miR-381作為腦瘤發生分子標誌物的用途及檢測方法

2023-09-20 06:31:30 2

專利名稱：miR-381作為腦瘤發生分子標誌物的用途及檢測方法
技術領域：
本發明涉及腫瘤分子標誌物，特別涉及微小RNA在腦瘤高危人群篩查和早 期診斷中的應用。
背景技術：
據統計，在全身腫瘤的發病中，腦瘤的發病率僅次於胃、子宮、乳腺及食 管腫瘤，國內發病率為1.34/10萬，國外為9-10/10萬，兒童腦瘤的發病率明顯 高於成年人。雖然目前腦瘤的診斷和治療方法在不斷改進，但是腦瘤生存期仍 沒有明顯提高。腦瘤的診斷仍然處於以臨床、病理學和影像學信息為基礎的經 驗性階段，而且一經診斷，絕大多數均為晚期，遠遠不能適應對腦瘤進行高危 人群篩查和早期診斷的需求。因此，尋找無創傷性的腦瘤早期診斷標誌物對高 危人群進行篩査，以便對腦瘤患者進行早期診斷、早期治療，顯著提高患者生 存率， 一直是神經科學領域研究的主要任務。
微小RNA (microRNA/miRNA)是長度約21-25個核苷酸的非編碼RNA， miRNA能夠識別特定的目標mRNA並在轉錄後水平通過促進靶mRNA的降解 和/或抑制翻譯過程而發揮負調控基因表達的作用，它們通過調節信號分子(細 胞因子、生長因子、轉錄因子和促凋亡或抗凋亡基因等)的表達參與動植物的 生長、分化和發育。近幾年來的研究發現， 一些miRNA的特異性調節和人類腫 瘤的形成有關,一半以上的miRNA基因位於腫瘤相關的基因組區域或脆性區域， 可以作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的病理髮病過程，其異常表達在腫瘤的發 生發展以及診斷和評估預後等方面極具研究價值，已經愈來愈受到生命科學工 作者的重視。如，miR-15、 miR-16在慢性淋巴細胞白血病(CLL)中表達下調 或缺失，miR-145和miR-143的表達下調與結腸癌密切相關，miR-155在Bukitt's 淋巴瘤中高表達，miR-128a的表達下調則與膠質瘤密切相關等等。除此之外， 最新的研究發現，來源於各種組織或器官中的miRNA可以分泌到微血管的外周 血中並穩定存在，它們可以抵抗血中RNA酶(RNaseA)的消化，甚至是更強 烈的幹擾。雖然目前miRNA抵抗RNA酶消化的機制還不清楚，但是，miRNA 在外周血中穩定存在的特性，足以顯示出miRNA在探尋腫瘤早期診斷分子標誌 物方面的巨大潛力。

發明內容
本發明的目在於提出miR-381 (miRBase登錄號MI0000798)能作為腦瘤 發生風險的分子標誌物之一應用於醫藥領域，並進一步通過提供一種檢測外周 血miR-381的方法，用於腦瘤高危人群篩查和早期診斷。
在前期的研究工作中，發明人通過篩査不同病理級別的膠質瘤組織中差異 表達的miRNA時，發現miR-381在不同級別的膠質瘤組織中存在明顯的差異， 且隨著膠質瘤的病理級別增加，miR-381的表達明顯升高。通過進一步組織研究， 發明人發現miR-381是一個與腦瘤發生發展密切相關的瘤基因，在腦瘤組織， 包括膠質瘤、腦膜瘤、聽神經瘤、神經鞘瘤等腫瘤組織中表達明顯上調，這提 示miR-381可以作為腦瘤的分子診斷標誌物。研究還發現，miRNA在腫瘤發病 的極早期階段既可以從腫瘤組織中分泌至微血管的外周血中，且不受RNA酶的 降解而穩定存在。因此，發明人提出外周血miR-381可以作為腦瘤早期診斷的 分子標誌物。
本發明的檢測外周血miR-381的方法為(1)收集待測個體外周血樣本， 抽提總RNA; (2)以總RNA為模板將miR-381特異性逆轉錄為cDNA; (3)用 miR-381 stem-loop引物進行Real-Time PCR擴增，定量ACt惶，ACt惶二 miR-381與內參基因平均CT值的差值，判斷ACr是否小於10.15，當ACT《10.15 時提示miR-381表達陽性。
本發明可以定量的檢測各人群外周血中miR-381的表達狀況，從而預測腦 瘤的患病風險，用於腦瘤高危人群的篩査，並用於對腦瘤患者做出早期、快速 的無創性診斷。此外，由於miR-381的表達隨著膠質瘤病理級別的進展而增加， 因此，外周血miR-381的表達檢測也可以作為腦瘤患者預後判斷的重要指標。


圖1 RT-PCR檢測miR-381在正常腦組織和腦瘤組織中的表達差異圖； 圖2 RT-PCR檢測miR-381在正常人和腦瘤患者外周血中的表達差異圖。
具體實施例方式
在前期研究工作中，發明人利用miRNA晶片和SAM軟體分析篩査10例正 常腦組織和10例膠質瘤組織中差異表達的miRNA時，發現miR-381在正常腦 組織和膠質瘤組織中存在明顯的差異。
通過進一步組織研究，發明人發現miR-381是一個與腦瘤發生發展密切相 關的瘤基因，在腦瘤組織，包括膠質瘤、腦膜瘤、聽神經瘤、神經鞘瘤等腫瘤組織中表達明顯上調(參見附圖l)，且隨著腫瘤的病理級別增加，miR-381的 表達明顯升高，這提示miR-381可以作為腦瘤的分子診斷標誌物。
研究還發現，miRNA在腫瘤發病的極早期階段既可以從腫瘤組織中分泌至 微血管的外周血中，且不受RNA酶的降解而穩定存在。因此，發明人進一步檢 測了 miR-381在正常人和腦瘤患者外周血中的表達情況，發現miR-381在腦瘤 包括膠質瘤、垂體瘤、腦膜瘤、聽神經瘤、神經鞘瘤、顱咽管瘤和髓母細胞瘤 等患者的外周血中表達明顯升高，與正常人外周血中的表達存在明顯差異(p< 0.01)(參見附圖2)。即使在膠質細胞增生即膠質瘤發生的極早期階段患者的外 周血中，仍然可以檢測到miR-381與正常人患者外周血中的表達差異(p<0.05)， 提示外周血miR-381可以作為腦瘤早期診斷的分子標誌物。
實施例1 外周血樣本中miR-381的檢測
(1)外周血RNA的抽提採用德國格雷那公司VACUETTE (非可替)5ml 枸櫞酸鈉抗凝管，採集待測個體外周血樣本5ml。採血後需來回輕晃抗凝管，讓 血液與管壁的抗凝劑充分接觸，動作輕柔以防溶血，立即抽提外周血總RNA。
① 外周血單核細胞提取取枸櫞酸鈉抗凝血5ml， 1000rpm離心6min，吸 取上層血漿於EP管中-7(TC保存，向下層的外周血細胞加入等體積的Hanks液 顛倒混勻；取淋巴細胞分離液6ml於離心管中，將混勻的血細胞沿管壁緩慢注 入分離液中，使兩液體間保持清晰的界面，2000rpm離心20min;吸取血漿和分 離液之間的單個核細胞層於EP管中，4°C 6000rpm離心10min;棄上清液，加 入Hanks液lml吹打混勻，4°C 6000rpm離心10min;棄上清，加Trizol lml吹 打混勻，冰上靜置5-10min，提取RNA或-70'C保存。
② Trizo1提取細胞總RNA:加氯仿200 P 1/ml Trizol於EP管中，用手震蕩 15-30s，冰上放置5min， 4°C 12000g離心15min;小心取上層水相入新EP管中， 加入預冷的異丙醇0.5ml/mlTrizol混勻，-20°(:冰箱靜置20min， 4°C 12000g離心 10min;棄上清，加入75。/。DEPC水稀釋的乙醇l-2ml混勻，4t: 7500g離心5min， 儘量棄上清，室溫乾燥5-10min，加入DEPC水10-20 ul溶解RNA。分光光度 計測RNA的濃度及質量，OD260/280比值在1.6-1.8之間並進行EB膠電泳檢測 RNA質量，-70*€保存。
(2) miR-381特異性逆轉錄使用上海吉瑪生物技術有限公司生產的 Hairpin-itTMmiR-381試劑盒(QPM010)定量分析。20uL逆轉錄反應的體系
如下成分量/管
5XRT緩衝液4iU
Mg2+ (25mM)3iU
dNTP (10mM)0.75
MiR國381-RT引物(1 ixM)1.20 ul
RNasin (40U/ul)0.25 u 1
MMLV逆轉錄酶(200U/ul)0.2 u 1
RNA樣本 (lug總RNA)Xy 1
無酶水To 20 u 1
在進行逆轉錄反應之前須將除了逆轉錄酶外的各種試劑混合成逆轉錄mix， 用手指輕彈裝試劑的管子，將逆轉錄mix用移液器吸打幾次，不能用振蕩器。
miR-381逆轉錄程序16。C30分鐘，42'C30分鐘，85XM0分鐘。 (3) miR-381特異性Real-time PCR:先將逆轉錄產物稀釋至2倍，然後混 勻。20uL反應體系如下
成分量/管
2 X Real-time PCR緩衝液10ul
miR-381特異性引物(5ixM)0,4 ul
miR-381 RT產物2ul
耐熱性聚合酶(5U/ul)0.2 Pl
雙蒸水To 20 u 1
miR-381實時定量PCR反應程序95°C 3分鐘，40個循環，95'C12秒， 62。C 35秒。
miR-381的特異性引物為
The forward primer: 5' - AGTCTATACAAGGGCAAGCTCTC國3' The reverse primer: 5' - ATCCATGACAGATCCCTACCG-3' 以U6SnRNA作為內參基因，其引物序列為 The forward primer: 5' - ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' The reverse primer: 5' - GGAACGCTTCACGAATT TG國3' (4)測定ACt指稱ACt是指同一祥品中，待檢基因與內參基因平均ct 值的差值。即miRNA ACT-microRNAMean CT- control Mean CT。本發明中，ACT為miR-381與U6 SnRNA的平均Ct信的差信，獲取並定 量ACt信，並進行判斷，當ACt《10.15吋，預示腦瘤發生。
實施例2外周血樣本中miR-381檢測方法的臨床驗證
以上述方法，檢測10例正常人外周血和50例疑似腦瘤患者外周血(新入 院的初始病人，手術前)中miR-381的表達。
與正常人外周血miR-381的表達相比，其中48例患者外周血中miR-381的 表達升高，其ACT值均《10.15， 48例患者在手術後經病理證實均為腦瘤患者。 另2例患者在進行外周血miR-381特異性Real-time PCR檢測時，其AOr值 〉10.15，與正常人外周血miR-381表達相比，沒有顯著性差異，經手術後病理診 斷證實，二例均為海綿狀血管瘤患者。
以上研究表明，外周血miR-381可以作為腦瘤患者診斷的分子標誌物，當 ACT值〈10.15時，預示腦瘤發生的可能性為100%。檢測外周血miR-381的表 達，具有很好的穩定性，可以用於腦瘤高危人群篩査和早期診斷。序列表
中南大學
miR-381作為腦瘤發生分子標誌物的用途及檢測方法
CS091-000903
200910043155.2
2009-04-21
4
Patentln version 3.5
1 23 DNA Homo sapiens 1
agtctataca agggcaagct etc 23
2
21
DNA
Homo sapiens
2
atccatgaca gatocctacc g 21
3 23 DNA Homo sapiens 3
attggaacga tacagagaag att 23 4 19 DNA Homo sapiens 4
ggaacgcttc acgaatttg 19
權利要求
1.miR-381作為腦瘤發生分子標誌物的醫藥用途。
2. —種檢測miR-381在外周血中的表達的方法，其特徵在於包括步驟(1)收 集待測個體外周血樣本，抽提總RNA; (2)以總RNA為模板將miR-381特 異性逆轉錄為cDNA; (3)用miR-381 stem-loop引物進行Real-Time PCR擴 增，以U6 SnRNA作為內參基因，定量AGr值二待檢基因miR-381與內參基 因平均ct值的差值，判斷ACt是否小於或等於10.15，當AC《10.15時提示 miR-381表達陽性。
3. —種如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述Real-Time PCR時，所用 的miR-381的特異性引物為正向5'- AGTCTATACAAGGGCAAGCTCTC -3',反向5'-ATCCATGACAGATCCCTACCG -3';所用的內參基因U6 SnRNA 的引物序列為正向5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'， 反向5'-GGAACGCTTCACGAATT TG -3'。
全文摘要
本發明公開miR-381作為腦瘤發生分子標誌物的用途及檢測方法，收集待測個體外周血樣本，抽提總RNA；以總RNA為模板將miR-381特異性逆轉錄為cDNA；用miR-381 stem-loop引物進行Real-Time PCR擴增，以U6 SnRNA作為內參基因，定量ΔCT值，判斷ΔCT是否小於或等於10.15，當ΔCT≤10.15時提示miR-381表達陽性。本發明通過定量的檢測各人群外周血中miR-381的表達狀況，從而預測腦瘤的患病風險，用於腦瘤高危人群的篩查，並用於對腦瘤患者做出早期、快速的無創性診斷。
文檔編號C12Q1/68GK101560553SQ20091004315
公開日2009年10月21日 申請日期2009年4月21日 優先權日2009年4月21日
發明者唐海林, 張祖萍, 希 曾, 丹 李, 李夏雨, 李小玲, 李桂源, 武明花 申請人:中南大學