一種篩選紅蓮型細胞質雄性不育水稻新型恢復基因的方法
2023-09-20 06:20:35 1
專利名稱：一種篩選紅蓮型細胞質雄性不育水稻新型恢復基因的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用分子標記檢測技術領域，更具體涉及一種快速定性檢測紅蓮 型細胞質的方法，適用於各種水稻栽培種、農家種和野生稻中水稻紅蓮型配子體細胞質雄 性不育育性恢復基因的篩選。
背景技術：
植物在漫長的進化過程中通過自然突變或重組在基因組內積累了大量的變異，從 而導致同一種內不同株系或品系的差異。這種差異在遺傳水平即表現為彼此間某些DNA片 段的不同。當這種變異與某一特定的基因共分離時，即可作為該基因的特有的分子標籤。如 果將這些DNA片段通過體外擴增、電泳、顯色，就會形成人們肉眼可見的具有不同大小的帶 型。這些不同品系間具有相對差異的帶型即我們通常所說的分子標記，它對某一個品種而 言，具有唯一性。利用分子標記進行品種選擇或品種鑑定是當前植物生物技術育種的主要 內容。它具有準確、快速、不受季節限制等優點，因而在生產中被廣為採用。糧食問題是關係到國計民生的頭等大事。水稻是我國最主要的糧食作物，目前，我 國用僅佔世界7%的耕地面積解決了佔世界22%人口的糧食問題，其根本原因在於雜交水 稻的發明大幅度提高了水稻產量。據估計，到本世紀30年代，我國人口將達到15億，對糧 食的需求也將持續增長。然而，隨著社會的發展，工業、民用及其它用地將不斷增長，並且還 由於沙漠化、水土流失的影響，我國的耕地面積將不斷減少。因此，如何保持糧食生產的穩 步增長以滿足廣大人民生活的需求將是一個長期的課題。雜交水稻的利用是建立在水稻的三種細胞質雄性不育的基礎之上。它們各自擁有 其相應的恢復基因。目前普遍認為水稻野敗型細胞質雄性不育性的恢復是受一對或兩對核 主效恢復基因Rf3和Rf4控制。而紅蓮則分別受一對主效恢復基因Rf5或Rf6)控制；包臺 型的育性恢復受另一對主效恢復基因Rfl所控制。此外分別還有數量不等的隱性微效恢復 基因。關於恢復基因的定位已有多篇文獻報導，Yao等(1997)認為明恢63的兩對野敗 恢復基因Rf3和Rf4分別位於第1和第10染色體，其中Rf3位於RG532上方6. OcM處，Rf4 位於G4003近端粒端3. 3cM處。何光華等(2002)利用SSR分子標記也將明恢63的兩對野 敗恢復基因Rf3和Rf4分別定位於第1和第10染色體，其中Rf3距RM11. 9cM, Rf4位於第 RM258和RM304之間，分別相距2. 9和OcM。推測野敗型、紅蓮型、BT型3種不育胞質恢復 基因在第10染色體上形成基因族，為同一家族基因成員。自80年代以來，已有不少作者證明BT型雄性不育由強弱不同相對獨立的恢復基 因控制，並發現Rfl座位上至少有4個復等位基因。滕利生和申宗坦(1996)進一步分析恢 復BT型和WA型不育系的恢復基因的關係認為，Rfl、Rf2、Rf3和Rf4互相之間是不等位的。 而且同一個恢復基因不能同時恢復BT型和WA型雄性不育性，只有經過重組，將Rfl與Rf3 結合在同一個恢復系之中才能使其各自恢復相應的胞質不育系，強弱恢復基因沒有加性效 應，各恢復基因獨立遺傳，彼此間無明顯的互作效應。
3
紅蓮型CMS水稻的育性同樣受一對恢復基因Rf5或者Rf6控制，不同恢復系中恢 復基因的位點並不相同。黃青陽等(2000)比較分析野敗和紅蓮的育性遺傳發現紅蓮型CMS 水稻的不育基因和野敗不育基因的位點是不等位的，它們彼此間的恢保關係並不相同；野 敗的保持系珍汕97B是紅蓮的恢復系，和密陽23之間的恢復基因是不等位的。並將紅蓮恢 復基因定位在第10染色體長臂，距SSR標記RM258約7. ScM(黃青陽等，1999)；而劉學群等 (2004)又進一步對紅蓮恢復系密陽23和9311的恢復基因基因進行了遺傳分析和定位，證 明9311中含有兩個恢復基因，分別命名為Rf5和Rf6，二者非等位。其中Rf5恢復基因定位 於分子標記HLOl和RM5456之間，分別相距0. 63和1. 57cM。而Rf6介於RM5373和SBD07 之間，分別相距0.4cM。而李紹清(2005)和譚豔平(2008)的研究發現，在野生稻和農家種 中存在多個紅蓮恢復位點，其中至少3個得到了遺傳證明。這些研究表明，在水稻中紅蓮型 細胞質雄性不育具有多個獨立的恢復位點，發掘這些恢復位點對紅蓮型雜交稻的可持續發 展具有重要價值。而恢復基因Rf5、Rf6的精密定位為發掘篩選這些潛在的新型恢復基因奠 定了基石出。
發明內容
本發明的目的在於提供一種篩選紅蓮型細胞質雄性不育水稻新型恢復基因的方 法，該方法將傳統的遺傳分析和分子遺傳標記技術結合起來，有目的地發掘利用新的遺傳 基因資源，精確地選擇新型恢復系，拓寬恢復譜，提高優良恢復基因的聚合選擇效率，促進 雜交水稻的結實率和產量，有利於其可持續發展。為了實現上述的目的，本發明採用以下技術措施一種篩選紅蓮型細胞質雄性不育水稻新型恢復基因的方法，其步驟是1、共分離分子標記的PCR引物設計引物設計基於紅蓮型水稻細胞質恢復基因Rf5和Rf6共分離的分子標記，序列如 下引物Pl(Rf5，53°C )PlF :5』 -ATGACAAATCTGCTCCGATG-3』PlR :5，-CTTACTTAGGAAAGACTAC-3，引物 P2(Rf6，56°C )P2F 5 』 -GGAGATGCTATAGCAGCAGTG-3』P2R 5' -ATTGCTCCTTACCACCTTGC-3』 ；2、PCR擴增體系的建立標準的PCR擴增反應體系共15 μ 1，組成如下50ng/ μ 1的總DNA 1 μ 1， IOXPCRbuffer (ρΗ8. 3) 1. 5 μ 1, 25mM MgCl2O. 6 μ 1，25 μ m dNTP 0. 6μ l,lU/y 1 Taq 酶 0. 6μ 1，5ρΜ 的引物 F 1μ 1，5ρΜ 的引物 R 1μ 1，去離子 ddH20 8. 7 μ 1。反應混合物用礦物油(Sigma)覆蓋，PCR反應程序如下lcycle -MV 5min30cycle :94°C lmin，53 或 56°C lmin，72°C Iminlcycle :72°C 5min3、擴增DNA片段檢測 選恢復位點
(1)以含紅蓮恢復基因Rf5的密陽23 (韓國)和含Rf6的9311 (江蘇省下裡河農 科所)作對照，以與這些恢復基因共分離的分子標記對所有待檢測水稻品種進行PCR擴增， 擴增產物在3. 5% (w/v)的瓊脂糖膠上電泳。(2)將檢測品種擴增的帶型分別與密陽23中Rf5、9311中Rf6共分離的分子標 記帶型進行比較如果某一個水稻品種分子標記的帶型與紅蓮型恢復基因Rf5(密陽23)、 Rf6(9311)帶型不同，那麼就確定該品種可能攜帶與已知的紅蓮Rf5、Rf6不等位的新型候
選恢復基因。4、遺傳分析確證新型恢復基因a、將選擇篩選的含差異標記的候選恢復系與紅蓮不育系粵泰A(廣東省農科院水 稻所)測交，套袋確定育性。如果測交組合可育，說明該候選恢復系可能含新型恢復基因 R，。b、進一步將該候選新型恢復基因恢復系R，與Rf5親本密陽23和Rf6親本9311 雜交，配製雜種F1，即=Rf5 :R，/密陽23 ；Rf6 :R，/9311。c、然後以紅蓮不育系粵泰A作母本與相應的每個雜種Fl測交，將測交組合種植 150株以上的群體，觀察育性分離。如果兩個群體中都出現不育株，說明候選恢復系中所含 的恢復基因與Rf5和Rf6不等位，屬於新的恢復基因R』。本發明的優點本發明與普通遺傳篩選方法相比具有以下優點和效果(1)方法快速、準確、操作方便PCR反應不需要特別的技術培訓，經過短暫培訓的 實驗員均可獨立操作。(2)具有高通量和可預測性，大幅度提高育種效率傳統的雜交方法無法預測雜 交的結果，而通過分子檢測PCR板一次反應可以檢測96個材料，不需要通過大規模的測恢 則可確定具有不同的恢復基因位點，可以事先對材料進行選擇，大幅度提高篩選效率。表1本發明對普通遺傳篩選方法的優勢比較 (3)可以拓寬恢復系育種材料的選擇範圍，增加遺傳多樣性傳統選育恢復系的 方法一般是利用現有的恢復系進行雜交轉育，這樣導致恢復基因類型完全相同。而利用該 方法可以在野生稻和栽培稻中篩選到更多新的紅蓮型恢復基因。
圖IA為一種利用紅蓮恢復基因共分離分子標記進行PCR擴增篩選示意 圖.Marker，DNA分子量標記DL2000，Rf5共分離標記Pl的PCR擴增。圖IB為一種利用紅蓮恢復基因共分離分子標記進行PCR擴增篩選示意 圖.Marker, DNA分子量標記DL2000，Rf6共分離標記P2的PCR擴增。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應當理解，這些實施例僅用於說明本發 明而不用於限制本發明要求保護的範圍，下列實施例中未註明具體實驗條件和方法，通常 按照常規條件如J.薩姆布魯克等主編，科學出版社，1992，分子克隆實驗指南(第二版)； D.L.斯佩克特等，科學出版社，2001，細胞實驗指南；呂鴻聲，科學出版社，1982，或接照制 造廠商所建議的條件。具體步驟如下一種篩選紅蓮型細胞質雄性不育水稻新型恢復基因的方法，其步驟是1、PCR引物設計引物設計基於水稻紅蓮型細胞質恢復基因Rf5和Rf6共分離的分子標記，序列如 下引物Pl(Rf5，53°C )PlF :5』 -ATGACAAATCTGCTCCGATG-3』PlR :5，-CTTACTTAGGAAAGACTAC-3，引物 P2(Rf6，56°C )P2F 5' -GGAGATGCTATAGCAGCAGTG-3，P2R 5' -ATTGCTCCTTACCACCTTGC-3』2、紅蓮恢復基因共分離分子標記的PCR擴增標準的PCR擴增反應體系共15 μ 1，組成如下50ng/ μ 1的總DNA 1 μ 1， IOX PCRbuffer (ρΗ8. 3) 1. 5 μ 1, 25mM MgCl2O. 6 μ 1，25 μ m dNTP 0. 6μ 1, lU/μ 1 Taq 酶 0. 6μ 1，5ρΜ 的引物 F 1μ 1，5ρΜ 的引物 R 1μ 1，去離子 ddH20 8. 7 μ 1。反應混合物用礦物油(Sigma)覆蓋，PCR反應程序如下lcycle -MV 5min30cycle :94°C Imin ；53°C或 56°C Imin ；72°C Iminlcycle :72°C 5minstore -AV ；3、擴增DNA片段檢測候選恢復位點(1)以含紅蓮恢復基因Rf5的密陽23和含Rf6的9311作對照，以這些恢復基因共 分離的分子標記對所有待檢測水稻品種進行PCR擴增，擴增產物在3. 5% (w/v)的瓊脂糖膠 上電泳。(2)將檢測品種擴增的帶型分別與密陽23中Rf5、9311中Rf6共分離的分子標 記帶型進行比較如果某一個水稻品種分子標記的帶型與紅蓮型恢復基因Rf5(密陽23)、 Rf6(9311)帶型不同，那麼就確定該水稻品種所含恢復基因與已知的紅蓮Rf5、Rf6不等位， 可能是一個新的候選恢復基因R』。本實驗中我們對121個水稻品種進行了篩選，共發現8個水稻生態型具有和Rf5、Rf6不一致的擴增帶型(如圖1)，表明這些水稻可能攜帶不同於 Rf5和Rf6的恢復基因。4、等位性分析驗證新的恢復基因位點為了進一步確證分子標記篩選的可靠性，我們對這些篩選的分子標記差異水稻品 種進行測恢和遺傳分析。如果某一個水稻品種對紅蓮不育系具有恢復作用，同時，其恢復 基因與紅蓮的Rf5和Rf6恢復基因不等位，那麼就確定該水稻品種含有一個不同於已知的 Rf5> Rf6的新恢復基因。(1)將選擇篩選的含差異標記的候選恢復系與紅蓮不育系粵泰A測交，套袋確定 育性。如果測交組合可育，說明該候選恢復系可能含新型恢復基因R』。申請人對圖一中篩 選出的攜帶差異分子標記的8個水稻品系進行了測恢分析，如表2中所示，除w9沒有恢復 性外，其他7個材料對紅蓮全部高度恢復，說明分子標記篩選具有較好的可靠性。表2篩選的水稻品種與紅蓮粵泰A測恢測交雜種Fl的育性(％ )
恢復(2)為確定這些恢復系中的恢復基因位點與Rf5、Rf6的遺傳關係，進一步將該候 選新型恢復基因恢復系鄂早1 (湖北黃岡農科所)、w3、w4、w5、wl9、w20、w26(國際水稻所 IRRI)分別與Rf5親本密陽23和Rf6親本9311雜交，配製雜種FlJP :R，/密陽23、R，/9311。(3)然後以紅蓮不育系粵泰A作母本與相應的每個雜種Fl測交，將測交組合種植 150株以上的群體，觀察育性分離。表3中共列表分析了 16個Fl對粵泰A測交群體的育性 分析結果。觀察表明鄂早l、w5和w20所攜帶的恢復基因均與Rf5和Rf6不等位，屬於新的 恢復基因R』。表3栽培稻中紅蓮型恢復基因的等位性分析
權利要求
一種篩選紅蓮型細胞質雄性不育水稻新型恢復基因的方法，它包括下列步驟A、共分離分子標記的PCR引物設計設計紅蓮型細胞質水稻恢復基因Rf5和Rf6共分離的分子標記引物，序列如下引物P1Rf5，53℃P1F5』 ATGACAAATCTGCTCCGATG 3』P1R5』 CTTACTTAGGAAAGACTAC 3』引物P2Rf6，56℃P2F5』 GGAGATGCTATAGCAGCAGTG 3』P2R5』 ATTGCTCCTTACCACCTTGC 3』；B、PCR擴增反應體系的建立標準的PCR擴增反應體系共15μl，組成如下50ng/μl的總DNA 1μl，10×PCRbuffer1.5μl，25mM MgCl2 0.6μl，25μm dNTP 0.6μl，1U/μl Taq酶0.6μl，5pM的引物F 1μl，5pM的引物R 1μl，去離子ddH2O 8.7μl反應混合物用礦物油覆蓋，PCR反應程序如下1cycle94℃ 5min30cycle94℃ 1min；53或56℃1min；72℃ 1min1cycle72℃ 5minstore4℃；C、擴增DNA片段檢測候選恢復位點(a)、以含紅蓮恢復基因Rf5的密陽23和含Rf6的9311作對照，與恢復基因共分離的分子標記對所有檢測水稻品種進行PCR擴增，擴增產物在3.5％(w/v)的瓊脂糖膠上電泳；(b)、將檢測品種擴增的帶型分別與密陽23中Rf5、9311中Rf6共分離的分子標記帶型進行比較水稻品種分子標記的帶型與紅蓮型恢復基因Rf5、Rf6帶型不同，確定該品種攜帶與已知的紅蓮Rf5、Rf6不等位的新型候選恢復基因；D、遺傳分析確證新型恢復基因(1)將選擇篩選的含差異標記的候選恢復系與紅蓮不育系粵泰A測交，套袋確定育性，測交組合，該候選恢復系含新型恢復基因R』；(2)將該候選新型恢復基因恢復系R』與Rf5親本密陽23和Rf6親本9311雜交，配製雜種F1，即Rf5R』/密陽23；Rf6R』/9311；(3)以紅蓮不育系粵泰A作母本與相應的每個雜種F1測交，將測交組合種植150株的群體，觀察育性分離，兩個群體中都出現不育株，候選恢復系中所含的恢復基因與Rf5和Rf6不等位，屬於新的恢復基因R』。
全文摘要
本發明公開了一種篩選紅蓮型細胞質雄性不育水稻新型恢復基因的方法，它包括下列步驟首先是恢復基因共分離分子標記的引物設計與標準PCR擴增體系的建立；其次是分子標記擴增帶型的比較分析，篩選具有差異分子標記的水稻品種或生態型；再次是利用遺傳分析驗證新的恢復基因位點，確定新型恢復基因。該方法將傳統的遺傳分析和分子遺傳標記技術結合起來，有目的地發掘利用新的遺傳基因資源。具有操作簡便，快速準確，精確地選擇新型恢復系的特點。有利於拓寬恢復譜，提高優良恢復基因的聚合選擇效率，促進雜交水稻的結實率和產量及其可持續發展。
文檔編號C12Q1/68GK101899522SQ201010245020
公開日2010年12月1日 申請日期2010年8月3日 優先權日2010年8月3日
發明者李紹清, 謝紅衛, 譚豔平 申請人:武漢大學