與缺血性腦卒中組織特異性結合的HGG多肽及其應用的製造方法與工藝

2023-09-21 02:40:40

本發明屬於蛋白質多肽技術領域，涉及一種與病理組織特異性結合肽，特別是一種與缺血性腦卒中組織特異性結合的HGG多肽。本發明還涉及該多肽篩選及製備的方法，以及該多肽在製備缺血性腦卒中分子成像探針上的應用。

背景技術：
腦卒中是一種突然起病的腦血液循環障礙性疾病，它是全球第二位致死原因和首位致殘原因，約一半左右的倖存者永久殘疾。中國疾病預防控制中心數據顯示腦卒中也是我國首位致殘原因和「頭號殺手」，我國腦卒中病人700多萬，發病率每年上升8.7％。腦卒中患者救治需要快速恢復腦血流、搶救缺血腦組織，迄今唯一有效治療方法是血管再通，而重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)療效呈時間依賴性，治療時間窗短，目前美國僅有5％、中國僅有1.2％患者可獲得有效的再通治療。在許多情況下，開通閉塞的顱內大血管非但不能使患者獲益，甚至有害，原因包括患者無半暗帶、腦微循環內繼發血栓沉積和血管再通伴隨的再灌注損傷等。目前指導腦卒中早期溶栓治療的「金標準」是正電子發射斷層掃描成像(PET)，但PET空間解析度低、掃描速度慢、費用昂貴及普及率低等缺點限制了其臨床應用。磁共振成像(MRI)的灌注加權成像/彌散加權成像(PWI/DWI)不匹配法已在臨床開始用於指導急性缺血性卒中超早期的溶栓治療，但該法既高估了梗死灶，又高估了半暗帶，依據其判定溶栓的有效性、準確性以及對治療的指導作用尚有待進一步研究。因此，開發高靈敏度指導急性缺血性卒中超早期的溶栓治療的分子探針則顯得尤為重要。開發針對缺血性腦卒中的神經保護藥物對腦卒中患者的救治具有革命性意義。DouglasJ.Cook報導突觸後緻密物蛋白質95(PSD-95)抑制劑可以減小食蟹猴缺血性腦卒中組織面積，保護神經功能損傷。而若通過靶向性肽段遞送這類神經保護類分子有望實現缺血性腦卒中組織更好的藥物富集，達到更顯著的神經保護效果。國家「十二五」規劃明確指出，在生物藥領域，將重點支持單克隆抗體藥物、新型基因工程重組蛋白質及多肽藥物、基因治療藥物、新型疫苗等。多肽藥物可以通過人工方法合成，由於其分子量小、活性高、穿透力強、特異性高、毒性低等特點使其在腫瘤治療上有重要應用價值。目前，全世界獲批上市的多肽類藥物已經超過50個，如目前國際市場上暢銷的亮丙瑞林、戈瑞林、布舍瑞林、促黃體激素拮抗劑等。目前，有140個多肽類藥物在臨床研究中，而在臨床前研發階段中的多肽類藥物達到500至600個，2010年多肽類藥物的全球市場規模約為130億美元。國內市場方面，我國多肽藥物的市場銷售額從2006年的110.82億元上升至2009年的194.79億元，複合年增長率達到20.68％。目前，還沒有靶向缺血性腦卒中組織的多肽。該多肽獲得對開發高靈敏度指導急性缺血性卒中超早期的溶栓治療的分子探針及靶向遞送神經保護類藥物以達到更好的療效都具有重要的應用價值。

技術實現要素：
發明目的：本發明的目的是針對缺乏缺血性腦卒中組織特異性靶向多肽的現狀，提供一種與缺血性腦卒中組織特異性結合的HGG多肽。本發明的另一個目的是提供了上述HGG多肽的篩選方法。本發明的另一個目的是將該HGG多肽偶聯磁性納米材料構建特異性分子探針，在體內水平通過MRI成像評價該探針的特異性及功能。本發明利用生物信息學方法分析上述多肽的理化性質。本發明通過全方位、多層次鑑定多肽的靶向性：噬菌體-肽水平，通過與體內回輸後噬菌體滴度測定及免疫螢光染色鑑定噬菌體單克隆的特異性，通過免疫螢光雙標實驗驗證該噬菌體-肽結合的細胞類型特異性；在合成多肽水平方面，通過免疫螢光實驗鑑定該多肽的缺血腦組織靶向性。技術方案：為了解決上述技術問題，本發明提供了一種與缺血性腦卒中組織特異性結合的HGG多肽，所述HGG多肽的胺基酸序列如SEQIDNO:1所示。上述HGG多肽分子量為800.9，理論等電點為8.75，是由113個原子構成，在哺乳動物的網織紅細胞半衰期為3.5h，該多肽脂溶係數為97.14，總平均親水性為-0.257。上述HGG多肽是通過體內噬菌體展示肽庫篩選技術獲得，並通過化學方法大量標準化合成。上述的HGG多肽的篩選方法，包括以下步驟：1)MCAO模型鼠構建；2)尾靜脈注射噬菌體展示七肽庫：MCAO模型鼠再灌注1h後，通過尾靜脈注射1×1011pfu噬菌體展示七肽庫，體內循環1h；3)灌流洗滌：戊巴比妥鈉腹腔麻醉後，打開胸腔，左心室進針灌注PBS，充分洗滌去除非特異性結合的噬菌體克隆；4)解剖取腦：解剖取出全腦，分離缺血側及對側半腦，投入裝有LB液體培養基中；5)組織勻漿釋放噬菌體克隆：組織稱重後充分勻漿，釋放出噬菌體克隆；6)噬菌體克隆擴增：將勻漿液測滴度，剩餘勻漿液加入處於對數生長前期的E.coliER2738培養物中進行擴增；7)擴增的噬菌體次級庫再投入下一輪篩選，方法同步驟1)～6)，總共經過四輪篩選即得含有與缺血性腦卒中組織特異性結合的多肽的噬菌體克隆。上述的與缺血性腦卒中組織特異性結合的HGG多肽在MCAO模型體內的靶向性及成像方面的應用。上述的與缺血性腦卒中組織特異性結合的HGG多肽在製備高靈敏度分子成像探針方面的應用。在製備高靈敏度分子成像探針方面的應用中，上述HGG多肽與磁性氧化鐵納米顆粒偶聯後構建磁共振成像分子探針。上述的與缺血性腦卒中組織特異性結合的HGG多肽在製備靶向遞送神經保護藥物載體方面的應用。有益效果：本發明具有以下優點：1、本發明篩選得到了一種特異性與缺血性腦卒中組織結合的HGG多肽，填補了國內目前缺乏與缺血性腦卒中組織特異性結合的多肽的空白。2、本發明篩選獲得的七肽可通過人工方法合成，小分子多肽分子量小、活性高、穿透力強、特異性高、毒性低，適合構建體內成像分子探針及用於靶向藥物遞送。3、本發明篩選得到的HGG多肽在噬菌體肽及合成肽水平體內實驗均證實具有良好的特異性，為該多肽的臨床前深入研究奠定了堅實的基礎。4、本發明篩選得到的HGG多肽可構建特異性分子探針用於缺血性腦卒中分子成像並可以靶向遞送神經保護類藥物至神經元細胞，增強藥物的神經保護作用。附圖說明圖1為滴度測定法鑑定HGG-M13體內與缺血性腦卒中組織結合特異性圖(*表示P值小於0.05，**表示P值小於0.001)；圖2為噬菌體免疫螢光染色法鑑定HGG-M13體內與缺血性腦卒中組織結合特異性圖(標尺長度代表100μm)；圖3為HGG-M13結合的細胞類型特異性鑑定圖(標尺長度代表100μm)；圖4為螢光標記HGG多肽體內與缺血性腦卒中組織結合特異性鑑定圖(標尺長度代表100μm)；圖5為HGG-NPs磁共振分子探針在MCAO模型中小動物活體成像圖。具體實施方式本發明通實施例中所用的實驗材料、試劑及試劑配方如下：主要實驗材料：1、噬菌體展示肽庫Ph.D.-7：購自NewEnglandBioLabs公司。複雜度～2.7×109個轉化子。其-96gIII測序引物為5』-HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3』。隨庫所帶的宿主菌E.coliER2738為四環素抗性的雄性大腸桿菌，以含50％甘油的菌體培養物形式提供。2、C57小鼠：雄性，20g體重，購自軍事醫學科學院，飼養於東南大學SPF級動物房。主要試劑及配方：主要試劑1、噬菌體展示肽庫篩選主要試劑：X-gal、DMF、NaN3、Tween-20、BSA、甘氨酸、四環素均購自Amresco；蛋白腖、酵母提取物購自OXOID。2、特異性鑑定主要試劑：HRP標記鼠抗M13抗體購自Parmacia公司；AlexaFluor555標記羊抗小鼠抗體購自MolecularProbes公司；兔抗小鼠NeuN(神經元Marker)及兔抗小鼠GFAP抗體(星形膠質細胞Marker)購自Millipore公司。主要試劑配方1、LB培養基：每升含10gBacto-Tryptone(細菌用胰蛋白腖)，5gyeastextract(酵母膏)，5gNaCl。高壓滅菌，室溫貯存。2、LB/IPTG/Xgal平板：LB培養基+15g/L瓊脂粉。高壓滅菌，冷卻至低於70℃時，加入1mLIPTG/Xgal，混勻倒平板。平板4℃避光貯存。3、頂層瓊脂：每升含10gBacto-Tryptone，5gyeastextract，5gNaCl，1gMgCl2·6H2O，7g瓊脂粉。高壓滅菌，分成5mL等份。固體培養基室溫貯存，用時微波爐融化。4、四環素貯液：以20mg/mL的濃度溶於50％乙醇中。-20℃避光貯存。用前搖勻。5、LB-Tet平板：LB培養基+15g/L瓊脂粉。高壓滅菌，冷卻至低於70℃時，加入1mL四環素貯液，混勻倒平板。平板4℃避光貯存。6、PBS：每升含NaCl：8.00g，KCl：0.20g，Na2HPO4·12H2O：3.58g、KH2PO4：0.24g，PH＝7.2。高壓滅菌，室溫存儲。7、PEG/NaCl：20％(w/v)PEG-8000，2.5MNaCl。高壓滅菌，室溫貯存。8、碘化物緩衝液：10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA，4MNaI。室溫避光貯存。9、IPTG/X-gal配方：將1.25gIPTG(isopropylβ–D-thiogalactoside)和1gX-gal溶於25mL二甲基甲醯胺中。溶液-20℃避光貯存。以上為本發明8個實施例中所用主要材料和試劑。下面詳細介紹具體實施方式。實施例1HGG多肽的篩選及製備本實例採用體內噬菌體展示肽庫篩選技術獲得與缺血性腦卒中組織特異性結合的HGG多肽，具體步驟如下：1、MCAO模型構建：C57小鼠用0.4％戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定。頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內緣分離肌肉和筋膜，分離右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)。近心端結紮CCA，遠心端結紮ECA，用微動脈夾暫時夾閉ICA，然後在ECA分叉部2mm處剪一小口，將拴線插入到ICA，用纖維外科鑷輕推拴線，從血管分叉處開始算距離，當插入深度在1cm時，緊緊系牢ECA遠心端的細線。缺血1h，解開ECA遠心端的細線，輕輕將栓線拔出，立即緊緊系牢ECA遠心端的細線，防止出血。同時，鬆開CCA近心端細線，恢復CCA供血。通過Longa法對模型進行神經功能評分。Longa法神經功能評分分5個等級：0分，正常，無神經功能缺損；1分，左側前爪不能完全伸展，輕度神經功能缺損；2分，行走時，向左側(癱瘓側)轉圈，中度神經功能缺損；3分，行走時，身體向左側(癱瘓側)傾倒，重度神經功能缺損；4分，不能自發行走，有意識喪失。選取神經功能評分2分的MCAO模型鼠(中度神經功能缺損)進行體內噬菌體展示肽庫的篩選。2、尾靜脈注射噬菌體展示七肽庫：MCAO模型鼠再灌注1h後，通過尾靜脈注射1×1011pfu噬菌體展示七肽庫，體內循環1h。3、灌流洗滌：0.4％戊巴比妥鈉腹腔麻醉後，打開胸腔，左心室進針灌注PBS合計200mL，充分洗滌去除非特異性結合的噬菌體克隆。4、解剖取腦：解剖取出全腦，分離缺血側及對側半腦，投入裝有500μLLB液體培養基的1.5mLEppendorf管中。5、組織勻漿釋放噬菌體克隆：組織稱重後充分勻漿，釋放出噬菌體克隆。6、噬菌體克隆擴增：將勻漿液測滴度，剩餘勻漿液加入處於對數生長前期的20mLE.coliER2738培養物中進行擴增。7、擴增後的噬菌體次級庫用於下一輪篩選，篩選方法同上；其中，N輪篩選投入的噬菌體是N-1輪洗脫液擴增後的噬菌體次級庫；四輪篩選後，在LB/IPTG/Xgal平板上測定第四輪淘選所得勻漿液滴度。從第四輪篩選所得勻漿液滴度板上用滅菌牙籤或吸頭挑取120個藍色噬菌斑到至1mL對數生長前期的E.coliER2738培養管中，擴增單克隆噬菌體。根據每輪篩選噬菌體勻漿液的滴度，計算每g組織的得率及富集度。每g組織的得率＝每g組織回收的噬菌體數/總投入噬菌體數。富集度＝第n輪篩選每g組織的得率/第n-1輪篩選每g組織的得率(n≥2)。整個篩選過程的選擇壓及富集情況如表1所示，四輪篩選後，與缺血性腦卒中組織結合的噬菌體克隆合計富集了10.4倍。表1與缺血性腦卒中組織結合的多肽體內篩選的選擇壓控制及噬菌體克隆的富集情況實施例2噬菌體單克隆DNA提取及序列測定本實施例提取120個候選噬菌體單克隆的DNA並進行序列測定。實施例1中挑取的單克隆噬菌體擴增後，離心去除細菌，取500μL噬菌體上清加入200μLPEG/NaCl，混勻冰上靜置10min，4℃14000rpm離心10min，沉澱物徹底重懸於100μL碘化物緩衝液，加250μL乙醇，室溫溫育10min後，離心10min，棄上清，用70％乙醇洗沉澱，短暫真空乾燥後沉澱重懸於30μLTE，進行測序。本實施例中所有測序均由華大基因完成。測序引物為-96gIII：5』-HOGTATGGGATTTTGCTAAACAAC-3』。利用SeqMan軟體分析噬菌體克隆測序結果，並根據遺傳密碼錶將鹼基序列翻譯為胺基酸序列。統計發現測序成功的106個噬菌體克隆共有17種序列，其中有59個噬菌體克隆攜帶外源插入序列如SEQIDNO:1所示，佔55.66％，命名為HGG。實施例3HGG多肽的合成及螢光修飾HGG多肽由吉爾生化(上海)有限公司按照所述胺基酸序列通過化學方法人工合成。合成產物通過高效液相色譜(HPLC)純化，經質譜(MS)鑑定。本發明所述多肽的純度均在95％以上。HGG多肽螢光標記由吉爾生化(上海)有限公司完成。修飾方式為HGG肽-COOH端增加一個賴氨酸K，通過其側鏈氨基與5-TAMRA螢光染料連接。本發明所述5-TAMRA螢光標記肽通過高效液相色譜(HPLC)純化，經質譜(MS)鑑定，純度均在95％以上。實施例4HGG多肽理化性質本實施例利用ExPASy網站提供的ProtParamtool(http://web.expasy.org/protparam/)分析HGG多肽理化性質。如表2所示，該多肽分子量為800.9，理論等電點為8.75，是由113個原子構成，在哺乳動物的網織紅細胞半衰期約為3.5h，該多肽較穩定，該多肽脂溶係數為97.14，總平均親水性為-0.257。表2HGG肽理化特徵分析實施例5HGG-M13噬菌體-肽克隆與缺血性腦卒中組織結合特異性鑑定本實施例選取攜帶HGG外源插入片段的噬菌體-肽克隆(命名為HGG-M13)，通過噬菌體體內回輸實驗鑑定其與缺血性腦卒中組織結合的特異性。1.滴度測定法鑑定HGG-M13的特異性構建MCAO模型，尾靜脈注射1×1011pfu噬菌體，循環1h後異氟烷麻醉，左心室PBS灌流200mL，解剖分離全腦後一分為二(缺血側及對側)，稱重後組織勻漿，釋放噬菌體。測定噬菌體滴度。計算並比較單位質量的組織中噬菌體的滴度值。本實驗中實驗組注射HGG-M13，對照組注射不含外源插入片段的Insertless-M13，假手術組拴線插入頸內但不入腦。如圖1所示，HGG-M13在MCAO模型組，缺血同側單位質量(g)腦組織的滴度值顯著高於對側腦組織，二者比值為1.85，差異具有統計學意義。在假手術組，HGG-M13在缺血同側及對側腦組織的分布並沒有顯著差異。以上結果說明了HGG-M13與缺血性腦卒中組織結合的特異性。同時，在缺血同側HGG-M13在單位質量的腦組織中的滴度也顯著高於Insertless-M13的滴度，進一步說明了HGG-M13與缺血腦卒中組織特異性結合是依賴於外源的插入片段HGG。2.免疫螢光法鑑定HGG-M13的特異性構建MCAO模型，尾靜脈注射1×1011pfu噬菌體，循環1h後異氟烷麻醉，左心室灌流PBS200mL充分去除未結合的噬菌體克隆，繼續4％PFA50mL灌注固定，解剖分離全腦，PFA過夜固定後蔗糖梯度脫水，OCT包埋，冰凍切片。冰凍切片組織與鼠抗M13抗體37℃孵育1h，洗滌6次後，加入AlexaFluor555螢光標記抗小鼠二抗，37℃孵育1h。洗滌6次後，DAPI進行細胞核染色，封片觀察。如圖2所示，在MCAO模型缺血同側有明顯HGG-M13紅色螢光信號，且遠高於對側螢光信號強度，說明HGG-M13在腦卒中缺血側的特異性分布。同時，HGG-M13在腦卒中缺血側的螢光信號明顯高於Control-M13的螢光信號，進一步說明了HGG-M13與缺血腦卒中組織結合的特異性，且這種特異性的結合是依賴於外源的插入片段HGG。實施例6HGG-M13結合的細胞類型特異性鑑定本實施例通過免疫螢光雙染方法研究HGG-M13與神經元及星形膠質細胞的共定位情況，鑑定HGG-M13結合的細胞類型特異性。構建MCAO模型，尾靜脈注射1×1011pfu噬菌體-肽HGG-M13，循環1h後異氟烷麻醉，左心室灌流PBS200mL充分去除未結合的噬菌體克隆，繼續4％PFA50mL灌注固定，解剖分離全腦，PFA過夜固定後蔗糖梯度脫水，OCT包埋，冰凍切片。冰凍切片組織與鼠抗M13抗體及兔抗小鼠NeuN(神經元Marker)或兔抗小鼠GFAP抗體(星形膠質細胞Marker)37℃孵育1h，洗滌6次後，加入AlexaFluor555螢光標記抗小鼠二抗及AlexaFluor488螢光標記抗兔二抗，37℃孵育1h。洗滌6次後，DAPI進行細胞核染色，封片觀察。如圖3所示，在MCAO模型缺血同側HGG-M13的螢光信號與NeuN(神經元Marker)共定位，而不與GFAP(星形膠質細胞Marker)共標，說明HGG-M13主要與缺血腦卒中組織中的神經元細胞結合。HGG-M13與缺血腦卒中組織中的神經元細胞結合提示該肽段可以用於靶向遞送神經保護藥物，更好保護腦缺血後受損的神經元。實施例7外源合成的HGG肽與缺血性腦卒中組織結合的特異性構建MCAO模型，尾靜脈注射螢光標記HGG肽HGG-(5-TAMRA)，循環15min後異氟烷麻醉，左心室灌流PBS100mL充分去除未結合的肽段，繼續4％PFA50mL灌注固定，解剖分離全腦，PFA過夜固定後蔗糖梯度脫水，OCT包埋，冰凍切片。DAPI進行細胞核染色，封片觀察。如圖4所示，在MCAO模型缺血同側有明顯HGG-(5-TAMRA)紅色螢光信號，且遠高於對側螢光信號強度，而在假手術組，HGG-(5-TAMRA)螢光信號不明顯，說明HGG肽在腦卒中缺血側的特異性分布。同時，HGG多肽在腦卒中缺血側的螢光信號明顯高於對照肽GGG-(5-TAMRA)的螢光信號，進一步說明了HGG多肽與缺血腦卒中組織結合的特異性。實施例8HGG多肽MRI分子成像探針的構建、表徵及Micro-MRI成像本實施例將HGG多肽偶聯順磁性氧化鐵納米顆粒構建磁共振分子探針用於腦卒中缺血性腦組織Micro-MRI成像。合成的分子探針命名為HGG-NPs。通過常規方法對該分子探針進行表徵，結果顯示該探針水合粒徑均值為187nm，具有良好的磁共振造影效能。構建MCAO模型，尾靜脈注射螢光標記HGG-NPs及非靶向性對照探針NPs，在預設時間點行磁共振掃描，掃描序列為T2WI的turboRARE-T2序列，參數為參數為：TR2500ms，TE50ms，FOV2.0×2.0cm，反轉角(FA)180°，矩陣256×256，層厚1mm。如圖5所示，HGG-NPs探針注射30min即可在缺血性腦卒中組織中可發現明顯的暗信號，隨著時間延長，HGG-NPs在缺血性腦卒中組織中逐漸主動富集，說明探針具有良好的特異性和主動靶向性。而非靶向性對照探針NPs在缺血性腦卒中組織則沒有明顯的信號分布，進一步說明了HGG-NPs分子探針的特異性。該實施例提示可以基於HGG多肽構建特異性分子探針，用於缺血性腦卒中組織分子成像。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出：對於本技術領域的技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。