膽汁酸結合劑、血清膽固醇量降低劑以及使血清膽固醇量降低的方法
2023-09-20 09:41:35 2
專利名稱：膽汁酸結合劑、血清膽固醇量降低劑以及使血清膽固醇量降低的方法
技術領域：
本發明涉及以具有膽汁酸結合能力的來源於蜂王漿的蛋白質作為有效成分的膽汁酸結合劑以及血清膽固醇量降低劑，還涉及使用該蛋白質降低血清膽固醇量的方法。
背景技術：
據世界衛生組織(WHO)統計，世界上排在第一位的死因是動脈硬化症等心血管疾病。認為血液中的LDL-膽固醇濃度過高是動脈硬化症的主要原因，為了改善膽固醇代謝， 急需研發出更有效的醫藥品以及功能性食品。近年來，有報導稱通過攝取蜂王漿，可以改善高膽固醇血症(例如，參考非專利文獻1 4)。此外，還有報導稱蜂王漿中除了含有12 15%的一般性成分粗蛋白質以夕卜，還含有特殊成分10-羥基癸烯酸和蜂王漿抗菌蛋白(royalisin)，所述10-羥基癸烯酸可以使高脂血症大鼠血液中的甘油三酯、總膽固醇的量減少(例如，參考非專利文獻5)。另一方面，公開了如下方法使用填充了結合有膽酸的載體的柱子作為膽汁酸結合型親和色譜柱(用於具有膽汁酸結合能力的成分的親和色譜柱)，將血清白蛋白分離的方法(例如，參考非專利文獻6)；使用膽汁酸結合型親和色譜柱，從大豆蛋白質中分離並鑑定具有膽汁酸結合能力的蛋白質的方法(例如，參考非專利文獻7和8)等。現有技術文獻非專利文獻非專利文獻1 =Nakajin,其他4人，生藥學雜誌，1982年，第36卷，第65-69頁。非專利文獻2 =Vittek, Experientia, 1995 年，第 51 卷，第 927-935 頁。非專利文獻 3 :Guo,其他 6 人，Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 2007 年，第 53 卷，第 345-348 頁。4 :Kamakura, ^ftk 2 Α Journal of pharmacy and pharmacology, 2006 年，第 58 卷，第 1683-1689 頁。非專利文獻5 :Xu，其他 2 人，Zhong Yao Cai (Journal of Chinese medicinal materials)，2002 年，第 25 卷，第 346-347 頁。非專利文獻6 :Pattinson，其他2人，Journal of Chromatography，1980年，第 187 卷，第409-412頁。非專利文獻7 :Makino，其他4人，Agricultural and Biological Chemistry, 1988 年，第52卷，第803-809頁。非專利文獻8 :Minami，其他3人，Agricultural and Biological Chemistry, 1990 年，第M卷，第511-517頁。
發明內容
發明要解決的問題
此外，蜂王漿(以下稱作RJ)是從工蜂的下咽頭腺和大顎腺分泌的乳白色膠狀營養物質。蜂王漿是女王蜂幼蟲的唯一食糧，含有各種維生素類、礦物質、糖類、胺基酸、蛋白質成分，營養價值非常高。此外，雖然未經科學證明，但一直以來被認為具有疲勞恢復作用、 抗過敏作用、抗癌作用、增強免疫力作用等多種藥理作用，被廣泛用作營養補品、醫藥品原料等。因此，通過將RJ來源的成分作為有效成分，期待能夠研發出用於預防/改善高膽固醇血症的安全的新食品、醫藥品。RJ中含有各種成分，因此，為了研發新的醫藥品、功能性食品，RJ中有效成分的確定是不可或缺的。然而，在非專利文獻1 4中，可以明確RJ本身對膽固醇血症具有改善效果，但對於其有效成分卻完全不明確，其作用機制也是未知的。本發明的目的在於提供一種以RJ中含有的特定成分作為有效成分的膽汁酸結合劑以及使用該特定成分使血清膽固醇量降低的方法，所述特定成分具備膽汁酸結合能力、 高膽固醇血症改善能力。解決問題的方法為了解決上述問題，本發明人等進行了深入的研究，使用膽汁酸結合型親和色譜柱從RJ中確定了多個具有膽汁酸結合能力的成分，並對這些成分的膽汁酸結合能力、對血清膽固醇的影響進行了研究，從而完成了本發明。gp，本發明提供(1) 一種膽汁酸結合劑，其特徵在於，以選自MRJPl、MRJP2和MRJP3中的一種以上作為有效成分。(2) 一種血清膽固醇量降低劑，其特徵在於，以MRJPl作為有效成分。(3) 一種膽固醇膠束的溶解抑制劑，其特徵在於，以MRJPl作為有效成分。(4) 一種使血清膽固醇量降低的方法，其特徵在於，口服攝取MRJP1。發明的效果對於本發明的膽汁酸結合劑、使血清膽固醇量降低的方法，可以通過口服RJ來源的膽汁酸結合劑，安全地使血清膽固醇量降低。因此，期待本發明的膽汁酸結等，對於血清中膽固醇量增加引起的疾病，特別是高膽固醇血症、動脈硬化症等具有預防/治療效^ ο
圖1為圖表，表示的是在參考例1中，通過使用了膽汁酸結合型親和色譜柱的柱色譜對BSA溶液和卵清蛋白(Ovalbumin)溶液進行分級時，各級分的遷移率和280nm的吸光度之間的關係。圖2為圖表，表示的是在實施例1中，通過使用了膽汁酸結合型親和色譜柱的柱色譜對RJ蛋白質溶液進行分級時，各級分的遷移率和^Onm的吸光度之間的關係。圖3表示的是在實施例1中，通過使用了膽汁酸結合型親和色譜柱的柱色譜對 RJ蛋白質溶液進行分級，並將所得各級分進行10%的SDS-PAGE後得到的CBB染色圖像。
圖4為圖表，表示的是在實施例2中，通過凝膠過濾色譜對RJ蛋白質溶液進行分級時，各級分的遷移率和^Onm的吸光度之間的關係。 圖5表示的是在實施例2中，由標準品的遷移率和分子量得到的校正曲線的圖。
圖6表示的是在實施例2中，通過將分子量約為290kDa的級分進行15%的 SDS-PAGE後得到的CBB染色圖像。圖7表示的是在實施例2中，通過將分子量約為51kDa的級分進行15 %的 SDS-PAGE後得到的CBB染色像圖。圖8為圖表，表示的是在實施例2中，通過陰離子色譜對分子量約為51kDa的級分進行分級時，各級分的遷移率和^Onm的吸光度之間的關係。圖9表示的是在實施例2中，對通過陰離子色譜得到的峰1 4進行15%的 SDS-PAGE後得到的CBB染色圖像。圖10表示的是在實施例2中，通過膽汁酸結合能力試驗計算出的與各分子結合的膽汁酸的比例。圖11表示的是在實施例3中，膽固醇在膠束中的溶解比例。圖12表示的是在實施例4中，向大鼠口服給藥MRJPl的試驗概要圖。圖13表示的是在實施例4中，向大鼠口服給藥MRJPl的試驗中，各大鼠組的體重變化圖。 圖14表示的是在實施例4中，向大鼠口服給藥MRJPl的試驗中，各大鼠組每日攝食量的圖。圖15表示的是在實施例4中，向大鼠口服給藥MRJPl的試驗中，各大鼠組的肝臟
重量的圖。圖16表示的是在實施例4中，向大鼠口服給藥MRJPl的試驗中，各大鼠組的血清總膽固醇量的圖。圖17表示的是在實施例5中，向大鼠口服給藥MRJPl的試驗中，各大鼠組的體重變化的圖。圖18表示的是在實施例5中，向大鼠口服給藥MRJPl的試驗中，各大鼠組每日攝食量的圖。圖19表示的是在實施例5中，向大鼠口服給藥MRJPl的試驗中，各大鼠組的肝臟
重量的圖。圖20表示的是在實施例5中，向大鼠口服給藥MRJPl的試驗中，各大鼠組的血清總膽固醇量的圖。
具體實施例方式本發明的膽汁酸結合劑以選自MRJPl (Major royal jelly protein 1)、MRJP2和 MRJP3中的一種以上作為有效成分。如後文實施例所示，MRJPl、MRJP2和MRJP3是通過使用膽汁酸結合型親和色譜柱，從RJ中首次分離/鑑定的膽汁酸結合蛋白質。使用了膽汁酸結合親和色譜的膽汁酸結合蛋白質的分離/鑑定法，是本發明人首次應用於RJ的。MRJPl是佔RJ中所含全部蛋白質的約39. 4%的蛋白質，MRJP2是佔RJ中所含全部蛋白質的約21. 5%的蛋白質，MRJP3是佔RJ中所含全部蛋白質的約21. 2%的蛋白質(泉宏樹、米倉政實著。「α —〗J 一夕> /、1質Θ α歹才一 A解析」(「蜂王漿蛋白質的蛋白質組解析」)社團法人全國蜂王漿公平交易協會、平成20年度報告書(2008年)、 第21頁)。公知MRJPl是由432個胺基酸形成的蛋白質，通常在SDS-PAGE中，其分子量約為 55kDa(J. khmitozova et.al，Cell. Mol. Life Sci.，vol54, pl020_1030 (1998))。 此外，在美利堅合眾國的NCBI (國立生物工學信息中心)的序列資料庫中，MRJPl註冊為Accession編號NP_001011579。公知MRJP2是由452個胺基酸形成的蛋白質，通常在 SDS-PAGE 中，其分子量約為 49kDa(J. Schmitozova et. al, Cell. Mol. Life Sci.，vol54, P1020-1030 (1998)) ο 此外，MRJP2 在 NCBI 的 Accession 編號為 NP_001011580。MRJP3 是由 544個胺基酸形成的蛋白質，通常在SDS-PAGE中，其分子量為60 70kDa(J. Schmitozova et. al, Cell. Mol. Life Sci.，vol54，pl020_1030 (1998))。此外，MRJP3 在NCBI 的 Accession 編號為 NP_001011601。 以下，將上述蛋白質統稱為「本發明的RJ來源的膽汁酸結合蛋白質」。
進一步地，在本發明中，只要不損害MRJPl、MRJP2或MRJP3所具有的膽汁酸結合能力，MRJP1、MRJP2或MRJP3中的1 數個胺基酸可以缺失、被取代或被加成。上述胺基酸被加成等的蛋白質，也可以作為本發明膽汁酸結合劑的有效成分。例如，可以在MRJP1、MRJP2 或MRJP3的N末端、C末端分別加成1 10個，優選1 5個胺基酸。作為加成於本發明的RJ來源的膽汁酸結合蛋白質的N末端、C末端的胺基酸序列，可以列舉His-Tag等常規的用於生成重組蛋白的Tag序列等。在本發明的RJ來源的膽汁酸結合蛋白質中，MRJPl除了具有膽汁酸結合能力以夕卜，還具有降低對膽固醇膠束的溶解作用，和降低血清膽固醇量的作用。即，本發明的RJ來源的膽汁酸結合蛋白質適合用作膽固醇膠束的溶解抑制劑和血清膽固醇量的降低劑的有效成分。需要說明的是，由MRJPl中1 數個胺基酸缺失、被取代或被加成的胺基酸序列形成且具有膽固醇膠束的溶解抑制能力、血清膽固醇量降低能力的蛋白質，與MRJPl相同，也適合用作膽固醇膠束的溶解抑制劑和血清膽固醇量的降低劑的有效成分。食物來源的膽固醇，與卵磷脂、脂肪酸、膽汁酸等形成膠束，變為水溶性的，通過非攪拌水層(UWL)被小腸吸收。由所述膽固醇在小腸中的吸收機制，推測本發明的RJ來源的膽汁酸結合蛋白質通過在小腸內與膽汁酸結合，可以抑制膽固醇膠束的形成，其結果，抑制膽固醇的吸收。作為本發明的膽汁酸結合劑、膽固醇膠束的溶解抑制劑以及血清膽固醇量降低劑 (以下，膽汁酸結合劑等)的有效成分的RJ來源的膽汁酸結合蛋白質，可以是由RJ純化的物質，也可以是通過基因重組技術在公知的表達體系中合成的重組蛋白，還可以是通過肽合成得到的合成品。例如，通過膽汁酸結合型親和色譜對RJ蛋白質溶液進行分級時，回收含有RJ來源的膽汁酸結合蛋白質的級分。可以將上述回收的級分作為本發明的膽汁酸結合劑等有效成分。此外，通過凝膠過濾色譜對RJ蛋白質溶液進行分級時，回收含有MRJP1、 MRJP2或MRJP3的級分。可以將上述回收的級分作為本發明的膽汁酸結合劑等的有效成分。本發明的膽汁酸結合劑等，可以作為醫藥品、補充劑等飲食品單獨攝入，也可以像其他的飲食用組合物、醫藥用組合物那樣，作為飲食品、醫藥品的添加劑使用。本發明的膽汁酸結合劑等的劑型，沒有特別的限定。可以是例如軟膠囊劑、硬膠囊齊U、片劑、顆粒劑、散劑、液劑、軟膏劑、乳膏劑、凝膠劑等。用於細胞培養等時，優選乾燥粉末、溶解在水、緩衝液等適當溶液中形成的液劑。另一方面，用於生物個體時，優選適於口服給藥的劑型，進一步優選腸溶劑。本發明的膽汁酸結合劑等中含有的RJ來源的膽汁酸結合蛋白質，可以僅是1種，
6也可以是2種以上的組合。此外，上述膽汁酸結合劑等中含有的RJ來源的膽汁酸結合蛋白質的量，只要是能夠發揮出該RJ來源的膽汁酸結合蛋白質的膽汁酸結合能力、膽固醇膠束溶解抑制能力或者血清膽固醇降低能力即可，並無特別限定，可以考慮RJ來源的膽汁酸結合蛋白質的種類、劑型等適當進行決定。本發明的膽汁酸結合劑等，可以僅由本發明的RJ來源的膽汁酸結合蛋白質形成， 也可以含有其他成分。作為其他成分，只要不損害本發明的RJ來源的膽汁酸結合蛋白質的活性即可，可以是任何成分，例如，可以含有除本發明RJ來源膽汁酸結合蛋白質以外的RJ 來源的成分，也可以含有具備膽汁酸結合能力、血清膽固醇降低能力的功能性肽。此外，本發明的膽汁酸結合劑等可以含有醫藥品、飲食品中可添加的成分，例如賦形劑、粘合劑、表面活性劑、抗氧化劑、PH調節劑、崩解劑、潤滑劑、防腐劑、殺菌劑、著色劑、矯味矯臭劑等。例如，以選自MRJP1、MRJP2和MRJP3的1種以上作為有效成分的血清膽固醇量降低劑，優選進一步含有10-羥基癸烯酸作為有效成分。其中，優選以MRJPl和10-羥基癸烯酸作為有效成分的血清膽固醇量降低劑。如上所述，10-羥基癸烯酸具有降低高脂血症大鼠血液中的甘油三酯、總膽固醇的效果，通過與MRJPl等組合使用，可以實現更加顯著地降低血清膽固醇的作用。對於血清膽固醇量降低劑中的MRJPl和10-羥基癸烯酸的含量，只要兩者是能夠各自發揮降低血清膽固醇作用的量即可，沒有特別的限定，可以根據一天的攝取量等來確定。本發明的膽汁酸結合劑等的製造方法，只要是不損害含有的本發明的RJ來源的膽汁酸結合蛋白質活性即可，沒有特別的限定，通常，可以使用在製造含有功能性蛋白質的飲食用組合物或醫藥用組合物時所使用的方法。本發明的膽汁酸結合劑等的給藥量，只要可以發揮出RJ來源的膽汁酸結合蛋白質的膽汁酸結合等活性即可，沒有特別的限定，可以考慮RJ來源的膽汁酸結合蛋白質的種類、對象細胞的種類及狀態、劑型、給藥方法等適當進行確定。例如，用於培養細胞等生物個體外的細胞時，可以向培養液中添加本發明的膽汁酸結合劑或膽固醇膠束溶解抑制劑，使得培養液中的RJ來源的膽汁酸結合蛋白質含量為IOmg 100mg/mL。在生物個體攝取時，本發明的膽汁酸結合劑等的攝取量，只要是可以發揮出該RJ 來源的膽汁酸結合蛋白質的膽汁酸結合等活性的量即可，沒有特別限定，可以根據攝取的人、動物的體重、年齡、性別、劑型等適當進行確定。例如，優選分為1次或數次來攝取，使得 RJ來源的膽汁酸結合蛋白質每天的攝取量為300mg lg/kg。通過口服攝取，本發明的膽汁酸結合劑等在生物體內與膽汁酸結合，進一步地使攝取的飲食中的膽固醇膠束溶解性降低，其結果，使血清膽固醇的量降低。因此，本發明的膽汁酸結合劑等，適宜對高膽固醇血症、動脈硬化症等由於血清的膽固醇量過剩等原因造成的疾病進行治療、預防。本發明的降低血清膽固醇量的方法(以下叫做血清膽固醇量的降低方法)，其特徵在於通過口服攝取選自MRJPl、MRJP2和MRJP3中的1種以上。口服攝取RJ來源的膽汁酸結合蛋白質的生物，只要是具有小腸、膽管等組織的動物即可，可以是人，也可以是小鼠、 大鼠、狗、貓、猿、牛等的除人以外的動物。實施例下文將通過實施例等對本發明進行更加詳細的說明，本發明並不限定於以下的實施例。參考例1膽汁酸結合型親和色譜柱，是以碳二亞胺作為間隔臂，將膽酸結合在作為柱載體的EAH-kpharose 4B上來製造的。膽汁酸結合型親和色譜柱的製造方法，按照I^attinson 等的方法(非專利文獻6)進行。具體而言，首先，使625mL的膽汁酸溶液(含作為間隔臂的33. 4mM的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(l-Ethyl-3-(3' -dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl)和3. 7mM的膽酸的50%乙醇溶液)在pH6. 4條件下相對於容量為50mL 的EAH-kpharose 4B載體反應16小時，使膽酸結合在載體上。然後，將用含有0. 5MNaCl 的50%乙醇對未吸附的過量的膽酸溶液進行洗滌後得到的物質填充至色譜柱內，製造膽汁酸結合型親和色譜柱(色譜柱的柱床容量50mL)。需要說明的是，使用前，使用0. 02% NaN3 溶液對色譜柱進行平衡化。 接著，通過使用BSA和卵清蛋白來確認製造的色譜柱對於具有膽汁酸結合能的化合物是否實際具備親和性。從色譜柱洗脫的條件，按照7 ^ 7等的方法(非專利文獻7)進行。首先，將1.5mg/mL的BSA溶液和卵清蛋白溶液應用於製造的膽汁酸結合型親和色譜柱上。接著，使第1次洗滌液(0. 5M NaClUOmM Tris-HCl, pH 8. 0)通過該色譜柱，洗滌除去未吸附在該柱中的載體上的物質。接著，使洗脫液(0. 5%脫氧膽酸鈉、IOmM Tris-HCl, PH8. 0)通過該柱，將與膽酸結合的蛋白質即具有膽汁酸結合能力的蛋白質洗脫。最後，使第 2次洗滌液(8M尿素、IOmM Tris-HCl,pH8. 0)通過該色譜柱，將非特異性地結合於該色譜柱上的物質洗脫。各級分的遷移率和^Onm的吸光度之間的關係如圖1所示。在圖1中，「⑴」為第1次洗滌液的級分，「 (2) 」為洗脫液的級分，「 (3) 」為第2次洗滌液的級分。其結果，卵清蛋白在第1次洗滌液級分中被洗脫，BSA在洗脫液的級分中被洗脫。由上述結果可知，製造的膽汁酸結合型親和色譜柱與非專利文獻7中記載的膽汁酸結合型親和色譜柱相同，不吸附卵清蛋白，吸附BSA。[實施例1]使用參考例1中製造的膽汁酸結合型親和色譜柱，對RJ蛋白質進行分級時，對具有膽汁酸結合能力的蛋白質進行分離、純化。關於使用該膽汁酸結合型親和色譜柱對RJ來源的膽汁酸結合蛋白質的分離純化，目前為止還沒有報導，其是一種非常高效的純化方法。首先，製備RJ蛋白質溶液。具體而言，使用孔徑為IOkDa的透析膜，對向RJ(中國產)中加入純水得到的懸濁物通過純水透析72小時。回收透析膜內液體，冷凍乾燥後，再將其懸濁於含有NaR的Tris緩衝液(0. 2% NaN3^lOmM Tris-HCl (pH8. 0))中，製備 117mg/25mL的RJ蛋白質溶液(RJ的截斷值為IOkDa)。接著，將RJ蛋白質溶液應用於參考例1中製造的膽汁酸結合型親和色譜柱上以後，按照與參考例1相同的方式，依次使第1次洗滌液、洗脫液、第2次洗滌液通過該色譜柱。各級分的遷移率和^Onm的吸光度之間的關係如圖2所示。在圖2中，「(1)」、「(2)」 和「⑶」與圖1相同。進一步地，回收由洗脫液洗脫的級分(圖2中的「A」，以下稱作「級分A」)。<通過膽汁酸結合型親和色譜柱分離、純化的RJ來源的膽汁酸結合蛋白質的鑑定
>對通過膽汁酸結合型親和色譜柱分離、純化的RJ來源的膽汁酸結合蛋白質進行鑑定。首先，使用孔徑為IOkDa的透析膜，在4°C條件下，以純水對級分A進行透析、脫鹽 72小時。回收透析膜內的液體，通過冷凍乾燥，製備脫鹽級分A。接著，將脫鹽級分A提供至10 %的SDS-PAGE，分離出其中含有的蛋白質。SDS-PAGE 的結果如圖3所示。在圖3中，「std」意指分子量標準，「A」意指脫鹽級分A，上述為分別使用的物質。在該結果的A欄中，在約49 75kDa範圍內檢測到3個條帶(圖3中(1) (3))。由該結果可知，脫鹽級分A溶液中含有與膽汁酸結合的3種RJ來源的蛋白質。從SDS-PAGE的凝膠上將各條帶切下來，還原烷基化以後，通過胰蛋白酶處理進行蛋白膠內酶解(In-gel digestion)。然後，對通過凝膠提取的肽片段進行脫鹽純化，使用 MALDI-T0F/MS進行質量分析。由該結果可以鑑定在圖3中，條帶(1)為MRJP3，條帶O) 為MRJP1，條帶(3)為MRJP2。對得到的SDS-PAGE的結果中的CBB染色圖像進行圖像解析 (Image J分析)時，上述3種蛋白質的比例為MRJP1為76%，MRJP2為22%，MRJP3為2%。[實施例2]測定由RJ分離純化的MRJPl和MRJP2的膽汁酸結合能力。首先，使用凝膠過濾色譜法從RJ中對MRJPl進行分離純化。具體而言，首先，將5mL 的按照與實施例1相同方式製備的23. 5mg/5mL的RJ蛋白質溶液(RJ的截斷值為IOkDa) 應用於HiLoad superdex 200p. g(GEhealthcare公司製造)上。然後，將洗脫液QOmM Na2HPO4. 20mM NaH2PO4150mM NaCl、pH7. 5)以洗脫速度 1. 5mL/min通過該色譜柱，以每5mL為一個級分進行回收。各級分的遷移率和^Onm的吸光度的關係如圖4所示。此外，使用RJ 蛋白質溶液的同時，將36mg/ml的凝膠過濾標準品(Gel Filtration Standard) (BIO-RAD 公司製造)應用至該色譜柱上，研究遷移率(從洗脫開始的總洗脫量)和該級分中含有的分子的大小之間的關係，製作校正曲線。製作的校正曲線如圖5所示。本發明人對從上述的膽汁酸結合型親和色譜柱洗脫的複合體進行凝膠解析時發現，含量最多的是MRJPl級分。由圖5中所示標準品的遷移率和分子量得到的校正曲線可知，圖4中所示的凝膠過濾色譜中的級分B(級分B 圖4中的虛線所包圍的級分)的分子量接近於約290kDa。將該級分提供至15%的SDS-PAGE，如圖6所示，在約55kDa的位置檢測出單一的條帶。此外，使用MALDI-T0F/MS對該級分中含有的分子進行質量分析，可以判定其為含有MRJPl的級分。由上述結果可以確認MRJP1約為55kDa，RJ中存在5 6聚體。 以下將該級分稱作MRJPl級分。需要說明的是，通過定量可知在該MRJPl級分中不含有非專利文獻5中所報導的可以降低高血脂症大鼠的血液中的甘油三酯、總膽固醇的10-羥基癸烯酸。
本發明人對從上述的膽汁酸結合型親和色譜柱洗脫的複合體進行凝膠解析時發現，其含量僅次於含量最多的MRJPl級分的級分是MRJP2級分。對圖4中所示的凝膠過濾色譜中的級分E(級分E 圖4中的點虛線所包圍的級分)中所含有的蛋白質進行研究。由圖5 中所示標準品的遷移率和分子量得到的校正曲線可知，該級分E的分子量接近於約51kDa。 將該級分E提供至15%的SDS-PAGE時，如圖7所示，在約46 66kDa的位置檢測出2條條
市ο此外，將該級分E提供至陰離子色譜，對單一的蛋白質進行純化。具體而言，使用結合用溶液OOmM Tris-HCl、pH8. 0)將級分E稀釋為125mg/5mL，然後將5mL應用於Hift^p Q FF(GE Healthcare 公司製造)。接著，使用洗脫液(20mM Tris-HCl、0· 5M NaCl、pH8.0)， 以圖8中虛線所示的流動相中氯化鈉濃度為0 0. 5M範圍的梯度濃度施加流動相，使蛋白質洗脫。需要說明的是，流動相的流動速度為1.5mL/min。各級分的遷移率和280nm的吸光度之間的關係如圖8所示。將圖8中所示的峰 1 4分別提供至15%的SDS-PAGE時，如圖9所示，檢測出峰1至峰2為單一的條帶。因此，將峰1和峰2合併回收，使用MALDI-T0F/MS對該級分中含有的分子進行質量分析，可以判定其為含有MRJP2的級分。以下將該級分稱作MRJP2級分。通過透析法對上述純化了的MRJPl和MRJP2的膽汁酸結合能力進行評價。分別使用抗高膽固醇劑消膽胺作為陽性對照，使用酪蛋白作為陰性對照。具體而言，向含有牛磺膽酸的磷酸緩衝液(50mM牛磺膽酸、IOOmM磷酸緩衝液、 PH7. 4)中分別添加消膽胺、酪蛋白、MRJPl級分、MRJP2級分、或者將未經處理的RJ(生RJ) 冷凍乾燥得到的物質，使其濃度分別為100mg/mL，將其作為反應溶液。將這些反應溶液於 37°C培養2小時後，在室溫下透析72小時。通過測定透析膜外液中含有的總膽汁酸量，可以計算出透析膜內液體中含有(即，與各分子結合)的膽汁酸的比例。計算出的與各分子結合的膽汁酸的比例如圖10所示。圖10中的「htactRJ」是添加了將未經處理的RJ冷凍乾燥後得到的物質的反應溶液的結果。其結果為與陰性對照組的酪蛋白(33% )相比，MRJPl的膽汁酸結合能力為46%，MRJP2的膽汁酸結合能力為 37%。S卩，MRJPl顯示出比MRJP2更高的膽汁酸結合能力。[實施例3]〈膽固醇膠束溶解性試驗>測定由RJ分離純化的MRJPl和MRJP2對膽固醇膠束溶解的抑制能力。MRJPl和 MRJP2分別使用實施例2中製備的MRJPl級分和MRJP2級分。此外，使用酪蛋白作為陰性對照。首先，在20mL的玻璃管內取以下級分[4_14C]膽固醇/氯仿(Perkin Elmer Life Science公司製造)並使其最終濃度為3. 7kBq/mL(2. lGbq/mmol, NEN)，膽固醇(片山化學工業公司製造)/氯仿並使其最終濃度為2 μ M，油酸(SIGMA公司製造)/氯仿並使其最終濃度為20 μ Μ,單油醯反式甘油(MONO 0LE0YL-RAC GLYCEROL) (SIGMA公司製造)/氯仿並使其最終濃度為5 μ M，L- α -卵磷脂(SIGMA公司製造)/氯仿並使其最終濃度為0. 6mM,將其充分混合後，吹入氮氣使其乾燥。然後，將得到的乾燥固體物溶解在含有6. 6mM的牛磺膽酸(SIGMA公司製造)和132mM的NaCl的15mM磷酸緩衝液(pH7. 4)中。使用旋渦混合器
10(vortex mixer)攪拌2分鐘後，進行超聲波處理(25W，輸出功率6，3分鐘)，然後在37°C — 邊振蕩一邊進行培養M小時，製備[14C]膽固醇膠束溶液。在膽固醇膠束溶解性試驗中，具體而言，向[14C]膽固醇膠束溶液中添加酪蛋白、 MRJP1、或MRJP2使其最終濃度為10mg/mL，並將其作為反應溶液。使用旋渦混合器對各反應溶液攪拌2分鐘後，進行超聲波處理(25W，輸出功率6，3分鐘)，然後在37°C培養1小時，接著，在37°C、100，000 Xg條件下，對380 μ L溶液進行離心分離1小時，並回收上清液。向回收的50 μ L上清液中加入IOmL乳化閃爍劑(乳化〉> f > 一夕一)，通過液體閃爍計數器測定上清液中的[14C]膽固醇。上清液中存在著在水溶液中穩定溶解的膽固醇膠束。因此， 通過上清液中的[14C]膽固醇量佔反應溶液中預先添加的[14C]膽固醇量的比例，可以計算出在水溶液中穩定溶解的膽固醇膠束的比例。膽固醇在膠束中的溶解比例如圖11中所示。通過Duncan多範圍檢驗，以ρ <0. 05 對各試驗區域進行統計學上的顯著性差異檢驗處理。與陰性對照組的酪蛋白(79%)相比， MRJPl為46%，顯著降低。與其相比，MRJP2為93%，顯著增加。即，可以明確MRJPl具有膽固醇膠束溶解抑制能力。[實施例4]〈大鼠口服給藥試驗〉對作為高脂血症模型的攝取膽固醇的大鼠，口服給藥從RJ分離純化的MRJP1， 研究其對血清膽固醇帶來的影響。MRJPl使用實施例2中製備的MRJPl級分。此外，使用酪蛋白作為陰性對照。如圖12所示，在試驗的3天時間裡，向攝取含有膽固醇的食物的大鼠一天一次地口服給藥MRJPl或酪蛋白。在第三次給藥開始經過M小時後，禁食4小時，然後通過心臟採血將大鼠處死。使用採集的血液，測定血清膽固醇。進一步解剖，測定肝臟重量。其他的具體試驗條件如下所示。試驗組4周齡的Wistar系雄性大鼠(70g)試驗組數η = 9開始給藥時間AM8 00試驗飼養時間3天(預飼養3天)禁食時間4小時試驗樣品酪蛋白鈉(CS)或MRJPl (MR)給藥量300mg/kg(B. W. ) / 天或 600mg/kg (B. W. ) / 天食物組成20%酪蛋白+1%膽固醇通過在3000rpm條件下進行離心分離15分鐘來製備血清。使用酶法，具體而言使用市售的試劑盒(膽固醇Ε-test worker ；和光純藥工業公司製造)對血清膽固醇進行定量測定。同樣地，使用HDL-膽固醇Ε-test worker (和光純藥工業公司製造)測定HDL-膽固醇。通過計算求出LDL+VLDL-膽固醇。各種測定結果等如圖13 16所示。需要說明的是，各數值為1組9隻的平均值士標準偏差，在試驗結果的統計學分析中，使用Duncan多範圍檢驗和Mudent』 s t檢驗。分別將各試驗組的體重變化示於圖13中，將每天的食物攝取量示於圖14中，將肝臟重量示於圖15中。其結果，在各組中，酪蛋白鈉(CS)給藥組和MRJPl (MR)給藥組之間並未發現有顯著性差異。另一方面，如圖16所示，在300mg/kg(B. W.)/天的給藥組和600mg/kg (B. W.) /天的給藥組的任意給藥組中，與酪蛋白鈉(⑶)給藥組相比，MRJPl(MR)給藥組觀察到了血清總膽固醇量降低的傾向。特別是600mg/kg(B.W.)/天的給藥組，與酪蛋白鈉(CS)給藥組相比，MRJPl(MR)給藥組的血清總膽固醇量顯著(Duncan多範圍檢驗和Mudent』 s t檢驗兩者中的P < 0. 05)降低。由上述結果可知，通過口服給藥分離純化的MRJP1，可以使血清總膽固醇量降低。[實施例5]〈大鼠口服給藥試驗〉除了將試驗組數設定為10隻(n = 10)、試驗飼養時間設定為7天(預飼養3天)、 給藥量設定為600mg/kg(B. W.)/天以外，其它和實施例4相同，向高膽固醇血症的模型，即攝取1 %膽固醇的大鼠口服給藥從MR分離純化的MRJPl持續7天。研究對其血清膽固醇帶來的影響。分別將各試驗組的體重變化示於圖17中，將每天的食物攝取量示於圖18中，將肝臟重量示於圖19中，將血清總膽固醇量示於圖20中。需要說明的是，各數值為1組10隻的平均值士標準偏差，在試驗結果的統計學分析中，使用Mudent』 s t檢驗。其結果，在體重的變化、每天的食物攝取量、以及肝臟重量方面，酪蛋白鈉(CS)給藥組和MRJPl(MR)給藥組未見明顯差異。另一方面，與酪蛋白鈉(CS)給藥組相比，MRJPl (MR)給藥組的血清總膽固醇量顯著(約)降低(Student's t檢驗中，ρ < 0. 05)。特別是血清LDL膽固醇和血清VLDL 膽固醇的總量顯著降低。由上述結果可知，通過口服給藥分離純化的MRJPl持續7天，可以使血清總膽固醇量降低。工業實用性降低本發明的膽汁酸結合劑、血清膽固醇量的方法，可通過口服給藥RJ來源的膽汁酸結合劑，使血清膽固醇的量安全地降低。因此，本發明的膽汁酸結合劑等，可以作為治療、預防特別是高膽固醇血症、動脈硬化症的醫藥、功能性食品等的有效成分。
權利要求
1.一種膽汁酸結合劑，其以選自MRJPl、MRJP2和MRJP3中的一種以上作為有效成分。
2.一種血清膽固醇量降低劑，其以MRJPl作為有效成分。
3.—種膽固醇量膠束的溶解抑制劑，其以MRJPl作為有效成分。
4.一種使血清膽固醇量降低的方法，該方法包括口服攝取MRJP1。
全文摘要
本發明提供一種以RJ中含有的特定成分作為有效成分的膽汁酸結合劑以及使用該特定成分使血清膽固醇量降低的方法，所述特定成分具備膽汁酸結合能力、高膽固醇血症改善能力。本發明提供一種膽汁酸結合劑，其特徵在於，以選自MRJP1、MRJP2和MRJP3中的一種以上作為有效成分；本發明提供一種血清膽固醇量降低劑，其特徵在於，以MRJP1作為有效成分；本發明提供一種膽固醇量膠束的溶解性降低劑，其特徵在於，以MRJP1作為有效成分；本發明提供一種使血清膽固醇量降低的方法，其特徵在於，口服攝取MRJP1。
文檔編號A23L1/305GK102451464SQ20111032543
公開日2012年5月16日 申請日期2011年10月24日 優先權日2010年10月26日
發明者中村正, 兼松智, 加島優裡, 後藤剛, 川島拓司, 渡邊鈴代, 草田未央, 長岡利 申請人:國立大學法人岐阜大學, 株式會社秋田屋本店