一種抗粗縮病玉米的育種方法與流程
2023-09-20 16:25:50 3
本發明涉及一種育種方法，尤其涉及一種基於抗粗縮病玉米的育種方法，屬於現代農業高新技術領域。
背景技術：
玉米在我國的栽培歷史悠久，是重要的糧食和飼料作物，具有產量高、耐儲存、再生產價值高的特點，但隨著氣候變暖、耕作制度改變和單一品種大面積種植等多重逆境因素引發或加重玉米作物的病蟲害，嚴重影響了玉米的穩產性。
玉米粗縮病是在全國範圍內嚴重危害玉米穩產的病毒病。玉米感病後呈現系統侵染，生長發育受阻，主要由灰飛蝨以持久性方式傳播的玉米粗縮病毒或者玉米黑條矮縮病毒引起。無毒灰飛蝨在感染了RBSDV的植株上吸汁獲毒，獲毒時間一般為24-48h，最短lh，無毒蟲一經帶毒後能終身傳毒，不經卵傳染，毒蟲多數為短期間歇傳毒。
防治玉米粗縮病的傳統方法是切斷其傳播途徑，利用殺蟲劑對灰飛蝨進行防治是防治該病害的有效方法。但目前生產上廣泛使用的農藥只針對灰飛蝨，植株一旦染病就沒有十分有效的防治措施，其效果有限；隨著這些殺蟲劑的使用年限增加，昆蟲對殺蟲劑產生了高抗藥性；而且殺蟲劑的使用不可避免地對環境造成汙染和破壞。生產過程中還有通過改進栽培技術條件對玉米粗縮病進行防治的措施，但收效甚微。
現有技術在玉米生產上對玉米粗縮病的防治對策在一定程度上增加了玉米生產的成本，並且加重了環境壓力。
現有技術防治玉米粗縮病最為有效的方法是選用抗病性的玉米品種，培育玉米粗縮病抗性品種的方法通常有兩種：常規育種和分子技術育種。
常規育種的周期很長，培育出一個玉米粗縮病抗性品種往往需要6～8年的時間，而又由於粗縮病病毒生理小種遺傳的複雜性和致病性的多樣性使得病菌群體的毒力基因的組成發生變化，往往選育的抗性品種在推廣3～5年後即產生能侵染該品種的優勢小種，最終導致新品種的抗性喪失。常規育種消耗時間長，尤其隨著粗縮病病毒突變頻率的增加，新品種育成的速度已經跟不上粗縮病病毒的突變速度。
轉基因育種與分子標記輔助選擇等分子技術育種是目前農業發展的新方向，對特定優良主栽品種進行粗縮病抗病基因和其他優良基因的轉基因育種是一種可選方案，但由於目前轉基因育種被抵制，且轉基因育種和分子標記輔助選擇育種首先需要基因定位，同樣需要大田多世代的雜交回交，周期也較長，分子技術育種還存在費用高、技術門檻高的問題，難以被一般育種者所掌握。
技術實現要素：
基於現有技術的缺陷，本發明提供一種抗粗縮病玉米的育種方法，能夠將粗縮病抗性基因高效而專一地滲入到本地優質玉米品種中。
本發明涉及的抗粗縮病玉米的育種方法所需種子材料包括，第一粗縮病抗性玉米材料、第二粗縮病抗性玉米材料以及玉米育種主幹品系材料。
所述玉米育種主幹品系材料為產量高、米質好、易感粗縮病的種系，所述第一粗縮病抗性玉米材料和第二粗縮病抗性玉米材料為高抗粗縮病、不高產、在產地不適宜大規模推廣的種系。
玉米育種主幹品系材料優選為鄭單958，所述第一粗縮病抗性玉米材料優選為登海3622，所述第二粗縮病抗性玉米材料優選為金海5號。
具體包括如下步驟：
(1)第一播種和移栽程序：
將第一粗縮病抗性玉米材料和第二粗縮病抗性玉米材料分別浸種於稀釋的浸種液中，浸種1～2天後，催芽並按品種播種於實驗秧田，單株移栽，株行距為30×30cm；一般大田肥水和病蟲草害管理，至植株正常生長到揚花期，進行步驟(2)。
所述浸種液為2mL10％二硫氰基甲烷乳油、2g咪醯胺、15mL40％福·克懸浮種衣劑、2mL70％吡蟲啉水分散粒劑，加500倍水稀釋配製而成。
(2)雜交種F1的獲取：
將母本植株的玉米穗浸入39～46℃的溫水中，浸泡6～10分鐘後取出，自然冷卻30分鐘，用紙袋將母本植株的玉米穗套好並作標記，待用。當父本植株進入開花期時，將父本植株上玉米穗的花葯均勻落到紙袋中母本植株玉米穗的柱頭上，人工授粉完成後將紙袋繼續套好，等待雜交玉米穗的籽粒成熟，即獲得雜交種F1。
所述母本植株的玉米穗浸入的溫水溫度優選為42℃，所述浸泡時間優選為7分鐘。
本方法結實率高，並可避免自交，還能促進開花，便於授粉。
(3)雜交種F1抗粗縮病的灰飛蝨篩選：
雜交種F1正季播種，當雜交種F1處於2～2.5葉期時，按每株玉米10～20頭的數量向秧田釋放灰飛蝨，50天後對每株玉米進行評估，保留未受粗縮病侵害的植株。
所述灰飛蝨每頭飼餵玉米粗縮病毒粗毒素提取液4～5天，全部攜帶玉米粗縮病毒。
(4)雜交種F1的花葯愈傷誘導：
以玉米穗中部花葯位置佔穎殼的1/2為標準取穗，取穗後用70％乙醇表面消毒，然後用塑料薄膜包住整個玉米穗，保持玉米穗溼潤放入冰箱中，在4℃下低溫預處理3天；在85％的酒精中消毒處理2～10分鐘，晾乾後用剪開花葯上部，將花葯置於第一培養基中，進行誘導培養，在22～28℃下暗培養2～3天後，轉移至第二培養基中，於25～29℃、光周期16h7500lx光照8h黑暗下進行繼代培養，50天後將獲得的雜交種F1的花葯愈傷組織，統計花葯愈傷組織誘導率，若花葯愈傷組織誘導率低於5％，則需將雜交種F1與粗縮病抗性玉米材料親本回交直至花葯愈傷組織誘導率高於5％。
(5)第二播種和移栽程序：
將玉米育種主幹品系材料和雜交種F1分別浸種於稀釋的浸種液中，浸種1-2天後，催芽並按品種播種於實驗秧田，單株移栽，株行距為30×30cm；一般大田肥水和病蟲草害管理，至植株正常生長到揚花期，進行步驟(6)。
所述浸種液同步驟(1)。
(6)三交F1雜交種的獲取：
將母本植株的玉米穗浸入39～46℃的溫水中，浸泡6～10分鐘後取出，自然冷卻30分鐘，剪去l/3穎殼及未開穎的小花，用紙袋將母本植株的玉米穗套好並作標記，待用。當父本植株進入開花期時，將父本植株上玉米穗的花葯均勻落到紙袋中母本植株玉米穗的柱頭上，人工授粉完成後將紙袋繼續套好，等待雜交玉米穗的籽粒成熟，即獲得三交F1雜交種。
所述母本植株的玉米穗浸入的溫水溫度優選為42℃，所述浸泡時間優選為7分鐘。
(7)三交F1雜交種抗粗縮病的灰飛蝨篩選：
三交F1雜交種正季播種，當三交F1雜交種處於2～2.5葉期時，按每株玉米10～20頭的數量向秧田釋放灰飛蝨，50天後對每株玉米進行評估，保留未受粗縮病侵害的植株。
所述灰飛蝨每頭飼餵玉米粗縮病毒粗毒素提取液4～5天，全部攜帶玉米粗縮病毒。
(8)三交F1雜交種的花葯愈傷誘導：
以玉米穗中部花葯位置佔穎殼的1/2為標準取穗，取穗後用70％乙醇表面消毒，然後用塑料薄膜包住整個玉米穗，保持玉米穗溼潤放入冰箱中，在4℃下低溫預處理3天；在85％的酒精中消毒處理2～10分鐘，晾乾後用剪開花葯上部，將花葯置於第一培養基中，進行誘導培養，在22～28℃下暗培養2～3天後，轉移至第二培養基中，於25～29℃、光周期16h7500lx光照8h黑暗下進行繼代培養，獲得花葯愈傷組織，繼續培養出花培苗、育苗、移植到大田，等待玉米穗籽粒成熟，通過篩選即獲得粗縮病抗性玉米。
其中步驟(4)和(8)中所述第一培養基的成分為：N6基礎培養基500mg/L、甘氨酸4.2mg/L，煙酸11mg/L，瓊脂2.3g/L；激動素KT 15mg/L，山梨醇0.5g/L，2-氨基-5-羧基戊醯胺20mg/L，丙氨酸10mg/L，赤黴素GA3 0.8mg/L，胰島素12mg/L，葉酸16mg/L，秋水仙鹼1.9mg/L；pH值為6.0。
步驟(4)和(8)中所述第二培養基的成分為：MS基本培養基700mg/L、肌醇50mg/L，甘氨酸6mg/L，維生素B1 0.4mg/L，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷20mg/L，維生素B6 0.5mg/L，蔗糖1.5g/L，萘乙酸NAA 1.3mg/L，生物素11mg/L，脫落酸ABA 3.5mg/L，甲基亞硝基脲3.5mg/L，調環酸鈣4.2mg/L，水解蛋白0.7g/L；以及濃度30％的玉米粗縮病毒粗毒素提取液，pH值為6.0。
步驟(3)、(7)和(8)中所述玉米粗縮病毒粗毒素提取液的製備方法為：將染病玉米的穗頸部剪下，清潔表面後置於溼潤培養皿中，在37℃條件下暗培養，在菌絲產生後加入營養瓊脂繼續培養，得到菌株；將菌株接種到液體培養基中37℃下搖床培養20天，超聲振蕩10～30分鐘、過濾、以1000～2200rpm的速度離心15～20分鐘，得到的上清液即玉米粗縮病毒粗毒素。
本發明涉及的一種抗粗縮病玉米的育種方法，將抗粗縮病基因高效而專一地滲入玉米育種主幹品系材料，培育出一種抗粗縮病玉米品系，避免了現有技術利用化學藥劑防治玉米抗粗縮病造成的環境汙染，縮短了育種周期，避免基因導入引起的細胞變異，保持了良種優異性能的同時增加了其抗粗縮病能力，在一定程度上減少了玉米生產成本，具有應用前景。
具體實施方式
下面通過具體實施例，進一步對本發明的技術方案進行具體說明。應該理解，下面的實施例只是作為具體說明，而不限制本發明的範圍，同時本領域的技術人員根據本發明所做的顯而易見的改變和修飾也包含在本發明範圍之內。
實施例1
第一粗縮病抗性玉米材料選擇登海3622，玉米育種主幹品系材料選擇鄭單958，所述第二粗縮病抗性玉米材料為金海5號。採用本發明的技術路線進行粗縮病抗病育種，成功獲得了6個農藝性狀優良、粗縮病抗性得到改良的花培家系。
鄭單958為中國種植面積最大的玉米品種，有高產、穩產優勢，但較感粗縮病。登海3622是山東登海種業股份有限公司育成的品種，高抗粗縮病，但感矮花葉病和玉米螟。金海5號是中國農民育種專家翟延舉育成的品種，高抗粗縮病，但感彎孢菌葉斑病和絲黑穗病。
其具體操作流程如下：
(1)第一播種和移栽程序：
將登海3622和金海5號分別浸種於稀釋的浸種液中，浸種1～2天後，催芽並按品種播種於實驗秧田，單株移栽，株行距為30×30cm；一般大田肥水和病蟲草害管理，至植株正常生長到揚花期，進行步驟(2)。
所述浸種液為2mL10％二硫氰基甲烷乳油、2g咪醯胺、15mL40％福·克懸浮種衣劑、2mL70％吡蟲啉水分散粒劑，加500倍水稀釋配製而成。
(2)雜交種F1的獲取：
將母本植株的玉米穗浸入42℃的溫水中，浸泡7分鐘後取出，自然冷卻30分鐘，用紙袋將母本植株的玉米穗套好並作標記，待用。當父本植株進入開花期時，將父本植株上玉米穗的花葯均勻落到紙袋中母本植株玉米穗的柱頭上，人工授粉完成後將紙袋繼續套好，等待雜交玉米穗的籽粒成熟，即獲得雜交種F1。
(3)雜交種F1抗粗縮病的灰飛蝨篩選：
雜交種F1正季播種，當雜交種F1處於2～2.5葉期時，按每株玉米10～20頭的數量向秧田釋放灰飛蝨，50天後對每株玉米進行評估，保留未受粗縮病侵害的植株。
所述灰飛蝨每頭飼餵玉米粗縮病毒粗毒素提取液4～5天，全部攜帶玉米粗縮病毒。
(4)雜交種F1的花葯愈傷誘導：
以玉米穗中部花葯位置佔穎殼的1/2為標準取穗，取穗後用70％乙醇表面消毒，然後用塑料薄膜包住整個玉米穗，保持玉米穗溼潤放入冰箱中，在4℃下低溫預處理3天；在85％的酒精中消毒處理2～10分鐘，晾乾後用剪開花葯上部，將花葯置於第一培養基中，進行誘導培養，在22～28℃下暗培養2～3天後，轉移至第二培養基中，於25～29℃、光周期16h7500lx光照8h黑暗下進行繼代培養，50天後將獲得的雜交種F1的花葯愈傷組織，統計花葯愈傷組織誘導率，若花葯愈傷組織誘導率低於5％，則需將雜交種F1與粗縮病抗性玉米材料親本回交直至花葯愈傷組織誘導率高於5％。
(5)第二播種和移栽程序：
將鄭單958和雜交種F1分別浸種於稀釋的浸種液中，浸種1-2天後，催芽並按品種播種於實驗秧田，單株移栽，株行距為30×30cm；一般大田肥水和病蟲草害管理，至植株正常生長到揚花期，進行步驟(6)。
所述浸種液同步驟(1)。
(6)三交F1雜交種的獲取：
將母本植株的玉米穗浸入42℃的溫水中，浸泡7分鐘後取出，自然冷卻30分鐘，剪去l/3穎殼及未開穎的小花，用紙袋將母本植株的玉米穗套好並作標記，待用。當父本植株進入開花期時，將父本植株上玉米穗的花葯均勻落到紙袋中母本植株玉米穗的柱頭上，人工授粉完成後將紙袋繼續套好，等待雜交玉米穗的籽粒成熟，即獲得三交F1雜交種。
(7)三交F1雜交種抗粗縮病的灰飛蝨篩選：
三交F1雜交種正季播種，當三交F1雜交種處於2～2.5葉期時，按每株玉米10～20頭的數量向秧田釋放灰飛蝨，50天後對每株玉米進行評估，保留未受粗縮病侵害的植株。
所述灰飛蝨每頭飼餵玉米粗縮病毒粗毒素提取液4～5天，全部攜帶玉米粗縮病毒。
(8)三交F1雜交種的花葯愈傷誘導：
以玉米穗中部花葯位置佔穎殼的1/2為標準取穗，取穗後用70％乙醇表面消毒，然後用塑料薄膜包住整個玉米穗，保持玉米穗溼潤放入冰箱中，在4℃下低溫預處理3天；在85％的酒精中消毒處理2～10分鐘，晾乾後用剪開花葯上部，將花葯置於第一培養基中，進行誘導培養，在22～28℃下暗培養2～3天後，轉移至第二培養基中，於25～29℃、光周期16h7500lx光照8h黑暗下進行繼代培養，獲得花葯愈傷組織，繼續培養出花培苗、育苗、移植到大田，等待玉米穗籽粒成熟，即獲得粗縮病抗性玉米。
其中步驟(4)和(8)中所述第一培養基的成分為：N6基礎培養基500mg/L、甘氨酸4.2mg/L，煙酸11mg/L，瓊脂2.3g/L；激動素KT 15mg/L，山梨醇0.5g/L，2-氨基-5-羧基戊醯胺20mg/L，丙氨酸10mg/L，赤黴素GA3 0.8mg/L，胰島素12mg/L，葉酸16mg/L，秋水仙鹼1.9mg/L；pH值為6.0。
步驟(4)和(8)中所述第二培養基的成分為：MS基本培養基700mg/L、肌醇50mg/L，甘氨酸6mg/L，維生素B1 0.4mg/L，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷20mg/L，維生素B6 0.5mg/L，蔗糖1.5g/L，萘乙酸NAA 1.3mg/L，生物素11mg/L，脫落酸ABA 3.5mg/L，甲基亞硝基脲3.5mg/L，調環酸鈣4.2mg/L，水解蛋白0.7g/L；以及濃度30％的玉米粗縮病毒粗毒素提取液，pH值為6.0。
步驟(3)、(7)和(8)中所述玉米粗縮病毒粗毒素提取液的製備方法為：將染病玉米的穗頸部剪下，清潔表面後置於溼潤培養皿中，在37℃條件下暗培養，在菌絲產生後加入營養瓊脂繼續培養，得到菌株；將菌株接種到液體培養基中37℃下搖床培養20天，超聲振蕩10～30分鐘、過濾、以1000～2200rpm的速度離心15～20分鐘，得到的上清液即玉米粗縮病毒粗毒素。