miR-182作為膠質瘤發生分子標誌物的應用及其檢測試劑盒的製作方法

2023-09-20 06:21:55

專利名稱：miR-182作為膠質瘤發生分子標誌物的應用及其檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及腫瘤發生分子標誌物，具體涉及微小RNA(miRNA)作為分子標誌物在 膠質瘤診斷中的應用。
背景技術：
膠質瘤包括各種神經上皮來源的腫瘤，是中樞神經系統腫瘤中最常見的惡性腫 瘤，約佔全部顱內腫瘤的40% 50%。由於大多數膠質瘤呈浸潤性生長且與周圍腦組織邊 界不清，即使是最現代的神經外科技術也難以做到病理學上的全切除，因而膠質瘤術後復 發率非常高，且隨著手術和復發次數的增加，其惡性程度有增加的趨勢。運用現代顯微外科 技術、放療、化療等綜合治療措施後，膠質瘤患者預後仍不理想，高度惡性的多形性膠質母 細胞瘤(GBM)患者，1年和2年生存率僅為58%和31%。膠質瘤的診斷仍然處於以臨床、病 理學和影像學信息為基礎的經驗性階段，而且一經診斷，絕大多數均為晚期，遠遠不能適應 對膠質瘤進行高危人群篩查和早期診斷的需求。因此，尋找無創傷性的膠質瘤早期診斷標 志物對高危人群進行篩查，以便對腦瘤患者進行早期診斷、早期治療。
microRNA(miRNA)為長度約21-25個核苷酸的非編碼RNA，miRNA能夠識別特定的 目標mRNA並在轉錄後水平通過促進靶mRNA的降解和/或抑制翻譯過程而發揮負調控基因 表達的作用，目前miRNA在膠質瘤中的研究仍處於起步階段，但膠質瘤中特異miRNA表達譜 的確定，為神經膠質瘤的診斷與治療提供了新的方向，最早的相關研究是由Ciafre等人採 用microarray chip技術，在9對臨床腫瘤樣品(癌及癌旁組織)以及10種惡性膠質瘤細胞 系(以正常的成人及胚胎腦樣品為對照)中，對245種miRNA進行了檢測，晶片結果分析顯 示，miR-221、miR-21等9種miRNAs在惡性膠質瘤中的表達顯著上調，其中miR-221上調程 度最高，而miR-128， miR-181a， miR-181b及miR-181c等在腦組織中含量豐富的miRNAs則 表達下調，這些表達水平改變的miRNAs可能與惡性膠質瘤發生發展密切相關。此外，最新 的研究發現，來源於各種組織或器官中的miRNA可以分泌到微血管的外周血中，在血清和 血漿中存在等量的miRNA，並且這些miRNA十分穩定，不容易被血液內源性和外源性RNases 降解，這種穩定存在的特性，足以顯示出miRNA在探尋腫瘤早期診斷分子標誌物方面的巨 大潛力。

發明內容
本發明目的在於提出miR-182 (miRBase登錄號MI0000272)能作為膠質瘤的發生 風險的分子標誌物之一應用於醫藥領域，從而提供一種性價比高、易於推廣應用的膠質瘤 外周血診斷試劑盒。 在前期的研究工作中，發明人發現miR-182在不同級別的膠質瘤組織中存在明顯 的差異，且隨著膠質瘤的病理級別增加，miR-182的表達明顯升高。通過進一步研究證實 miR-182是一個與膠質瘤發生發展密切相關的瘤基因，在各種膠質瘤組織中表達明顯上調，而在其它腦瘤組織(包括腦膜瘤、聽神經瘤、神經鞘瘤、垂體腺瘤、髓母細胞瘤等)變化不明 顯，這提示miR-182可以作為膠質瘤的特異性診斷標誌物。研究還發現，miR-182在腫瘤發 病的極早期階段既可以從腫瘤組織中分泌至微血管的外周血中，且不受RNA酶的降解而穩 定存在。因此，發明人提出外周血miR-182可以作為膠質瘤早期診斷的分子標誌物，製備膠 質瘤外周血診斷試劑盒。 本發明的檢測外周血miR-182方法1)收集待測個體外周血樣本，抽提總RNA ;2) 以總RNA為模板將miR-182特異性逆轉錄為cDNA ;3)用miR-182特異性引物進行實時定量 PCR擴增，獲得相對定量ACT值，ACT值二miR-182於內參基因平均CT值的差值，進行判 斷，當A CT《7. 61時提示miR-182表達陽性。 本發明的檢測試劑盒包括1)從外周血中抽提總RNA所用試劑，包括EDTA抗凝 管、淋巴細胞分離液、Trizol、三氯甲烷、異丙醇、無酶水；2)以總RNA為模板將miR-182 特異性逆轉錄為cDNA所用試劑，包括逆轉錄緩衝液、氯化鎂、三磷酸鹼基脫氧核苷酸、RNA 酶抑制劑、逆轉錄酶以及miR-182特異性逆轉錄引物；3)將cDNA實時定量PCR所用試 劑，包括緩衝液、miR-182實時定量PCR特異性引物、SYBR-Green染料、Taq聚合酶和雙蒸 水；所述miR-182的特異性引物為hsa-miR-182正向引物ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC ; hsa-miR-182反向引物AATCCATGAGAGATCCCTAGCG ;所述U6snRNA特異性PCR引物其正向弓| 物為5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物為5' -GGAACGCTTCACGAATT TG-3'。
本發明的方法及試劑盒可以檢測各種人群外周血中miR-182的表達狀況，從而預 測膠質瘤的患病風險，用於膠質瘤高危人群的篩查，並對膠質瘤患者做出早期、快速的無 創性診斷。此外，由於miR-182的表達隨著膠質瘤病理級別的進展而增加，因此，外周血 miR-182的表達量的檢測也可以作為膠質瘤患者預後判斷的重要指標。


圖1原位雜交檢測miR-182在正常腦組織和不同病理級別的膠質瘤組織中的表達 的組織切片圖； 圖2實時定量PCR方法檢測miR-182在正常腦組織和腦瘤組織中的表達結果圖；
圖3實時定量PCR方法檢測miR-182在正常人和腦瘤患者外周血中的表達結果 圖。
具體實施例方式
在前期研究工作中，發明人利用miRNA晶片和SAM軟體分析篩查10例正常腦組織 和10例膠質瘤組織中差異表達的miRNA時，發現miR-182在正常腦組織和膠質瘤組織中存 在明顯差異。 通過進一步miR-182探針原位雜交檢測研究，發明人發現miR_182在不同級別 的膠質瘤組織中存在明顯的差異，且隨著膠質瘤的病理級別增加，miR-182的表達明顯升 高(參見附圖l)，圖1中A、B、C、D、E分別為正常腦組織和膠質瘤1、n、III、IV級病理組 織原位雜交檢測miR-182探針表達的組織切片圖。miR-182探針原位雜交檢測結果顯示 細胞膜或胞漿呈棕黃色顆粒為miR-182陽性，陰性則細胞膜和胞漿均無棕黃色顆粒。其陽 性表達程度採用PIPS-2020高清晰度彩色病理圖文分析系統進行定量分析，每張切片隨機選取5個高倍鏡視野(X400)，測定每個視野下陽性反應的平均光密度值作為該例的測 量值。該實驗結果顯示1、 II、 III、 IV級膠質瘤的miR-182表達的平均光密度值分別為 0. 24±0. 03、0. 38±0. 06、0. 56±0. 04和0. 65±0. 05，隨著病理級別升高而增加，與正常腦 組織(0. 09 ±0. 01)比差異均有顯著性(P < 0. 05)。 同時miR-182是一個與膠質瘤發生發展密切相關的瘤基因，在各種膠質瘤組織中 表達明顯上調(參見附圖2)，而在其它腦瘤組織(包括腦膜瘤、聽神經瘤、神經鞘瘤、垂體腺 瘤、髓母細胞瘤等)表達變化不明顯，這提示miR-182可以作為膠質瘤的特異性分子診斷標 志物。 研究還發現，miRNA在腫瘤發病的極早期階段既可以從腫瘤組織中分泌至微血管 的外周血中，且不受RNA酶的降解而穩定存在。 根據上述發現，發明人進一步檢測了 miR-182在正常人和腦瘤患者外周血中的表 達情況，發現miR-182在膠質瘤患者外周血中表達明顯升高，與正常人外周血中的表達存 在明顯差異(P < 0. 01)(參見附圖3)。即使在膠質細胞增生(膠質瘤發生的極早期階段) 患者的外周血中，仍然可以檢測到miR-182與正常人患者外周血中的表達差異(p 0. 05)。提示外周血miR-182可以作為膠質瘤早期診斷的特異性分子標誌物。
實施例1製備膠質瘤外周血診斷試劑盒(50次反應)
1.淋巴細胞分離液300ml，
2. Hank' s液或PBS 300ml ，
3.異丙醇lOOml，
4.三氯甲烷lOOml，
5. Trizol 50ml， 6. DEPC水或無酶水10ml ，雙蒸水10ml ， 7. 5 X逆轉錄緩衝液1ml ， 8. 25mM氯化鎂lml， 9. 10mM三磷酸鹼基脫氧核苷酸lml ， 10. 5U/ ii 1 RAN酶抑制劑500 ii 1 ， 11. 200U/ ii 1匪LV逆轉錄酶50 ii 1或25U/ ii 1AMV酶50 ii 1 ， 12. 2X實時定量PCR緩衝液2ml ， 13. 5U/ii 1 Taq聚合酶50ii 1， 14. 5 ii M hsa-miR-182特異性PCR引物50 ii 1，其正向引物為5' -ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC-3'，其反向引物為5' -AATCCATGAGAGATCCCTAGCG-3'。 15. 5 ii M U6snRNA特異性PCR引物30 ii 1其正向引物為5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'其反向引物為5' -GGAACGCTTCACGAATT TG-3' 16. lOiiM hsa-miR-182特異性逆轉錄引物20 ill (上海吉瑪生物技術有限公司， QPM010)。
17. 10iiM U6snRNA特異性逆轉錄引物20iU(上海吉瑪生物技術有限公司， QPM010)。 實施例2外周血樣本中miR-182的檢測 1、外周血RNA的抽提採用EDTA抗凝管，採集待測個體外周血樣本5ml。採血後 需來回輕晃抗凝管，讓血液與管壁的抗凝劑充分接觸，動作輕柔以防溶血，立即抽提外周血 總RNA。 1)外周血單核細胞提取取EDTA抗凝血5ml ， lOOOrpm離心6min，吸取上層血槳於 EP管中-7(TC保存，向下層的外周血細胞加入等體積的Hanks液顛倒混勻；取淋巴細胞分離 液6ml於離心管中，將混勻的血細胞沿管壁緩慢注入分離液中，使兩液體間保持清晰的界 面，2000rpm離心20min ;吸取血漿和分離液之間的單個核細胞層於EP管中，4。C 6000rpm 離心10min ;棄上清液，加入Hanks液lml吹打混勻，4。C 6000rpm離心10min ;棄上清，力口 Trizol lml吹打混勻，冰上靜置5-10min，提取RNA或-7(TC保存。 2) Trizol提取細胞總RNA :加氯仿200 y 1/mlTrizol於Tube中，用手震蕩15_30s， 冰上放置5min，4°C 12000g離心15min ;小心取上層水相入新tube中，加入預冷的異丙醇 0. 5ml/mlTrizol混勻，-2(TC冰箱靜置20min，4。C 12000g離心lOmin ;棄上清，加入75% DEPC水稀釋的乙醇l-2ml混勻，4。C 7500g離心5min，儘量棄上清，室溫乾燥5_10min，加入 DEPC水10-20 ii 1溶解RNA。分光光度計測RNA的濃度及質量，0D260/280比值在1. 6_1. 8 之間並進行EB膠電泳檢測RNA質量，-7(TC保存。 2、 miR-182特異性逆轉錄使用普洛麥格Promega公司的逆轉錄試劑盒(A3500) 和上海吉瑪生物技術有限公司生產的Hairpin-itTM miR-182逆轉錄特異性引物(QPM010) 進行逆轉錄。20 ii L逆轉錄反應的體系如下 成分 劑量/管 5X逆轉錄緩衝液 4 ill 鎂離子(25mM) 3 ii 1 三磷酸鹼基脫氧核苷酸(10mM) 0. 75 MiR-182逆轉錄引物(liiM) 1.20iil RNA酶抑制劑(40U/ iU) 0. 25 匪LV逆轉錄酶(200U/ ii 1) 0. 2 ii 1 RNA樣本(1 ii g總1RNA) X ii 1 無酶水 To 20 ii 1 在進行逆轉錄反應之前須將除了逆轉錄酶外的各種試劑混合成逆轉錄混合液，用
手指輕彈裝試劑的管子，將逆轉錄混合液用移液器吸打幾次，不能用振蕩器。miR-182逆轉錄程序16。C 30分鐘，42。C 30分鐘，85。C 10分鐘。 3、miR-182特異性實時定量PCR:先將逆轉錄產物稀釋至2倍，然後混勻。20 y L
反應體系如下 成分 劑量/管 2 X實時定量PCR緩衝液 10 ii 1
miR-182特異性引物(5 ii M) 0. 4 ii 1
cDNA產物 2 ii 1 6
Taq聚合酶(5U/ ii 1) 0. 2 ii 1 雙蒸水 To 20ii 1miR-182實時定量PCR反應程序95°C 3分鐘，40個循環，95°C 12秒，62。C 35秒。
使用SYBR-Green染料進行實時定量PCR擴增。
miR-182的特異性引物為hsa-miR-182正向引物ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC
hsa-miR-182反向引物AATCCATGAGAGATCCCTAGCG
U6 SnRNA作為內參基因，其引物序列為
正向引物5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'
反向引物5' -GGAACGCTTCACGAATT TG—3' 4、 ACT指標的測定ACT指同一樣品中，待檢miRNA與內參U6 SnRNA平均Ct值 的差值。即miRNA ACT = miRNA MeanC廠control MeanCT，本發明中，A &為miR-182與 U6snRNA的平均CT值的差值，獲得相對定量A CT值，並進行判斷，當A CT《7. 61時，預示
膠質瘤發生。 實施例3外周血樣本中miR-182檢測方法的臨床驗證 以上述檢測方法，檢測了 22例正常人外周血和106例疑似腦瘤患者外周血(新入 院的初始病人，手術前)中miR-182的表達。 與正常人外周血miR-182的表達相比，其中33例患者外周血中miR-182的表達升 高，其A CT均《7. 61， 33例患者在手術後經病理證實膠質瘤31例，垂體腺瘤1例，神經鞘 瘤l例，另73例患者在外周血miR-182實時定量PCR檢測時，miR-182變化不明顯，其ACT 值均>7.61，差異沒有顯著性(p>0.05)。經手術後病理診斷證實顱咽管瘤5例，髓母細 胞瘤4例，腦膜瘤17例，垂體腺瘤21例，神經鞘瘤13例，聽神經瘤10例，交通動脈瘤1例， 毛細血管瘤2例。 以上研究表明，外周血miR-182可以作為膠質瘤患者診斷的特異性分子標誌物， 當A CT值《7. 61時，預示膠質瘤發生的可能性為93. 94% ，檢測外周血miR-182的表達，具 有很好的穩定性，可以用於膠質瘤高危人群篩查和早期診斷。
權利要求
miR-182作為神經膠質瘤發生風險的分子標誌物的應用。
2. —種檢測外周血miR-182的方法，包括以下步驟1)收集待測個體外周血樣本，抽提 總RNA ;2)以總RNA為模板將miR-182特異性逆轉錄為cDNA ;3)用miR-182特異性引物進 行實時定量PCR擴增，獲得相對定量ACT值，所述ACT值為miR-182與內參基因平均CT 值的差值，進行判斷，當ACT《7.61時提示miR-182表達陽性。
3. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述實時定量PCR的特異性引 物為hsa-miR-182正向引物ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC ;hsa-miR-182反向 引物AATCCATGAGAGATCCCTAGCG ;所述U6snRNA特異性PCR引物其正向弓|物為 5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物為5' -GGAACGCTTCACGAATT TG—3'。
4. 一種檢測外周血miR-182的試劑盒，包括1)從外周血中抽提總RNA所用試劑，包 括EDTA抗凝管、淋巴細胞分離液、Trizol、三氯甲烷、異丙醇、無酶水；2)以總RNA為模板將 miR-182特異性逆轉錄為cDNA所用試劑，包括逆轉錄緩衝液、氯化鎂、三磷酸鹼基脫氧核苷 酸、RNA酶抑制劑、逆轉錄酶以及miR-182特異性逆轉錄引物；3)將cDNA實時定量PCR所用 試劑，包括緩衝液、miR-182實時定量PCR特異性引物、SYBR-Green染料、Taq聚合酶和雙蒸 水；所述miR-182的實時定量PCR過程中所用的miR-182特異性引物為hsa-miR-182正向 引物ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC ;hsa—miR-182反向引物AATCCATGAGAGATCCCTAGCG ;所 述U6snRNA特異性PCR引物其正向引物為5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物 為5' -GGAACGCTTCACGAATT TG-3'。
5. 如權利要求4所述的檢測試劑盒，其特徵在於所述逆轉錄過程中的逆轉錄酶為 匪LV逆轉錄酶。
全文摘要
本發明公開了miR-182作為膠質瘤發生分子標誌物的應用及其檢測試劑盒，在提出miR-182可以作為神經膠質瘤早期診斷的分子標誌物的基礎上，本發明製備出檢測試劑盒，並提出檢測外周血miR-182的方法1)收集待測個體外周血樣本，抽提總RNA；2)以總RNA為模板將miR-182特異性逆轉錄為cDNA；3)用miR-182特異性引物進行實時定量PCR擴增，獲得相對定量ΔCT值，當ΔCT≤7.61時提示miR-182表達陽性。本發明的方法及試劑盒可以檢測各種人群外周血中miR-182的表達狀況，從而預測膠質瘤的患病風險，用於膠質瘤高危人群的篩查，並對膠質瘤患者做出早期、快速的無創性診斷。
文檔編號G01N21/64GK101792793SQ200910044618
公開日2010年8月4日 申請日期2009年10月26日 優先權日2009年10月26日
發明者劉曉萍, 唐海林, 廖前進, 李桂源, 武明花, 王澤友 申請人:中南大學