一種製備頭孢氨苄的方法
2023-09-20 17:10:45 1
一種製備頭孢氨苄的方法
【專利摘要】本發明公開了一種製備頭孢氨苄的方法，該方法是將左旋苯甘氨酸酯類衍生物與7-ADCA按照摩爾比為1.15~1.6:1的比例投料，再按照7-ADCA1~2倍的投料量加入催化劑青黴素醯化酶進行醯化反應；其中所述的青黴素醯化酶其編碼的基因序列如SEQIDNO:3所示。本發明有效克服了酶縮合反應過程中的逆反應，由此大大降低了側鏈的使用量、避免了側鏈過高消耗所導致的產品雜質多的問題，由此也避免了目的產物難以純化的問題。與此同時，本發明方法還大大提高了7-ADCA的轉化率（採用本發明方法可使7-ADCA平均轉化率達到98%以上），由此也進一步提高了產品品質，降低了生產成本。
【專利說明】一種製備頭孢氨苄的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及抗生素合成技術，具體的說是一種製備頭孢氨苄的方法。
【背景技術】
[0002]頭孢氨節,英文名稱Cephalexin,是一種半合成β -內醯胺類抗生素,具有廣譜抗菌作用，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抗菌作用，其作用機理是通過抑制細胞壁的合成，使細胞內容物膨脹至破裂溶解，從而達到殺菌作用。
[0003]頭孢氨苄的合成工藝主要有化學方法合成和酶法合成兩種，化學合成法是在二氯甲烷溶劑中從左旋苯甘氨酸乙基鄧鉀鹽混酐後，與經過羧基保護的7ADCA進行反應，經化學方法縮合而得到頭孢氨苄。最終每生產Ikg頭孢氨苄會產生IOkg以上的三廢。在這種情況下，酶法合成工藝逐漸受到更多的關注和研究。酶法合成技術是在青黴素醯化酶的催化下，通過用側鏈(即左旋苯甘氨酸衍生物，如苯甘氨酸甲(乙)酯及其鹽、苯甘氨醯胺及其鹽等)對7-ADCA進行醯化反應來生產頭孢氨苄，使側鏈與7-ADCA縮合製得頭孢氨苄。這一工藝已被專利文獻廣泛描述，如CN100368554C、CN1063491C及CN02826109.7等。與傳統的化學方法相比較，酶法合成無論從降低成本、簡化工藝，還是從環境友好等方面考慮，都具有明顯優勢。但其仍有許多不盡人意之處。如:現有酶法合成頭孢氨苄的工藝其酶縮合反應過程中存在較嚴重的酶解反應，即反應產物在酶的作用下再度逆分解成原料，由此大大影響了正反應產率。為提高酶縮合反應的產率，生產者通常是加大側鏈對母核的投料量，有的甚至過量4~6倍(摩爾比)，由此又造成側鏈過高消耗，並在產品中引入了不需要的雜質，最終導致產物純度低以及產品分離、純化困難等諸多問題。
【發明內容】
`[0004]本發明的目的是提供一種製備頭孢氨苄的新方法，以解決現有工藝存在側鏈投料量大、酶解反應嚴重、產品純度低、製備成本高，環境汙染嚴重等問題。
[0005]本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
[0006]一種製備頭孢氨苄的方法，該方法是將左旋苯甘氨酸酯類衍生物與7-ADCA按照摩爾比為1.15~1.6:1的比例投料，再按照I~2倍於7-ADCA的投料量加入催化劑青黴素醯化酶進行醯化反應；其中所述的青黴素醯化酶其編碼的基因序列如SEQ ID Ν0:3所示。
[0007]具體的，本發明的方法包括以下步驟:
[0008]a)將左旋苯甘氨酸酯類衍生物在30~120min內緩慢加入到7-ADCA水溶液中，然後加入所述的青黴素醯化酶，在15~25°C進行醯化反應；反應過程中PH維持在6.0~7.2 ；
[0009]b)待反應終止後，過濾80~120目篩網，即得到濾物一青黴素醯化酶，濾液一頭孢氨節混懸液；
[0010]c)將頭孢氨苄混懸液過濾，得到頭孢氨苄粗粉。
[0011]所述左旋苯甘氨酸酯類衍生物為左旋苯甘氨酸甲酯及其鹽、苯甘氨酸乙酯及其鹽中的任意一種。
[0012]優選的，所述左旋苯甘氨酸酯類衍生物為左旋苯甘氨酸甲酯鹽。
[0013]所述左旋苯甘氨酸甲酯鹽為左旋苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽或左旋苯甘氨酸甲酯硫酸鹽。
[0014]加入到所述7-ADCA水溶液中的左旋苯甘氨酸甲酯鹽為左旋苯甘氨酸甲酯鹽固體、左旋苯甘氨酸甲酯鹽溶液或左旋苯甘氨酸甲酯鹽混懸液。
[0015]所述7-ADCA水溶液其質量濃度為10~15%，其水溶液的溫度為15~25°C，PH為
7.8 ~8.0。
[0016]a)步所述醯化反應過程中，使用氨水維持PH在6.0~7.2。
[0017]待a)步所述醯化反應的反應液出現渾濁之後，開始向反應液中緩慢加入純化水。
[0018]具體的，所述a)步，將從開始反應至反應液開始出現渾濁的時間記為A，當反應時間為2~3XA時，開始緩慢加入純化水，並在加入純化水的過程中用HPLC法判斷反應終點。
[0019]具體的，所加入純化水的量與反應液的體積比為0.15~0.5: I ;所述加入純化水的過程用時20~60min。
[0020]優選的，所述左旋苯甘氨酸酯類衍生物與所述7-ADCA按照摩爾比為1.15~1.3: I的比例投料。
[0021]進一步的，所述c)步，用頭孢氨苄混懸液過濾後的濾液洗滌所得到的青黴素醯化酶，然後過濾80~120目篩網，得到濾物一青黴素醯化酶，濾液一頭孢氨苄混懸液，然後將頭孢氨苄混懸液再次過濾，得到頭孢氨苄粗粉；重複本步驟，收集98%以上的頭孢氨苄粗粉。
[0022]更進一步的，將上述所收集的全部的頭孢氨苄粗粉與最後所得濾液混合後，用硫酸調PH至0.1~2.5，然後過0.45 μ m濾膜過濾後得料液，將料液溫度升高至30~60°C、用氨水調節料液PH至4.0~6.0，然後養晶、過濾、水洗滌、丙酮洗滌，最後乾燥，得終產物。
[0023]上述青黴素醯化酶的製備方法如下:
[0024]I)構建SEQ ID NO:3所示的青黴素醯化酶的編碼基因:
[0025]1.1)根據Genebank中無色桿菌屬CCM4824青黴素醯化酶蛋白序列(SEQ ID NO:1，Genebank:AY919310.1 )，將其第330位苯丙氨酸替換為丙氨酸，第415位賴氨酸替換為精氨酸，第770位亮氨酸替換為苯丙氨酸，在這三個位置引入突變位點，即得到如SEQ ID NO:2所示胺基酸序列；
[0026]1.2)根據SEQ ID NO:2所示胺基酸序列，使用在線設計工具Jcat反向設計出核苷酸序列，針對宿主大腸桿菌表達所需的優選密碼子和基因高效表達所需的G + C鹼基含量，優化上述設計的核苷酸序列為SEQ ID N0:3所示序列，SEQ ID N0:3所示序列與野生型基因序列SEQ ID N0:4相比:大腸桿菌稀有密碼子從野生型(SEQ ID N0:4)的55個降低到了 2個，G + C鹼基含量由野生型(SEQ ID NO:4)的68.75%下降到57.25% ;同時在設計過程中去除BamHI酶切位點，有利後期基因操作。通過上述系列設計有利於宿主菌大腸桿菌高效表達該基因(SEQ ID NO:3)。
[0027]2)構建含有I)步所述編碼基因的重組載體:
[0028]所述重組載體所用到的質粒為PET系列誘導型載體，優選PET28質粒；[0029]2.1)將SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列進行全基因合成，獲得ASPGA基因；
[0030]2.2)將所述PET28質粒和所述ASPGA基因分別使用BamH I和Hind III雙酶切體系進行酶切，分別得到ASPGA基因片段和PET28質粒片段；
[0031]2.3)使用T4連接酶對ASPGA基因片段和PET28質粒片段進行連接，將連接後的產物轉化到宿主菌中，然後塗布到LB培養抗性平板，然後挑取生長出的陽性克隆接種到LB液體培養基進行培養後，提取質粒即得到所構建的重組載體——表達載體PET28-ASPGA。
[0032]3)構建含有2)步所述重組載體的重組菌株:
[0033]在E.coli BL21(DE3)或E.coli JM109(DE3)感受態細胞懸液中加入所述重組載體混勻，然後經過冷卻、熱激、冷卻、復甦等步驟，完成轉化，吸取轉化後的細胞塗布加有卡那黴素抗生素的平板，倒置培養，生長出的菌株即為重組菌株——轉化體BL21(DE3)/PET28-ASPGA 或轉化體 JM109 (DE3) /PET28-ASPGA ；
[0034]構建重組菌株時所用的宿主細胞可選擇生工生物工程(上海)有限公司出售的E.coliBL21(DE3)或 E.coli JM109(DE3)。
[0035]4)步驟3)所述重組菌株的誘導表達:
[0036]挑取上述重組菌株的單菌落於含Kan (濃度50 μ g/ml)的LB液體培養基中，37°C、200r/min條件下培養8~IOh後成為活化種子，然後將活化種子以2%的接種量接種到M9培養基中(裝液量 為50ml/250ml)，23°C、200r/min條件下培養14h後，加入IPTG (異丙基-β -D-硫代半乳糖苷)使其終濃度為0.05mM,進行誘導表達，繼續培養12h，得菌液。
[0037]5)粗製酶液的製備及其進一步的分離純化和固定化
[0038]5.1)將4)步得到的菌液離心，收集菌體，然後加入與菌液等體積的磷酸鹽緩衝液(0.02M, PH8.0)重懸，使用超聲細胞破壁儀破壁20min，然後離心取上清，即為粗製酶液；
[0039]5.2)粗製酶液1L，使用0.01M的鹽酸調整PH至5.5，於50°C下保溫30min，然後離心除去沉澱；在上清液中加入15% (質量體積比)的硫酸銨，充分混合後離心除去沉澱，然後在上清液中再次加入15% (質量體積比)的硫酸銨，充分混合後離心收集沉澱；將沉澱溶解於200ml磷酸鹽緩衝液(0.2M，PH8.0)中，即得到濃縮酶液；
[0040]5.3)取濃縮酶液200ml，加入磷酸鹽使其終濃度為0.4M，並調節PH至6.8~7.2，然後加入活化好的LX-1000HA載體20g，於25°C、150rpm條件下攪拌固定化24h，真空抽濾後收集固定化酶，用2倍體積去離子水衝洗3-5遍，過濾收集得到固定化酶，即為a)步所述其編碼的蛋白質的胺基酸序列如SEQ ID NO:2所示的青黴素醯化酶。
[0041]本發明有效克服了酶縮合反應過程中的逆反應，由此大大降低了側鏈的使用量、避免了側鏈過高消耗所導致的產品雜質多的問題，由此也避免了目的產物難以純化的問題。與此同時，本發明方法還大大提高了 7-ADCA的轉化率(採用本發明方法可使7-ADCA平均轉化率達到95%以上)，由此也進一步提高了產品品質，降低了生產成本。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0042]圖1是本發明所述其編碼的蛋白質的胺基酸序列如SEQ ID N0:2所示的青黴素醯化酶的重組載體。
[0043]圖2是本發明所製備的頭孢氨苄的HPLC譜圖。【具體實施方式】
[0044]下面通過具體實施例對本發明做進一步說明，但不以任何方式意味著對本發明的保護範圍做任何限制。
[0045]以下實施例1~6中，進行HPLC分析的條件為:
[0046]填充劑:十八烷基矽烷鍵合矽膠；
[0047]流動相A:0.01mol/L醋酸鈉水溶液(用冰醋酸調節pH值至5.0);流動相B:甲醇；流速為1.0ml/min，梯度洗脫，見表1 ;
[0048]檢測波長:220nm；
[0049]取雜質對照品溶液10 μ 1，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，7-氨基去乙醯氧基頭孢烷酸峰、α -苯甘氨酸峰、PGME峰和CEX峰的分離度應符合要求。
[0050]表1:
[0051]
【權利要求】
1.一種製備頭孢氨苄的方法，其特徵在於該方法是， 將左旋苯甘氨酸酯類衍生物與7-ADCA按照摩爾比為1.15~1.6:1的比例投料，再按照1`2倍於7-ADCA的投料量加入催化劑青黴素醯化酶進行醯化反應；其中所述的青黴素醯化酶其編碼的基因序列如SEQ ID N0:3所示。
2.根據權利要求1所述的製備頭孢氨苄的方法，其特徵在於它包括以下步驟: a)將左旋苯甘氨酸酯類衍生物在30~120min內緩慢加入到7-ADCA水溶液中，然後加入所述的青黴素醯化酶，在15~25°C進行醯化反應；反應過程中PH維持在6.0-7.2 ； b)待反應終止後，過濾80-120目篩網，即得到濾物一青黴素醯化酶，濾液一頭孢氨節混懸液； c)將頭孢氨苄混懸液過濾，得到頭孢氨苄粗粉。
3.根據權利要求2所述的製備頭孢氨苄的方法，其特徵在於，所述左旋苯甘氨酸酯類衍生物為左旋苯甘氨酸甲酯及其鹽、左旋苯甘氨酸乙酯及其鹽中的任意一種。
4.根據權利要求3所述的製備頭孢氨苄的方法，其特徵是，所述左旋苯甘氨酸甲酯鹽為左旋苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽或左旋苯甘氨酸甲酯硫酸鹽。
5.根據權利要求3所述的製備頭孢氨苄的方法，其特徵是，加入到所述7-ADCA水溶液中的左旋苯甘氨酸甲酯鹽為左旋苯甘氨酸甲酯鹽固體、左旋苯甘氨酸甲酯鹽溶液或左旋苯甘氨酸甲酯鹽混懸液。
6.根據權利要求2所述的製備頭孢氨苄的方法，其特徵是，所述7-ADCA水溶液其質量濃度為10~15%，其水溶液的溫度為15~25°C，PH為7.8~8.0。
7.根據權利要求 2所述的製備頭孢氨苄的方法，其特徵是，a)步所述醯化反應過程中，使用氨水維持PH在6.0-7.2。
8.根據權利要求2所述的製備頭孢氨苄的方法，其特徵是，a)步所述醯化反應的反應液出現渾濁之後，向反應液中緩慢加入純化水。
【文檔編號】C12P35/04GK103805671SQ201410046595
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月11日 優先權日:2013年11月11日
【發明者】劉 東, 楊夢德, 胡國剛, 甘平娟, 張鎖慶, 魏闊, 楊宏利, 張文勝, 劉力強, 王新輝, 曹歡, 黃剛 申請人:華北製藥河北華民藥業有限責任公司