脊髓灰質炎病毒的檢測方法，其特徵在於該方法的具體步驟為提取帶檢測樣品中的核酸物質為反應模板，以脊髓灰質炎病毒特異性序列為引物，經反轉錄-PCR反應程序和嵌套PCR反應程序進行聚合酶鏈式反應擴增，得到PCR產物，經檢測，若該PCR產物中有PCR特異性擴增產物，則說明待測樣品中含有脊髓灰質炎病毒；所述的異性序列為引物為5 『 -ATTGGATTGGCCATCCGGTG-3 『、5 『 -GCATTACACTGTACGTGCAC-3 『和 5 『 -TCCACCACCACCCTCTCGACTC-3『。上述反轉錄-PCR反應程序的具體步驟為50 V 30 min，94 °C預變性2 min ；94 "C 30 s,55 "C 45 s，72 "C 80 s，30 cycles ； 72 °C延伸 5 min。上述的嵌套PCR反應程序的具體步驟為94 °C預變性2 min ；94 V 30 s，60 V 45 s, 72 "C 80 s, 30 cycles ； 72 °C延伸 5 min。上述的PCR特異性擴增產物為 TTGGATTGGCCATCCGGTGAGTGTTGTGTCAGGTATACAACTGTTTGTTGGAACCACTGTGTTAGCTTTACT
TCTCATTTAACCAATTAATCAAAAACAATACGAGGATAAAACAACAATACTACAATGGGCGCCCAAGTTTCATCACA GAAAGTTGGAGCCCACGAAAATTCAAACAGAGCCTATGGCGGGTCCACCATCAATTACACTACAATCAATTACTATA GGGACTCTGCAAGCAATGCAGCAAGCAAGCAAGATTTTGCACAAGATCCGTCCAAGTTCACCGAACCCATTAAGGAC GTCCTTATTAAGACCGCTCCCATGCTAAACTCCCCAAACATTGAGGCGTGTGGTTATAGTGACAGGGTAATGCAGCT AACTCTGGGCAATTCAACGATCACCACCCAAGAAGCGGCCAATTCTGTTGTTGCCTACGGTAGATGGCCTGAATACA TCAGAGATACCGAGGCAAATCCTGTAGACCAACCAACCGAGCCCGATGTAGCCGCGTGCAGGTTCTACACATTAGAT ACCGTCACTTGGCGCAAGGAGTCGAGAGGGTGGTGGTGGA。本發明提供的是一種利用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)監測脊髓灰質炎病毒的方法。可以用於水中、土壤等各類環境中脊髓灰質炎病毒的檢測，特別適用於水中低豐度的脊髓灰質炎病毒的檢測，該方法具有靈敏度高、速度快、簡便、準確、檢測周期短等特點。 而且具有特異性好、靈敏度高、抗幹擾抗雜誌能力強等優點，同時還能提供環境介質中脊髓灰質炎病毒潛在的感染效應等信息，為快速檢測環境介質中脊髓灰質炎病毒、評估環境中灰質病毒感染風險、預防脊髓灰質疾病爆發提供強有力的技術支持。


圖1為陰性對照中檢測脊髓灰質炎病毒電泳圖(M =Marker ；1 陰性對照檢測脊髓灰質炎病毒電泳圖)。陰性對照水樣由500ml無菌去離子水組成，以陰性對照為對比確定水樣中是否含髓灰質炎病毒。圖2為脊髓灰質炎病毒標準品RT-nest-PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖(M Marker ；1 一步法巢式PCR擴增產物；2 巢式PCR擴增產物)。圖3為模擬水樣和陰性對照中檢測脊髓灰質炎病毒電泳圖(M =Marker ；1 陰性對照檢測脊髓灰質炎病毒電泳圖；2 模擬水樣檢測脊髓灰質炎病毒電泳圖)。陰性對照水樣由500ml無菌去離子水組成，模擬水樣由在500 mL無菌去離子水中人工添加0. 2 mL脊髓灰質炎減毒活疫苗獲得。從此圖中可以看出，模擬水樣中因人工添加0.2 mL脊髓灰質炎減毒活疫苗而在電泳圖中出現明顯亮帶被檢出，陰性對照則沒有。說明此方法能有效的檢出脊髓灰質炎病毒。圖4為環境水樣檢測脊髓灰質炎病毒電泳圖。環境水樣取自上海市內某汙水處理廠(A廠)的進水口的水樣且在這個進水口有檢出脊髓灰質炎病毒。
具體實施方式
實施例一本實施例以上海市A汙水處理廠進水樣的脊髓灰質炎病毒的檢測為例來說明本發明方法
脊髓灰質炎減毒活疫苗(猴腎細胞)由中國醫學科學院醫學生物學研究所生產。我們對脊髓灰質炎病毒標準品進行了一巢步法式PCR和巢式PCR兩種分析，其結果如圖2所示。 對於一般環境中存在的微量脊髓灰質炎病毒，一步法RT-PCR不能準確檢出而巢式PCR檢測限更低，精確度更高，能夠非常準確的檢測出。模擬水樣由在500 mL無菌去離子水中人工添加0.2 mL脊髓灰質炎減毒活疫苗獲得，陰性對照水樣由500ml無菌去離子水組成。實際水樣取自上海市內某汙水處理廠(A廠)的進水口的水樣。(1)水體病毒的RNA提取
IOOOml待測水體經濃縮後得到病毒濃縮液，取140 μ L病毒濃縮液經病毒RNA提取試劑盒(TIANamp Virus RNA Kit)收集水體中病毒RNA。(2)病毒核酸的RT-nest-PCR檢測
取 0.5 1 μ g 待檢 RNA 樣品，依此加入 25 yL 2 X 1 Step Buffer, 2 yL PrimeScript 1 step Enzyme Mix, 20 pmol 弓|物 1，20 pmol 弓|物 2，力口入 Rnase free dd /K 至50 μ L。在PCR儀上按照以下程序完成RT-PCR反應50 °C 30 min，94 °C預變性2 min ； 94 "C 30 s,55 "C 45 s，72 "C 80 s，30 cycles ； 72 °C延伸 5 min。反應結束後取反應液 1 μ L，依次加入 2. 5 yL 2 X PCR Buffer, 0. 5 μ L dNTP Mixture (10 mM each)，16 pmol 弓丨物 1，16 pmol 弓丨物3，0· 25 μ LTakara ExTaq HS (5 U/ul)，力口入Rnase free dd /K 至25 μ L。在PCR儀上按照以下程序完成巢式PCR (nestPCR)反應94 °C預變性2 min ； 94 "C 30 s,60 "C 45 s，72 "C 80 s，30 cycles ； 72 °C延伸 5 min。(3)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物
反應結束後，取適量反應液用1.2% ( /V)瓊脂糖凝膠電泳在紫外凝膠成像儀上檢測實驗結果。若在500-750間出現明亮的反應條帶，則為脊髓灰質炎病毒陽性，否則為陰性。 模擬水樣由在500 mL無菌去離子水中人工添加0.2 mL脊髓灰質炎減毒活疫苗獲得，陰性對照水樣由500ml無菌去離子水組成。陰性對照的檢測結果如圖1所示，沒有在500-750 間出現明亮的反應條帶，為陰性；模擬水樣和陰性對照的檢測結果如圖3所示，模擬水樣在 500-750間出現明亮的反應條帶，為脊髓灰質炎病毒陽性。上海市內某汙水處理廠(A廠) 的進水口的水樣檢測結果如圖4，在500-750間出現明亮的反應條帶，為脊髓灰質炎病毒陽性。圖4中M為Marker ； 1為A汙水處理廠進水口水樣。
權利要求
1.一種脊髓灰質炎病毒的檢測方法，其特徵在於該方法的具體步驟為提取帶檢測樣品中的核酸物質為反應模板，以脊髓灰質炎病毒特異性序列為引物，經反轉錄-PCR 反應程序和嵌套PCR反應程序進行聚合酶鏈式反應擴增，得到PCR產物，經檢測，若該 PCR產物中有PCR特異性擴增產物，則說明待測樣品中含有脊髓灰質炎病毒；所述的異性序列為引物為5 『 -ATTGGATTGGCCATCCGGTG-3 『、5 『 -GCATTACACTGTACGTGCAC-3 和 5' -TCCACCACCACCCTCTCGACTC-3『。
2.根據權利要求1所述的脊髓灰質炎病毒的檢測方法方法，其特徵在於所述反轉錄-PCR反應程序的具體步驟為50 V 30 min，94 °C預變性2 min ；94 V 30 s，55 V 45 s, 72 "C 80 s, 30 cycles ； 72 °C延伸 5 min。
3.根據權利要求1所述的脊髓灰質炎病毒的檢測方法方法，其特徵在於所述的嵌套 PCR反應程序的具體步驟為94 °C預變性2 min ；94 V 30 s,60 V 45 s，72 V 80 s，30 cycles ； 72 °C延伸 5 min。
4.根據權利要求1所述的脊髓灰質炎病毒的檢測方法，其特徵在於所述的PCR特異性擴增產物為TTGGATTGGCCATCCGGTGAGTGTTGTGTCAGGTATACAACTGTTTGTTGGAACCACTGTGTTAGCTTTACT TCTCATTTAACCAATTAATCAAAAACAATACGAGGATAAAACAACAATACTACAATGGGCGCCCAAGTTTCATCACA GAAAGTTGGAGCCCACGAAAATTCAAACAGAGCCTATGGCGGGTCCACCATCAATTACACTACAATCAATTACTATA GGGACTCTGCAAGCAATGCAGCAAGCAAGCAAGATTTTGCACAAGATCCGTCCAAGTTCACCGAACCCATTAAGGAC GTCCTTATTAAGACCGCTCCCATGCTAAACTCCCCAAACATTGAGGCGTGTGGTTATAGTGACAGGGTAATGCAGCT AACTCTGGGCAATTCAACGATCACCACCCAAGAAGCGGCCAATTCTGTTGTTGCCTACGGTAGATGGCCTGAATACA TCAGAGATACCGAGGCAAATCCTGTAGACCAACCAACCGAGCCCGATGTAGCCGCGTGCAGGTTCTACACATTAGAT ACCGTCACTTGGCGCAAGGAGTCGAGAGGGTGGTGGTGGA。
全文摘要
本發明公開了一種脊髓灰質炎病毒的檢測方法。該方法以樣待測樣品中提取的核酸物質為反應模板，以脊髓灰質炎病毒特異性序列為引物，經反轉錄-PCR反應程序和嵌套PCR反應程序進行聚合酶鏈式反應擴增，得到PCR產物，經檢測，若該PCR產物中有PCR特異性擴增產物，則說明待測樣品中含有脊髓灰質炎病毒。本發明不僅具有特異性好、靈敏度高、抗幹擾抗雜誌能力強等優點，而且還能提供環境介質中脊髓灰質炎病毒潛在的感染效應等信息，為快速檢測環境介質中脊髓灰質炎病毒、評估環境中灰質病毒感染風險、預防脊髓灰質疾病爆發提供強有力的技術支持。
文檔編號C12Q1/68GK102382904SQ20111032596
公開日2012年3月21日 申請日期2011年10月25日 優先權日2011年10月25日
發明者吳明紅, 楊明, 沈楊, 潘辰苑, 裘文慧, 許海 申請人:上海大學