帶色素的組織工程表皮替代物及其製備方法
2023-09-18 11:43:05 1
專利名稱：帶色素的組織工程表皮替代物及其製備方法
專利說明帶色素的組織工程表皮替代物及其製備方法 本發明涉及組織工程領域，具體的說是一種帶色素人工表皮替代物的製備方法及其應用。皮膚是人體最大的器官，起著保護機體的重要作用。當各種原因造成皮膚缺損時，會造成機體工能的障礙，重則危及生命。對皮膚組織缺損，臨床上常見的治療方法為有斷層皮片或全厚層皮片移植和凡士林紗布，其中，斷層皮片是公認的標準治療方法，但是，對於這種治療方法存在造成新的皮膚創傷、及供體不足的問題。
皮膚缺損後，缺損部位的增生性疤痕是其重要的併發症，研究顯示，如果皮膚缺損部位能很快的上皮化，就可以減少缺損部位的瘢痕形成，或減輕疤痕的形成的程度。隨著生物工程技術、醫學的發展，以及各學科交叉的深入，組織工程技術的興起，組織工程皮膚是成為人工皮膚研究的熱點和重點。產生了一系列的專利，其中申請號為200310108082的專利就是關於一種提高創面上皮化的表皮替代物的構建方法。然而，這種單純用表皮細胞構建的表皮替代物在損傷部位表皮化過程中，不能修復該部位損失的色素細胞，如果該部位無黑色素細胞存留，或其它部位的黑色素細胞不能遷移到損傷部位，將來該損傷部位就會留下色素缺失。另外，在臨床中有大量的色素脫失症患者(如白癜風)，這些病人常規的治療方法包括植皮、細胞膜片移植、注射黑色素細胞，但是，植皮給患者帶來新的創傷，細胞膜片移植和黑色素細胞注射療效不確切，因此，臨床上急需一種新的、療效顯著的治療方法。本發明的目的就是要解決上述的不足而提供一種帶色素的組織工程表皮代替物及其構建方法。
為實現上述目的，本發明提出一種帶色素的組織工程表皮替代物，其特徵在於構建的細胞包含表皮細胞和黑色素細胞其來源於細胞庫。
一種帶色素的組織工程表皮替代物的製備方法，其特徵在於包括以下步驟(1)將殼聚糖用1％的乙酸溶解，配製成濃度為2％的殼聚糖溶液；(2)明膠用蒸餾水溶解，配製成濃度4％明膠溶液；(3)將殼聚糖溶液和明膠溶液按重量比為1∶9～9∶1混合，並於37℃的條件下攪拌混合24小時；(4)將混合液加入平面皿中，在35～60℃的條件下加熱2～3小時，乾燥成膜材；(5)取出膜材，並將膜浸泡在無水乙醇中20分鐘，除去乙醇；(6)再加入30mM的EDC或0.25％戊二醛溶液反應3小時；(7)然後用大量的蒸餾水衝洗，並浸泡24小時；(8)在35～60℃的條件下加熱2～3小時，再次乾燥成膜；或在膜上打直徑為20到50微米，密度為1-10個/mm2的小孔，即得殼聚糖-明膠膜材；(9)將上述殼聚糖-明膠膜材置於角化上皮細胞培養液內培養過夜，然後吸乾培養液；(10)按1×104～1×106/cm2的密度接種表皮細胞和黑色素細胞接種在膜材上；(11)將上述細胞～膜材複合物置於培養液進行培養，每3天換液一次，培養時間為3～15天，即可得帶色素組織工程表皮替代物。
一種帶色素的組織工程表皮替代物的製備方法，其特徵在於包括以下步驟(1)將殼聚糖用1％的乙酸溶解，配製成濃度為2％的殼聚糖溶液；(2)明膠用蒸餾水溶解，配製成濃度4％明膠溶液；(3)將殼聚糖溶液和明膠溶液按重量比為1∶9～9∶1混合，並於37℃的條件下攪拌混合24小時；(4)將上述殼聚糖-明膠混合物在-40℃～-70℃預凍3-5小時；(5)然後用低溫冷凍真空乾燥機抽乾水分，得到多孔支架；(6)把支架在35-60℃的條件下加熱2-3小時，再用1～4％的NaOH溶液浸泡，然後用蒸餾水洗滌3-5次；(7)將經過上述處理的支架，加30mM的EDC或用1～5％戊二醛溶液進行交聯反應2～3小時；(8)衝洗乾淨；(9)重新真空冷凍乾燥，得到多孔的殼聚糖-明膠多孔支架；(10)將上述殼聚糖-明膠支架置於角化上皮細胞培養液內培養過夜，然後吸乾培養液；(11)然後按1×104～1×106/cm2的密度接種表皮細胞和黑色素在支架上；(12)將上述細胞～支架複合物置於培養液進行培養，每3天換液一次，培養時間為3～15天，即可得帶色素組織工程表皮替代物。
所述的培養液為角化上皮細胞培養培養液和黑色素細胞培養的混合液，比例為7∶3～3∶7。
所述的培養時間為3～15天。
其表皮細胞和黑色素細胞的比例為99∶1～65∶35，可以根據患者的膚色進行調整。
黑色素培養基為在商品化M154培養基加BPE(0.15～0.3％v/v)、胰島素(3～6μg/ml)、轉鐵蛋白(3～7μg/ml)、鹼性成纖為生長因子(2～4ng/ml)、氫化可的松(0.15～0.2μg/ml)、肝磷脂(2.5～4μg/ml)、TPA(8～12ng/ml)、血管內皮素(1.5-4.5ng/ml)。
本發明同現有技術相比，本發明是一種帶色素的表皮替代物，它在修復創傷部位的上皮組織同時，修復該部位的黑色素細胞，兼顧了該部位色素和周圍組織協調的美觀問題，使患者的損傷部位的皮膚修復更加的完美。1、表皮細胞、黑色素細胞的分離、培養將皮膚組織用氯黴素溶液洗滌3-5次，或(和)用75％的乙醇溶液用浸泡1分鐘，PBS洗滌2-3次；用剪刀製成2-4mm寬的皮條，將0.15～0.5u/ml的Dispase消化37℃消化2-7小時，或4℃消化8-12小時，將上皮層和真皮層分離；表皮層然後加0.05％胰酶加0.53mM的EDTA消化8-20分鐘，將消化液用胰酶抑制劑中止消化，經150目的不鏽鋼慮網過濾，收集細胞分成兩份，一份加表皮細胞培養液培養，一份加黑色素細胞培養液培養，並分別進行細胞擴增。
黑色素培養基為在商品化M154培養基加BPE(0.2％v/v)、胰島素(5μg/ml)、轉鐵蛋白(5μg/ml)、鹼性成纖為生長因子(3ng/ml)、氫化可的松(0.18μg/ml)、肝磷脂(3μg/ml)、TPA(10ng/ml).
2、生物材料的製備a)殼聚糖/明膠分別用1％的乙酸和蒸餾水溶解，配製成濃度分別為2％和4％的殼聚糖溶液和明膠溶液，按重量比為1∶9～9∶1混合，37℃攪拌混合24小時，較一定量的混合液加入平皿中，乾燥成厚度為100～600um的膜材；在35～60℃加熱2～3小時；將膜從培養掀起，浸泡在無水乙醇20分鐘，去乙醇，加30mM的EDC或0.25％戊二醛溶液反應3小時，大量的蒸餾水衝洗，並浸泡24小時，再次乾燥成膜備用，或在膜上打直徑為20到50微米，密度為1-4個/mm2的小孔備用。
b)按上述的殼聚糖和明膠的成分比例，製成殼聚糖/明膠混合物，並在在-40℃～-70℃預凍3-5小時，用低溫冷凍真空乾燥機抽乾水分，得到厚度為100～1000μm多孔支架。然後把支架再35-60℃加熱2-3小時，用1～4％的NaOH溶液浸泡，蒸餾水洗滌3-5次。加30mM的EDC進行交聯反應2～3小時，用流水衝洗；或用1～5％戊二醛溶液交聯反應2～3小時，用2％硼氫化鈉溶液洗滌，蒸餾水衝洗。重新真空冷凍乾燥，得到多孔的殼聚糖-明膠多孔支架。
3、表皮替代物的構建將上述的生物支架放置在混和培養液內培養過夜，吸乾；按1×104～1×106/cm2的密度接種細胞，細胞包括表皮細胞和黑色素細胞，表皮細胞和黑色素細胞的比例為99∶1～65∶35，具體根據患者的膚色進行調整。接種後2-4小時，加培養液，在37℃，5％二氧化碳，飽和溼度條件下進行培養。每3天換液一次，培養時間為3～15天，以5～7為最佳，形成單層的細胞生物支架複合物備用。
4、表皮細胞替代物的臨床應用表皮替代物可以應用於臨床大面積燒傷創面、整形外科中的供皮區創面、各種慢性潰瘍等皮膚缺損的修復，以及各種皮膚色素脫失。
在患者大腿部的色素脫失部位取中厚皮片後，留下6×4cm2供皮區創面，用根據本專利的技術方案構建的色素的表皮替代物進行治療，將表皮細胞替代物的細胞面與患者的創面接觸，常規創面包紮處理。7天後打開外敷料，觀察創面情況。2個月後，發現損傷部位上皮化良好，並且原來色素脫失部位，重新有色素沉著。
權利要求
1.一種帶色素的組織工程表皮替代物，其特徵在於構建的細胞包含表皮細胞和黑色素細胞其來源於細胞庫。
2.一種帶色素的組織工程表皮替代物的製備方法，其特徵在於包括以下步驟(1)將殼聚糖用1％的乙酸溶解，配製成濃度為2％的殼聚糖溶液；(2)明膠用蒸餾水溶解，配製成濃度4％明膠溶液；(3)將殼聚糖溶液和明膠溶液按重量比為1∶9～9∶1混合，並於37℃的條件下攪拌混合24小時；(4)將混合液加入平面皿中，在35～60℃的條件下加熱2～3小時，乾燥成膜材；(5)取出膜材，並將膜浸泡在無水乙醇中20分鐘，除去乙醇；(6)再加入30mM的EDC或0.25％戊二醛溶液反應3小時；(7)然後用大量的蒸餾水衝洗，並浸泡24小時；(8)在35～60℃的條件下加熱2～3小時，再次乾燥成膜；或在膜上打直徑為20到50微米，密度為1-10個/mm2的小孔，即得殼聚糖-明膠膜材；(9)將上述殼聚糖-明膠膜材置於角化上皮細胞培養液內培養過夜，然後吸乾培養液；(10)按1×104～1×106/cm2的密度接種表皮細胞和黑色素細胞接種在膜材上；(11)將上述細胞～膜材複合物置於培養液進行培養，每3天換液一次，培養時間為3～15天，即可得帶色素組織工程表皮替代物。
3.一種帶色素的組織工程表皮替代物的製備方法，其特徵在於包括以下步驟(1)將殼聚糖用1％的乙酸溶解，配製成濃度為2％的殼聚糖溶液；(2)明膠用蒸餾水溶解，配製成濃度4％明膠溶液；(3)將殼聚糖溶液和明膠溶液按重量比為1∶9～9∶1混合，並於37℃的條件下攪拌混合24小時；(4)將上述殼聚糖-明膠混合物在-40℃～-70℃預凍3-5小時；(5)然後用低溫冷凍真空乾燥機抽乾水分，得到多孔支架；(6)把支架在35-60℃的條件下加熱2-3小時，再用1～4％的NaOH溶液浸泡，然後用蒸餾水洗滌3-5次；(7)將經過上述處理的支架，加30mM的EDC或用1～5％戊二醛溶液進行交聯反應2～3小時；(8)衝洗乾淨；(9)重新真空冷凍乾燥，得到多孔的殼聚糖-明膠多孔支架；(10)將上述殼聚糖-明膠支架置於角化上皮細胞培養液內培養過夜，然後吸乾培養液；(11)然後按1×104～1×106/cm2的密度接種表皮細胞和黑色素在支架上；(12)將上述細胞～支架複合物置於培養液進行培養，每3天換液一次，培養時間為3～15天，即可得帶色素組織工程表皮替代物。
4.根據權利要求2或3所述的一種帶色素的組織工程表皮替代物的製備方法，其特徵在於所述的培養液為角化上皮細胞培養培養液和黑色素細胞培養的混合液，比例為7∶3～3∶7。
5.根據權利要求2或3所述的一種帶色素的組織工程表皮替代物的製備方法，其特徵在於所述的培養時間為3～15天。
6.根據權利要求2或3所述的一種帶色素的組織工程表皮替代物的製備方法，其特徵在於其表皮細胞和黑色素細胞的比例為99∶1～65∶35，可以根據患者的膚色進行調整。
7.根據權利要求2或3所述的一種帶色素的組織工程表皮替代物的製備方法，其特徵在於黑色素培養基為在商品化M154培養基加BPE(0.15～0.3％v/v)、胰島素(3～6μg/ml)、轉鐵蛋白(3～7μg/ml)、鹼性成纖為生長因子(2～4ng/ml)、氫化可的松(0.15～0.2μg/ml)、肝磷脂(2.5～4μg/ml)、TPA(8～12ng/ml)、血管內皮素(1.5-4.5ng/ml)。
全文摘要
一種帶色素人工表皮替代物的製備方法及其應用，其特徵在於構建的細胞包含表皮細胞和黑色素細胞其來源於細胞庫，其製備方法為(1)將殼聚糖用1％的乙酸溶解；(2)明膠用蒸餾水溶解；(3)將殼聚糖溶液和明膠溶液混合攪拌混合；(4)將混合液加入平面皿中加熱，乾燥成膜材；(5)取出膜材；(7)然後用大量的蒸餾水衝洗浸泡；(8)加熱；(9)置於培養液內培養；(10)將上述細胞～膜材複合物置於培養液進行培養，即得帶色素組織工程表皮替代物；本發明同現有技術相比，它在修復創傷部位的上皮組織同時，修復該部位的黑色素細胞，兼顧了該部位色素和周圍組織協調的美觀問題，使患者的損傷部位的皮膚修復更加的完美。
文檔編號A61L27/00GK1786155SQ20051003105
公開日2006年6月14日 申請日期2005年10月21日 優先權日2005年10月21日
發明者吳蓮蓮, 丁建明 申請人:吳蓮蓮, 丁建明