人ppp5c基因的用途及其相關藥物的製作方法
2023-09-20 06:27:35 2
人ppp5c基因的用途及其相關藥物的製作方法
【專利摘要】本發明公開了人PPP5C基因的用途及其相關藥物。本發明公開了人PPP5C基因在腫瘤治療、腫瘤診斷及藥物製備中的用途。本發明還進一步構建了人PPP5C基因小分子幹擾RNA、人PPP5C基因幹擾核酸構建體、人PPP5C基因幹擾慢病毒並公開了他們的用途。本發明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構建體、慢病毒能夠特異性抑制人PPP5C基因的表達，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細胞，高效率地抑制靶細胞中PPP5C基因的表達，進而抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
【專利說明】人PPP5C基因的用途及其相關藥物
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，更具體地涉及人PPP5C基因的用途及其相關藥物。
【背景技術】
[0002]RNA幹擾(RNA interference, RNAi)即用核苷酸組成的短的雙鏈RNA(dsRNA)進行轉錄後基因沉默。它可高效、特異地阻斷體內特定基因的表達，導致其降解，從而引起生物體內特異基因的沉默，使細胞表現出某種基因表型的缺失，是近年來新興的一種常用的研究基因功能、尋找疾病治療方法的實驗室技術。研究表明，長度為21-23nt的雙鏈RNA能夠在轉錄和轉錄後水平特異性的引起RNAi (Tuschl T, Zamore PD, Sharp PA, BartelDP.RNA1: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21to 23 nucleotide intervals.Cell 2000; 101:25-33.)D 腫瘤患者雖經化療、放療和綜合治療，但五年生存率仍很低，如能對腫瘤發病和進展有關的基因進行幹預，將能為腫瘤的治療開闢新途徑。近年來，RNAi已成為腫瘤的基因治療的有效策略。利用RNAi技術可以抑制原癌基因、突變的抑癌基因、細胞周期相關基因、抗凋亡相關基因等的表達來抑制腫瘤進程(Uprichard, Susan LThe therapeutic potential of RNA interference.FEBS Letters2005;579:5996-6007.)。
[0003]PPP5C (protein phosphatase 5，catalytic subunit)也稱為 PP5，是一種對網田酸/斑蝥素/微囊毒素敏感 的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族的一員，該家族蛋白通過調節祀蛋白的去磷酸化，調節細胞的生長、增殖和分化(Swingle MR, Amable L, LawhornBGjet al.Structure-activity relationship studies of fostriecin，cytostatin, andkey analogs, with PPljPP2A，PP5，and(betal2_betal3)-chimeras(PP1/PP2A and PP5/PP2A), provide further insight into the inhibitory actions of fostriecin familyinhibitors.J Pharmacol Exp Ther.2009; 331 (I): 45-53.)。到目前為止，PP5 在生物學和疾病中發揮的作用尚不清楚。
[0004]在過去的十年中，PP5—直被認為是一種潛在的細胞生長調節因子。在分子水平上，PP5位於多蛋白複合物中，這些蛋白能夠影響由激素類(如糖皮質激素)或細胞應激(如缺氧，氧化應激和DNA損傷)引起的細胞內信號級聯反應。在細胞中未發生應激反應時，PP5位於一個由熱休克蛋白70，熱休克蛋白90，應激誘導磷酸化蛋白I和細胞分裂周期同源蛋白 37 組成的複合物中(Vaughan CK，Mollapour Mj Smith JRj et al.Hsp90_dependentactivation of protein kinases is regulated by chaperone-targeteddephosphorylation of Cdc37.Mol Cell.2008; 31 (6): 886-95.)。在各種不同形式的應激反應中，PP5和一些應激激活的蛋白激酶，包括DNA-PKcs，ATM，ATR，ASK1，共同形成複合物。當用SiRNA或反義寡核苷酸降低PP5的表達水平時，一些應激反應蛋白磷酸化程度增加(Huang S，Shu L，Easton J，et al.1nhibition of mammalian target of rapamycinactivates apoptosis signal-regulating kinase I signaling by suppressing proteinphosphatase 5 activity.J Biol Chem.2004; 279 (35):36490-6.)D 以上研究顯不，PP5 可能在調節細胞信號網絡，促使細胞對於基因組損傷做出適當反應過程中起著非常重要的作用。
[0005]PP5蛋白在不同種族中高度保守，其在老鼠，兔子，牛和人類中同源性大於98%。人PP5蛋白在大多數組織中表達。有研究顯示，PP5蛋白的表達對激活缺氧誘導因子和雌激素非常敏感(Urban G, Golden T, Aragon IV, Scammell JG, Dean NM, HonkanenRE.1dentification of an estrogeninducible phosphatase(PP5)that convertsMCF-7 human breast carcinoma cells into an estrogenindependent phenotypewhen expressed constitutively.J Biol Chem.2001; 276:27638 - 27646.),而激活缺氧誘導因子和雌激素都與乳腺癌的增殖密切相關(Bos R, Zhong H, Hanrahan CF, MommersEC, Semenza GL, Pinedo HM, Abeloff MD, Simons JW, van Diest PJ, van der Wall E.Levelsof hypoxia-1nducible factor-1 alpha during breast carcinogenesis.J Natl CancerInst 2001;93:309 - 314.Bos R,van der Groep P,Greijer AE,Shvarts A,MeijerS, Pinedo HM, Semenza GL, van Diest PJ, van der Wall E.Levels of hypoxia-1nduciblefactor-lalpha independently predict prognosis in patients with lymph nodenegative breast carcinoma.Cancer 2003;97:1573 - 1581.)。相比非惡性組織而言，惡性乳腺癌組織中PP5蛋白的表達水平與乳腺癌惡性程度呈現正相關(Goden T, AragonI, Rutland B, et al.Elevated levels of Ser/Thr protein phosphatase 5 (PP5)in humanbreast cancer.Biochim Biophys Acta.2008:1782 (4): 259-270.)。以上研究提不 PP5 可能參與了乳腺癌的發生和發展。但是，PP5在除乳腺癌以外的其他惡性腫瘤中的研究還很少，因此有必要深入研究PP5在其他腫瘤發生中的調節功能。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在於公開與人PPP5C (protein phosphatase 5, catalyticsubunit)基因相關的治療方法及藥物，以RNA幹擾(RNAi)為手段研究PPP5C基因在腫瘤細胞的存活和凋亡過程中的作用。
[0007]本發明第一方面，以RNA幹擾為手段，研究了 PPP5C基因在腫瘤發生和發展中的作用，公開了一種抑制或降低腫瘤細胞生長、增殖、分化和/或存活的方法，該方法包括:向腫瘤細胞施用一種能夠特異性抑制PPP5C基因的轉錄或翻譯，或能夠特異性抑制PPP5C蛋白的表達或活性的分子，以此來抑制腫瘤細胞的生長、增殖、分化和/或存活。
[0008]所述腫瘤細胞選自其生長與PPP5C蛋白的表達或活性相關的腫瘤細胞。較優的，所述腫瘤細胞選自肺癌、結腸癌、膠質瘤之任一。
[0009]所述抑制或降低腫瘤細胞生長、增殖、分化和/或存活的方法中，所述分子的施用量為足夠降低PPP5C基因的轉錄或翻譯，或者足夠降低PPP5C蛋白的表達或活性的劑量。進一步的，所述PPP5C基因的表達至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
[0010]所述分子可選自但不限於:核酸分子、碳水化合物、脂類、小分子化學藥、抗體藥、多肽、蛋白或幹擾慢病毒。
[0011]所述核酸包括但不限於:反義寡核苷酸、雙鏈RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸內切酶III製備的小幹擾RNA CesiRNA)或者短髮夾RNA (shRNA)。
[0012]所述雙鏈RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有PPP5C基因的啟動子序列或PPP5C基因的信息序列。
[0013]進一步的，所述雙鏈RNA為小幹擾RNA(siRNA)。所述小幹擾RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補共同形成RNA 二聚體，並且所述第一鏈的序列與PPP5C基因中15-27個連續的核苷酸序列基本相同。所述小分子幹擾RNA能特異性結合靶序列所編碼的mRNA片段，並特異性沉默人PPP5C基因的表達。
[0014]進一步的，所述小幹擾RNA的第一鏈序列與PPP5C基因中的靶序列基本相同。較優的，所述PPP5C基因中的靶序列含有SEQ ID NOil-1l中之任一序列。
[0015]所述PPP5C基因中的靶序列即為所述小分子幹擾RNA特異性沉默PPP5C基因表達時，與所述的小分子幹擾RNA互補結合的mRNA片段所對應的PPP5C基因中的片段。
[0016]較佳的，所述PPP5C基因來源於人。
[0017]本發明第一方面還公開了一種分離的人PPP5C基因在製備或篩選腫瘤治療藥物，或者在製備腫瘤診斷藥物中的用途。
[0018]進一步的，所述腫瘤選自肺癌、結腸癌、膠質瘤之任一。
[0019]所述將分離的PPP5C基因用於製備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方面的內容:其一，將PPP5C基因作為藥物或製劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用於製備腫瘤治療藥物或製劑；其二，將PPP5C基因作為藥物或製劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用於篩選腫瘤治療藥物或製劑。
[0020]所述將PPP5C基因作為藥物或製劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用於製備腫瘤治療藥物或製劑具體是指:將PPP5C基因作為RNA幹擾作用的靶標，來研製針對腫瘤細胞的藥物或製劑，從而能降低腫瘤細胞內PPP5C基因的表達水平。
[0021]所述將PPP5C基因作為藥物或製劑針對腫瘤細胞的作用靶標應用於篩選腫瘤治療藥物或製劑具體是指:將PPP5C基因作為作用對象，對藥物或製劑進行篩選，以找到可以抑制或促進人PPP5C基因表達的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如本發明所述的PPP5C基因小分子幹擾RNA (siRNA)即是以人PPP5C基因為作用對象篩選獲得的，可用作具有抑制腫瘤細胞增殖作用的藥物。除此之外，諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將PPP5C基因及其蛋白作為作用對象。
[0022]所述將PPP5C基因用於製備腫瘤診斷藥物，是指將PPP5C基因表達產物作為一項腫瘤診斷指標應用於腫瘤診斷藥物的製備。
[0023]所述腫瘤治療藥物為能夠特異性抑制PPP5C基因的轉錄或翻譯，或能夠特異性抑制PPP5C蛋白的表達或活性的分子，從而降低腫瘤細胞中PPP5C基因的表達水平，達到抑制腫瘤細胞的增殖、生長、分化和/或存活的目的。
[0024]所述通過分離的PPP5C基因製備或篩選獲得的腫瘤治療藥物或者腫瘤診斷藥物包括但不限於:核酸分子、碳水化合物、脂類、小分子化學藥、抗體藥、多肽、蛋白或幹擾慢病毒。
[0025]所述核酸包括但不限於:反義寡核苷酸、雙鏈RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸內切酶III製備的小幹擾RNA (esiRNA)或者短髮夾RNA (shRNA)。
[0026]所述腫瘤治療藥物的施用量為足夠降低人PPP5C基因的轉錄或翻譯，或者足夠降低人PPP5C蛋白的表達或活性的劑量。以使人PPP5C基因的表達至少被降低50%、80%、90%、95% 或 99%。[0027]採用前述腫瘤治療藥物治療腫瘤的方法，主要是通過降低人PPP5C基因的表達水平抑制腫瘤細胞的增殖來達到治療的目的。具體的，治療時，將能有效降低人PPP5C基因表達水平的物質給藥於患者。
[0028]本發明第二方面公開了一種降低腫瘤細胞中PPP5C基因表達的分離的核酸分子，所述核酸分子包含:
[0029]a)雙鏈RNA，所述雙鏈RNA中含有能夠在嚴緊條件下與PPP5C基因雜交的核苷酸序列；或者
[0030]b) shRNA，所述shRNA中含有能夠在嚴緊條件下與PPP5C基因雜交的核苷酸序列。 [0031]進一步的，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補共同形成RNA 二聚體，並且所述第一鏈的序列與PPP5C基因中15-27個連續的核苷酸序列基本相同。較佳的，所述第一鏈的序列與PPP5C基因中19-23個連續的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述第一鏈的序列與PPP5C基因中19、20或者21個連續的核苷酸序列基本相同。
[0032]更進一步的，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補共同形成RNA 二聚體，並且所述第一鏈的序列與PPP5C基因中的靶序列基本相同。
[0033]進一步的，所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環結構，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補，並且所述正義鏈片段的序列與PPP5C基因中15-27個連續的核苷酸序列基本相同。所述shRNA經加工後可成為小幹擾RNA (siRNA)進而起到特異性沉默腫瘤細胞中內源PPP5C基因表達的作用。
[0034]更一步的，所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環結構，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補，並且所述正義鏈片段的序列與PPP5C基因中的靶序列基本相同。
[0035]所述雙鏈RNA的第一鏈或所述shRNA的正義鏈片段與PPP5C基因中的靶序列基本相同，所述PPP5C基因的靶序列即為siRNA用於特異性沉默PPP5C基因表達時，被所述siRNA識別並沉默的mRNA片段所對應的PPP5C基因中的片段。
[0036]較佳的，所述PPP5C基因中的靶序列含有SEQ ID NO: 1-11之任一序列。
[0037]進一步的，所述PPP5C基因來源於人。
[0038]所述雙鏈RNA第一鏈和第二鏈的長度均為15-27個核苷酸；較佳的，長度均為19-23個核苷酸；最佳的，長度均為19、20或者21個核苷酸。
[0039]進一步的，所述雙鏈RNA為小幹擾RNA (siRNA)。更進一步的，所述小幹擾RNA第一鏈的序列如 SEQ ID NO:23 所示，具體為 5』 -GAGACAGAGAAGAUUACAGUA-3』。
[0040]SEQ ID NO:23所示的siRNA為以SEQ ID NO: 2所示的序列為RNA幹擾靶序列設計的、針對人PPP5C基因的小幹擾RNA的一條鏈，另一條鏈即第二鏈的序列與第一鏈序列互補，該siRNA可以起到特異性沉默腫瘤細胞中內源PPP5C基因表達的作用。
[0041]進一步的，所述shRNA的莖環結構的序列可選自以下任一:UUCAAGAGA、AUG、CCC,UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。
[0042]更進一步的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO: 24所示，具體為:5』 -GAGACAGAGAAGAUUACA⑶AUUCAAGAGAUAC腳AAUCUUCUC腳CUC-3，。
[0043]shRNA經酶切加工後可成為siRNA，進而起到特異性沉默腫瘤細胞中內源性人PPP5C基因表達的作用。[0044]編碼本發明所述shRNA的基因片段的幹擾慢病毒載體含有SEQ ID NO: 1-11中之任一序列及其互補序列。
[0045]本發明第三方面，公開了一種PPP5C基因幹擾核酸構建體，含有編碼本發明所述分離的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表達所述shRNA
[0046]所述的人PPP5C基因幹擾核酸構建體可以是將編碼前述人PPP5C基因shRNA的基因片段克隆入已知載體獲得。進一步的，所述PPP5C基因幹擾核酸構建體為PPP5C基因幹擾慢病毒載體。
[0047]本發明的PPP5C基因幹擾慢病毒載體是將編碼前述PPP5C基因shRNA的DNA片段克隆入已知載體獲得，所述已知載體多為慢病毒載體，所述PPP5C基因幹擾慢病毒載體經過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒後，感染腫瘤細胞，進而轉錄出本發明所述shRNA，通過酶切加工等步驟，最終獲得所述siRNA，用於特異性沉默PPP5C基因的表達。
[0048]進一步的，所述PPP5C基因幹擾慢病毒載體還含有啟動子序列和/或編碼腫瘤細胞中可被檢測的標記物的核苷酸序列；較優的，所述可被檢測的標記物如綠色螢光蛋白(GFP)0
[0049]進一步的，所述慢病毒載體可以選自:pLK0.1-pur ο > pLK0.1-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-tGFP, pLK0.1-CMV-Neo, pLK0.l_Neo、 pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-TagCFP、pLK0.l-puro-CMV-TagYFP、pLK0.l-puro-CMV-TagRFP、pLK0.l-puro-CMV-TagFP635, pLK0.1-puro-UbC-TurboGFP、pLK0.l-puro-UbC_TagFP635、pLKO-puro-1PTG-lxLacO、pLK0-puro-1PTG_3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-1T-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl.2/V5_GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCS IL-GFP 或 pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一。
[0050]本發明實施例具體列舉了以pGCSIL-GFP為載體構建的人PPP5C基因幹擾慢病毒載體,命名為 pGCSIL-GFP-PPP5C-siRNA。
[0051]本發明分離的核酸分子可用於製備預防或治療腫瘤的藥物，所述腫瘤為肺癌、結腸癌或膠質瘤。
[0052]本發明的PPP5C基因siRNA可用於抑制腫瘤細胞的增殖，進一步地可以用作治療腫瘤的藥物或製劑。PPP5C基因幹擾慢病毒載體則可用於製備所述PPP5C基因siRNA。當用作治療腫瘤的藥物或製劑時，是將安全有效量的所述核酸分子施用於哺乳動物。具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
[0053]本發明第四方面，公開了一種PPP5C基因幹擾慢病毒，由前述PPP5C基因幹擾慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝而成。該慢病毒可感染腫瘤細胞並產生針對PPP5C基因的小分子幹擾RNA，從而抑制肺癌、結腸癌或膠質瘤腫瘤細胞的增殖。該PPP5C基因幹擾慢病毒可用於製備預防或治療腫瘤的藥物。
[0054]本發明第五方面，公開了一種用於預防或治療腫瘤的藥物組合物，其有效物質含有前述的分離的核酸分子，PPP5C基因幹擾核酸構建體，和/或PPP5C基因幹擾慢病毒。
[0055]進一步的，所述藥物組合物含有I~99wt%所述雙鏈RNA、shRNA、PPP5C基因幹擾核酸構建體或PPP5C基因幹擾慢病毒，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
[0056]在製備這些組合物時，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當賦形劑起稀釋劑作用時，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、等。製劑還可包括:溼潤劑、乳化劑、防腐劑(如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。
[0057]本發明還公開了所述藥物組合物在製備治療肺癌、結腸癌、膠質瘤之任一的腫瘤治療藥物中的應用。
[0058]該藥物組合物的應用為腫瘤的治療提供了一種方法，具體為一種預防或治療對象體內腫瘤的方法，包括將有效劑量的所述的藥物組合物施用於對象中。進一步的，所述腫瘤選自肺癌、結腸癌、膠質瘤之任一。
[0059]所述藥物組合物用於預防或治療對象體內腫瘤時，需要將有效劑量的所述的藥物組合物施用於對象中。採用該方法，所述腫瘤的生長、增殖、復發和/或轉移被抑制。進一步的，所述腫瘤的生長、增殖、復發和/或轉移的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的部分被抑制。
[0060]本發明第六方面，公開了一種用於降低腫瘤細胞中的PPP5C基因表達的試劑盒，所述試劑盒包括:存在於容器中的所述分離的核酸分子，PPP5C基因幹擾核酸構建體，和/或所述的PPP5C基因幹擾慢病毒。
[0061]綜上所述，本發明設計了針對人PPP5C基因的11個RNAi靶點序列，構建相應的PPP5CRNAi 載體，其中編碼序列 SEQ ID NO:2 的 RNAi 載體pGCSIL-GFP_PPP5C_siRNA 能夠顯著下調PPP5C基因在mRNA水平和蛋白水平的表達。使用慢病毒(lentivirus，簡寫為Lv)作為基因操作工具攜帶RNAi載體pGCSIL-GFP-PPP5C-siRNA能夠靶向地將針對PPP5C基因的RNAi序列高效導入人肺癌H1299細胞、結腸癌RKO細胞和膠質瘤U87細胞，降低PPP5C基因的表達水平，顯著抑制上述腫瘤細胞的增殖能力。因此慢病毒介導的PPP5C基因沉默是惡性腫瘤潛在的臨床非手術治療方式。
[0062]本發明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構建體、慢病毒能夠特異性抑制人PPP5C基因的表達，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細胞，高效率地抑制靶細胞中PPP5C基因的表達，進而抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0063]圖1:pGCSIL_GFP 質粒 DNA 圖譜
[0064]圖2:PPP5C-RNAi慢病毒侵染人肺癌H1299細胞、結腸癌RKO細胞和膠質瘤U87細胞5天後，PPP5C mRNA的表達水平顯著降低
[0065]圖3:PPP5C-RNAi慢病毒侵染人肺癌H1299細胞5天後，引起細胞增殖抑制
[0066]圖4:PPP5C-RNAi慢病毒侵染人結腸癌RKO細胞5天後，引起細胞增殖抑制
[0067] 圖5:PPP5C-RNAi慢病毒侵染人膠質瘤U87細胞5天後，引起細胞增殖抑制
【具體實施方式】
[0068]本發明涉及了一組針對人PPP5C基因的小分子幹擾RNA (siRNA)序列、RNA幹擾載體和RNA幹擾慢病毒。選取人PPP5C mRNA編碼區序列作為siRNA的靶位點，根據靶位點中連續的10-30 (優選15-27，更優選19-23)個鹼基序列設計siRNA靶點序列。通過基因克隆，構建表達上述siRNA的核酸構建體，包裝表達上述siRNA的慢病毒。細胞實驗證明，上述siRNA序列能夠特異性沉默人腫瘤細胞中內源PPP5C基因的表達。
[0069]發明人發現，採用RNAi方法下調人PPP5C基因的表達後可有效地抑制腫瘤細胞的增殖，這一研究成果表明PPP5C基因是原癌基因，可作為腫瘤治療的靶點。發明人進一步合成和測試了多種針對PPP5C基因的siRNA，篩選出了可有效抑制PPP5C的表達進而抑制人肺癌H1299細胞、結腸癌RKO細胞和膠質瘤U87細胞增殖和生長的siRNA，在此基礎上完成了本發明。
[0070]本發明提供了一系列幹擾人PPP5C基因的小幹擾RNA (siRNA)序列，構建了可特異性沉默PPP5C基因表達的慢病毒。本發明研究發現，針對人PPP5C基因設計的小幹擾RNA及RNAi慢病毒，穩定並特異地下調PPP5C基因的表達，並有效地抑制人腫瘤細胞的增殖。本發明表明PPP5C基因可促進腫瘤細胞生長，有望成為腫瘤早期診斷和治療的靶點。而且，通過RNAi方式沉默PPP5C基因的表達，可作為抑制腫瘤發展的有效手段。
[0071]本發明的設計思路為:
[0072]本發明通過如下方法來篩選獲得一種人PPP5C基因RNAi慢病毒:從Genbank中調取人PPP5C基因序列；預測siRNA位點；合成針對PPP5C基因的有效的siRNA序列，兩端含酶切位點粘端的雙鏈DNA Oligo ;慢病毒載體雙酶切後與雙鏈DNA Oligo連接，構建表達PPP5C基因siRNA序列的RNAi質粒；將RNAi質粒和慢病毒包裝需要的輔助載體(PackingMix, Sigma-aIdrich公司)共轉染人胚腎細胞293T,產生重組慢病毒顆粒，即可製得高效沉默PPP5C基因的慢病毒。
[0073]基於上述方法， 本發明提供了 11個幹擾PPP5C基因的有效靶點(具體如SEQ IDNO:1-11所示)，構建了特異幹擾人PPP5C基因的慢病毒。
[0074]同時本發明還公開一種人PPP5C基因RNAi慢病毒(PPP5C_RNAi)及其製備與應用。
[0075]本研究發現，利用慢病毒介導的RNAi方法，在降低PPP5C基因在腫瘤細胞中的表達後，可以有效抑制腫瘤細胞的增殖。本研究表明，PPP5C基因是一個原癌基因，可促進腫瘤細胞增殖，在腫瘤發生和發展中具有重要的生物學功能，PPP5C基因可以為腫瘤治療的靶標，慢病毒介導的PPP5C基因特異性沉默可作為腫瘤治療的一種新手段。
[0076]下面結合實施例進一步闡述本發明。應理解，實施例僅用於說明本發明，而非限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規條件，如[美]Sambrook.J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗指南，第三版。北京:科學出版社2002中所述的條件或者製造商建議的條件進行或配置。
[0077]實施例1針對人PPP5C基因RNAi慢病毒的製備
[0078]1.篩選針對人PPP5C基因的有效的siRNA靶點
[0079]從Genbank調取PPP5C (NM_006247)基因信息；利用上海吉凱基因化學技術有限公司的設計軟體Genechem設計針對PPP5C基因的有效的siRNA靶點。在PPP5C基因的編碼序列(CDS)區域內，每隔一個鹼基起始獲得21個鹼基的序列，表1列出了其中11條針對PPP5C基因的有效siRNA靶點序列。
[0080]表1靶向於人PPP5C基因的siRNA靶點序列
[0081]
【權利要求】
1.一種分離的人PPP5C基因在製備或篩選肺癌、結腸癌、膠質瘤之任一腫瘤治療藥物中的用途。
2.一種降低腫瘤細胞中PPP5C基因表達的分離的核酸分子，所述核酸分子包含: a)雙鏈RNA，所述雙鏈RNA中含有能夠在嚴緊條件下與PPP5C基因雜交的核苷酸序列；或者 b)shRNA，所述shRNA中含有能夠在嚴緊條件下與PPP5C基因雜交的核苷酸序列。
3.如權利要求2所述的分離的核酸分子，其特徵在於，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補共同形成RNA 二聚體，並且所述第一鏈的序列與PPP5C基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環結構，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補，並且所述正義鏈片段的序列與PPP5C基因中的靶序列基本相同。
4.如權利要求2或3所述分離的核酸分子，其特徵在於，所述PPP5C基因的靶序列含有SEQ ID NO: 1-11 中任一序列。
5.如權利要求2或3所述分離的核酸分子，其特徵在於，所述雙鏈RNA為小幹擾RNA，該小幹擾RNA第一鏈的序列如SEQ ID NO:23所示。
6.如權利要求2或3所述分離的核酸分子，其特徵在於，所述shRNA的序列如SEQIDNO:24所示。
7.—種PPP5C基因幹擾核酸構建體,含有編碼權利要求2-6任一權利要求所述分離的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表達所述shRNA。
8.如權利要求7所述PPP5C基因幹擾核酸構建體，其特徵在於，所述PPP5C基因幹擾核酸構建體為幹擾慢病毒載體。
9.如權利要求8所述PPP5C基因幹擾核酸構建體，其特徵在於，所述幹擾慢病毒載體由將編碼所述shRNA的基因片段克隆入慢病毒載體後獲得，所述慢病毒載體選自:
pLK0.l-puro、pLK0.1-CMV-tGFP、pLK0.l-puro-CMV-tGFP、pLK0.1-CMV-Neo,
pLK0.l-Neo、pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLK0.l-puro-CMV-TagCFP、
pLK0.1-puro-CMV-TagYFP, pLK0.1-puro-CMV-TagRFP,pLK0.l-puro-CMV_TagFP635、
pLK0.l-puro-UbC-TurboGFP>pLK0.l-puro-UbC-TagFP635>pLKO-puro-1PTG-lxLacO、
pLK0-puro-1PTG-3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、
pLenti6/BL0CK-1T-DEST、pLenti6-GW/U6_laminshrna、pcDNAl.2/V5_GW/lacZ、
pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL_GFP 或 pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任
o
10.一種PPP5C基因幹擾慢病毒，由權利要求8-9任一權利要求所述幹擾慢病毒載體在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝而成。
11.一種用於預防或治療腫瘤的藥物組合物，其有效物質含有權利要求2-6任一權利要求所述的分離的核酸分子，權利要求7-9任一權利要求所述PPP5C基因幹擾核酸構建體，和/或權利要求10所述的PPP5C基因幹擾慢病毒。
12.權利要求11所述藥物組合物在製備治療肺癌、結腸癌或膠質瘤的腫瘤治療藥物中的應用。
13.一種用於降低腫瘤細胞中PPP5C基因表達的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括:存在於容器中的，權利要求2-6任一權利要求所述的分離的核酸分子，權利要求7-9任一權利要求所述PPP5C基因幹擾核酸構建體，和/或權利要求10所述的PPP5C基因幹擾慢 病毒。
【文檔編號】C12Q1/68GK103623426SQ201210313783
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年8月29日 優先權日:2012年8月29日
【發明者】朱向瑩, 孫琴, 高博, 沈浩, 金楊晟, 瞿紅花, 曹躍瓊 申請人:上海吉凱基因化學技術有限公司