抑制接合蛋白/酪氨酸激酶相互作用的方法與組合物的製作方法

2023-09-18 14:33:35

專利名稱：：抑制接合蛋白/酪氨酸激酶相互作用的方法與組合物的製作方法1.引言本發明涉及抑制接合蛋白/磷酸化酪氨酸相互作用，特別是這些相互作用涉及能夠同含SH2片段成員的接合蛋白家族相配合的一種蛋白質酪氨酸激酶，該酶與細胞增殖疾病相關。特別是，本發明涉及特別的有機化合物，以及利用這些化合物的方法。2.發明背景2.1蛋白質磷酸化作用與信號傳導在很大程度上，細胞依賴於細胞內的分子接受相鄰環境的刺激。對於正確地調節諸如辨別、收縮、分泌、細胞分裂、接觸抑制和代謝等各種細胞內的過程，這些細胞內的信號是最基本的。這些細胞內的分子包括例如激素、生長因子、淋巴因子或神經傳遞物質，作為配體結合於特異性的細胞表面受體。這些配體對其受體的結合，導致了一連串的反應，使最初的刺激得以放大和上述提及的各個細胞內過程得以協同調節。除了正常的細胞過程外，受體及其細胞內的配體也會參與到反常的或潛在有害的過程中，例如病毒-受體間相互作用、炎症、和細胞轉化至致癌狀態。該過程的主要特點，是某些蛋白質的可逆性磷酸化，稱之為信號的傳導。(最近的綜述文獻，參見PosadaJ和cooperJA，1992，MolBiolCell3583-592；HardieDG，1990，SympSocExpBiol44241-255)。胺基酸殘基的磷酸化或去磷酸化，使常規的蛋白質發生了構象的變化，從而改變了它們的生物活性。蛋白質通過蛋白質激酶磷酸化，也通過蛋白質磷酸酯酶去磷酸化。蛋白質激酶和磷酸酯酶是按它們所作用的胺基酸殘基而分類的，當作用於絲氨酸和蘇氨酸殘基時，屬絲氨酸-蘇氨酸激酶和磷酸酯酶(參見ScottJD和SoderlingTR1992，2289-295)，當作用於酪氨酸殘基時，則屬酪氨酸激酶和其磷酸酯酶(參見FischerEH等，1991Science253401-406；SchlessingerJ和UllrichA，1992，Neuron61203-212)。蛋白激酶和其磷酸酯酶可進一步被稱之為受體，即該酶是跨膜，結合配體的分子中的一個組成部分；或稱之為非受體，意味著它們通過鍵合於配體的受體而作用，間接地應答於細胞內的分子。磷酸化是一個動力學過程，涉及競爭性磷酸化和去磷酸化作用，任一時刻的磷酸化水平，它反映了該時刻的相對活性，以及催化這些作用的蛋白質激酶和磷酸化酶的水平。當大部分蛋白磷酸化發生了絲氨酸和蘇氨酸殘基時，也會在酪氨酸殘基上發生磷酸化反應，這引起了人們很大的興趣，因為發現許多癌基因產物和生長因子受體具有內源性的蛋白酪氨酸激酶的活性。現在已證實了在生長因子信號傳導，細胞循環過程和腫瘤轉移中的蛋白質酪氨酸磷酸化作用的重要性(CantleyL.C.等，1991，Cell，64281-302；HunterT，1991，Cell64249-270；Nurse，1990，Nature344503-508；Schlessinger，J和UllrichA，1992，Neuron，9383-391；UllrichA和SchlessingerJ，1990，Cell61203-212)。已經表明，正常生長控制途徑的顛倒，會產生癌基因化作用，這是因為構成大量顯性癌蛋白的蛋白質酪氨酸激酶的活化或過度表達(參見HunterT，1991，Cell64249-270綜述)。2.2蛋白質酪氨酸激酶蛋白質酪氨酸激酶由蛋白質的一大家族所組成，包括許多生長因子受體和潛在的癌基因，它不同於絲氨酸/蘇氨酸特異性的蛋白質激酶，但與它們具有共同的祖先(Hanks等，1988，Science24142-52)。對具有跨膜結構的受體型蛋白質酪氨酸激酶曾進行了廣泛的研究。特異性配體結合於細胞內受體蛋白質酪氨酸激酶的區域，被認為能誘導其自身酪氨酸殘基受體的二聚和磷酸化作用。受體中個別磷酸化酪氨酸殘基的細胞區域，可作為特異性的結合位點與細胞信號分子宿主作用，因此激活了各種信號傳導途徑(UllrichA和SchlessingerJ，1990，Cell61203-212)。可將細胞內，細胞質，非受體蛋白質酪氨酸激酶，廣義地定義為不含疏水跨膜區的蛋白質酪氨酸激酶。在這一廣義分類中，可將已知的細胞蛋白質酪氨酸激酶分成11個明顯的形態，包括SRC家族(MartinezR等，1987，Science237411-414；SukegawaJ等，1987，MolCellBiol741-47；YamanishiY等，1987，7237-243；MarthJ.D.等，1985，Cell43393-404；DymeckiSM等，1990，Science247332-336)，FES家族(參見RuebrockAJM等，1985，EMBOJ，42897-2903；HaoQ等，1989，MolCellBjol91587-1593)，ABL家族(ShtivelmanE等，1986，Cell47277-284；KruhGD等，1986，Science2341545-1548)，Zap70家族和JAK家族。雖然它們的總分子結構有別，但這些細胞蛋白酪氨酸激酶多形態家族中的每一個成員，除具有共同的催化激酶區域外，還具有共同的非催化區。這些非催化區是SH2區域(SRC同源區2；SadowskiI等，MolCellBiol64396-4408；KochCA等，1991，Science252668-674)和SH3區域(MayerBJ等，1988，Nature332269-272)。據認為該非催化區域在調節信號傳導時的蛋白-蛋白相互作用方面具有重要作用(PawsonT和GishG，1992，Cell71359-362)。與受體型蛋白酪氨酸激酶的代謝作用相比較，對細胞質蛋白酪氨酸激酶的代謝作用了解得不多，在解釋該類分子涉及的某些過程方面已經取得重要進展。例如，已經表明src家族中lck和fyn，能與CD4/CD8和T細胞受體複合物，這樣就意味著T細胞的激活作用(VeilletteA和DavidsonD，1992，TIG861-66)，某些細胞內蛋白酪氨酸激酶同細胞循環的某期相連(MorganDO等，1989，Cell57775-786；KipreosET等，1990，Science248217-220；Weaver等，1991，MolCellBiol114415-4422)，以及細胞蛋白質酪氨酸激酶可能參與神經元的生長(ManessD，1992，DevNeurosci14257-270)。通過突變或過度表達而致的激酶活性的失調，是一個進行細胞轉化的一個很好確立的機理(Hunter等，1985，Supra；Ullrich等，Supra)。2.3接合蛋白接合蛋白是細胞內蛋白，具有對信號傳導途徑具關鍵作用的特徵性保守的肽區域(如下所述的SH2和/或SH3區)。該接合蛋白用來將蛋白酪氨酸激酶，特別是受體型蛋白酪氨酸激酶，與諸如RAS信號途徑的下遊分子內信號途徑相連結。據認為該接合蛋白可能涉及將信號傳導蛋白定位於血漿膜或亞細胞單元上的正確位置上，也可能涉及調節細胞內蛋白質的運動。這種接合蛋白是在受體型蛋白質酪氨酸激酶的蛋白質底物之中，具有共同的一個或二個約100個胺基酸長基本特點的重複單位。由於該基本特點最初發現於類似於c-Src細胞內非受體酪氨酸激酶之中，它稱為Src同源2(SH2)區。但是含SH2的多肽，在結構和功能上可能與另一含SH2多肽有區別(見KochCA等，1991，Science252668-674)。SH2區能直接識別磷酸化酪氨酸殘基。對於識別周圍有磷酸化酪氨酸殘基的胺基酸，該肽區還具有獨立的位點。當受體蛋白酪氨酸激酶與一個分子內的配體相結合時，能誘導受體的二聚作用，這會反過來致使二聚的激酶進行分子間自動磷酸化。(參見SchlessingerJ和UllrichA，1992，Neuron9383-391)。這樣，受體磷酸化生成了能鍵合SH2的位點，一個接合蛋白就可能與之結合。除SH2肽區外，許多接合蛋白在信號傳導時涉及第二個含50-75個胺基酸殘基的保守基本單元，即SH3區(SchlessingerJ和UllrichA，1992，Neuron9383-391；PawsonT和GishGD，1992，Cell72359-362；MayerBJ和BaltinoreD，1993，Nature352272-275)。關於SH3區的生物學作用，要比SH2區的了解少得多。目前的觀點認為SH3區的功能，部分作為與蛋白鍵合的區，其作用是將從細胞表面的傳遞信號連接至下遊作用基因，如ras基因(PawsonT和SchlessingerJ，1993，CurrentBiology，3434-442)。2.4G-蛋白與信號傳導可與鳥嘌呤核苷酸鍵合的蛋白(即G蛋白；SimonMI等，1991，Science252802-808；KaziroY等，1991，AnnRevBiochem60349-400)，如Ras(參見綜述LowyDR和WillumsenBM，1993，AnnRevBiochem62851-891)，在從受體酪氨酸激酶傳遞促有絲分裂的信號中，發揮重要的作用。就Ras舉例，通過配體鍵合使受體酪氨酸激酶活化，從而導致了活性GTP結合形式Ras分子的積聚(見GibbsJ.B.等，1990，JBiolChem26520437-2044；SatohT.等，1990，ProcNatlAcadSciUSA875993-5997；LiB-Q等，1992，Science2561456-1459；BudayL.和DownwardJ.，1993MolCellBiol131903-1910；MedemaR.H.等，1993，MolCellBiol13115-162)。Ras的激活也要求病毒致癌酪氨酸激酶的轉化(見SmithM.R.等，1986，Nature320540-43)。Ras活性受到激活GTP酶的蛋白(GAPs)和鳥嘌呤核苷酸交換因子反作用的調節，同時GAPs促使GTP水解Ras固有的速率變慢，而交換因子促進Ras的GDP與GTP交換的基速率。這樣GAPs就作為Ras功能的負調節子，而交換因子則作為Ras的活化子。最近，發現了活化的受體酪氨酸激酶與Ras之間的一種直接的聯繫，並發現哺乳類GRB-2蛋白，一種由一個SH2區和二個SH3區所組成的(見LowensteinE.J.等，1992，Cell70431-442)分子量為26千道爾頓的蛋白質，能直接將受體酪氨酸激酶，與哺乳類和果蠅的Ras交換子Sos直接相偶聯。(參見BudayL和DownwardJ，1993，Cell73611-620；EganS.E.等，1993，Nature36345-51；LiN等，1993，Nature36385-87；GaleN.W.等，1993，Nature36388-92；Rozakis-Adcock等，1993，Nature36383-85；ChardinP等，1993，Science2601338-1343；OliverJ.P.等，Cell73179-191；SimonM.A.等，1993，Cell73169-177)。GRB-2SH2區與受體酪氨酸激酶之中特異性酪氨酸磷酸化的序列相結合，而GRB-2SH3區則與Sos交換因子中存在的富含脯氨酸序列相結合。因此，結合於受體激酶的GRB-2，就可令Sos補充至有Ras存在的血漿膜上(SchlessingerJ，1993，TIBS18273-275)。在其它蛋白質中，已經表明Grb2與CSF-1受體(VanderGeer和Hunter，1993，EMBOJ，12(13)5161-5172)，PDGF受體(Li等，1994，MCB14(1)509-517)，EGF-R(Matuoka等，1993，EMBOJ，12(9)3467-3475；Lowenstein等，1992，Cell，70431-442)和Fak(Schlaepfer，1994，Wature372786-791)相關。2.5細胞增殖疾病生長因子和其受體對正常生長是關鍵的，但它們又能作為致癌基因，而致使細胞轉化、致癌和產生細胞增殖疾病，包括癌症。正常細胞蛋白如蛋白酪氨酸激酶，其癌變可能的激活，可能是通過改變蛋白質相應的酶活性，它們與其它細胞成分的不適當鍵合，或兩者同時存在而發生的。以Philadelphia正性染色體人類白血病為例，已知BCR-ABL致癌蛋白參與該白血病的病理過程之中。BCR-ABL顯示出使酪氨酸激酶失調的活性。近來已經證實(PendergastAM等，1993，Cell75175-185)BCR-ABL能與含SH2/SH3區的GRB-2接合蛋白相鍵合。進一步證實，BCR-ABL/GRB-2的鍵合，是受GRB-2SH2區和BCR-ABL蛋白質酪氨酸磷酸化區直接相互作用而調導的，這種相互作用要求激活Ras信號途徑。這樣，沿著一種信號傳導途徑會發生多個事件，而該途徑看來會最終出現細胞增殖疾病，例如上述的白血病。一個治療癌變即細胞增殖疾病的方法是，通過幹擾一個或多個這些不可少的事件，以試圖使能出現這些疾病的反常信號傳導事件發生「短路」。通過定向或直接抑制涉及細胞增殖疾病的酶的活性，也可能會干擾了對反常激酶活性的改良。現已提出某些化合物可能具有這種抗酪氨酸激酶活性。見Levitzki和Gazit1995，Science2671782-1788，在該文中提出了某些喹唑啉衍生物能直接抑制受體酪氨酸激酶的酶活性。在信號傳導事件涉及一種接合蛋白/蛋白酪氨酸激酶相互作用的情況下，將該相互作用抑制，可能會使細胞增殖疾病症狀得到改善。利用細胞內信號失能蛋白的表達，已證明該方法的可用性。例如，細胞表達出一種Bcr-Ab1的突變形式，它缺乏與GrB2SH2區鍵合所必需的酪氨酸殘基，這樣信號的失能不再顯出一種轉形的共同表型(RER)(見Pendergast等，supra)。但到目前為止，還沒有識別出接合蛋白/蛋白酪氨酸激酶的這種抑制劑。3.發明概述本發明涉及抑制接合蛋白/蛋白酪氨酸激酶蛋白相互作用的方法和組合物，特別是這種相互作用與細胞增殖疾病相關聯，涉及能與含SH2和/或SH3成員的接合蛋白家族相配位的一種蛋白質酪氨酸激酶。尤其是，本發明涉及具體的有機化合物，以及利用這些化合物的方法。在這裡「蛋白質酪氨酸激酶」將縮寫為「PTK」。應當懂得，除非另外指明，「PTK」可代表一種轉膜受體型蛋白質酪氨酸激酶，也可代表細胞質蛋白酪氨酸激酶。本發明中的化合物，能抑制PTK/接合蛋白相互作用，特別是PTK/接合蛋白相互作用中，PTK例如是表皮生長因子受體(EGF-R)蛋白酪氨酸激酶分子，源於血小板的生長因子受體(PDGF-R)蛋白酪氨酸激酶分子，或類胰島素生長因子受體酪氨酸激酶分子(IGF-IR)。本發明中的化合物由下列通式(I)及其可作為藥用的鹽所描述ID2，5-雙吲哚基-3-基-1，4-苯醌其中R1和R2分別獨立地代表氫原子，乙酸酯或芳基、烷基芳基以及高級烷酸酯；R3至R14分別獨立地代表氫、烷基、烯烴基、炔烴基、羥基、羥烷基、烷氧基、硝基、滷素、三滷甲基、醯胺、羰醯胺、羧基、碸基、磺醯胺、胺基和巰基，如需要它們也可以由合適取代基所取代。本發明範圍內的特別的化合物，由下面的通式(II)所述。通式中R1和R2列於通式後的表I之中。在實例中可以發現這些化合物製備與分離的示例。表1例R1R21H2-(2-甲基丁-2-烯-4-基)2乙醯基2-(2-甲基丁-2-烯-4-基)3乙醯基2-(3-甲基-n-丁基)4H2-(3-甲基-n-丁基)5H5-溴6H2-烯丙基7H2-正丙基8H2-胺基羰基9乙醯基2-胺基羰基10苯甲醯基2-烯丙基11H2-氰基12H4-甲氧羰基13H5，7-二甲氧基14H4，7-二甲氧基15H5-硝基16H4-(4-氯苯甲醯胺)17H4-(4-氯苯基)18H2-(4-氟苯基)19H4，6-二甲氧基20H5-羥基-6-甲氧基21H4-氰基22H5-(4-三氟甲基苯基-胺基羰基)23H2-(4-三氟甲基苯基-胺基羰基)24H2-乙基25H5-溴-6-硝基26甲氧基2-(2-甲基丁-2-烯-4-基)27甲氧基2-(3-甲基-n-丁基)本發明範圍內特別化合物，也可由下列通式(III)所描述。式中R1至R12列於式後的表II之中。這些化合物的製備與分離示例，可在實例中找到。表II注1除非另有指定，一般R3-R10等於H這裡所用「烷基」一詞係指直鏈或支鏈飽和脂肪基團，其具有1至20個碳原子，如甲基、乙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、正己基、正辛基和正癸基；「烯烴基」和「炔烴基」係指直鏈或支鏈飽和脂肪基團，其具有2至10個碳原子，並分別帶有不飽和的雙鍵或叄鍵，如乙烯基、烯丙基、炔丙基、1-甲基乙烯基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、丁-2-炔基、1-甲基丁-2-烯基、戊-1-烯基、戊-3-烯基、3-甲基丁-1-炔基、1，1-二甲基烯丙基、2-己烯基和1-甲基-1-乙基烯丙基；「烷基芳基」係指前面提到的烷基被一個苯基所取代，如苄基、苯乙基、苯丙基、1-苄基己基、苯丁基和2-苄基丙基；這裡所用的「芳基」包括一個單環或雙環，其中至少一個環是芳香環，包括芳環或雜環；「羥基烷基」係指前面所提到的烷基被一個單羥基所取代，如2-羥基乙基、2-羥基丙基、3-羥基丙基、4-羥基丁基、1-羥基丁基和6-羥基己基。這裡所用的「取代的」一詞，係指該基團帶有一個或多個取代基，包括滷素、羥基、氰基、烷基、芳基、烯烴基、炔烴基、胺基、硝基、巰基、羧基和其它本領域人員所熟知的取代基團，但不限於此。本發明優選的化合物，包括如下化合物1化合物2以及其可作為藥用的鹽。此外，本發明包括一種含有本發明中一個化合物的藥物組合物，以及動物特別是人中使用本發明中的一個化合物或藥物組合物的方法，以改善涉及蛋白酪氨酸激酶/接合蛋白相互作用而致細胞增殖疾病的症狀。本發明部分是基於發現該公開的化合物，它不顯示出對於蛋白質酪氨酸激酶的酶活性的抑制作用，但它能對含SH2肽與酪氨酸磷酸化EGF受體的鍵合起抑制作用。在下面第6、7和8部分中的例子的數據，說明了該發現。在下面第5部分的例子描述了本發明化合物的生產方法。本發明系首次描述了已經被發現的化合物，它能直接抑制接合蛋白和蛋白酪氨酸激酶分子的相互作用。4.本發明的詳細說明下面描述的是，抑制接合蛋白/蛋白酪氨酸激酶蛋白相互作用，特別是這些相互作用與細胞增殖疾病相關聯的方法和組合物。下面特別描述了特殊的有機化合物，合成這些化合物的方法，以及使用這些化合物的技術。4.1化合物本發明化合物由如下式(IV)所示以及其可作為藥用的鹽其中R1和R2分別獨立地代表H、乙酸酯或芳基、烷基芳基和高級烷酸酯；R3至R14分別獨立地代表H、烷基、烯基、炔基、羥基烷基、OH基、烷氧基、硝基、滷素、三滷甲基、醯胺、羰醯胺、羧基、碸基、磺醯胺、胺基和巰基，它們可被合適的取代基所取代。例如，本發明化合物中的烷基，可以被一個或多個羧基或芳基所取代。本發明化合物中的烯烴基，可以被一個或多個羧基所取代。在本發明範圍內的特定的化合物，可在前面表I和表II中發現。製備示例或分離這些化合物，可在實例中發現。實施方案一，本發明化合物及其藥用鹽由下面的通式(III)所描述其中R1和R2分別獨立地代表氫、低級烷基、乙醯基、芳基、烷基芳基或高級烷酸酯，其中R1和R2至少之一不是氫；R3至R12分別獨立地代表H、烷基、烷基羧基、烯烴基、烯烴基羧基、芳基、烷基芳基、OH基、烷氧基、硝基、滷素、三滷甲基、醯胺、羰醯胺、羧基、碸基、磺醯胺、胺基、巰基或2-甲基丁-2-烯-4-基；其中至少R11和R12之一是2-甲基丁-2-烯-4-基。R1至R12基團可按需要，被取代或不被取代。另一實施方案是，本發明化合物以及其可作為藥用的鹽由上面通式(III)所描述，其中R1和R2均代表H；R3至R10分別獨立地代表H、烷基、烷基羧基、烯烴基、烯烴基羧基、芳基、烷基芳基、OH基、烷氧基、硝基、滷素、三滷甲基、醯胺、羰醯胺、羧基、碸基、磺醯胺、胺基、巰基或2-甲基丁-2-烯-4-基；以及R11和R12分別獨立地代表H或2-甲基丁-2-烯-4-基，其中至少R11和R12之一為2-甲基丁-2-烯-4-基；其中至少R3至R10之一不為H。另一實施方案是，本發明化合物及其可作為藥用的鹽由上面通式(III)所描述，其中R1和R2分別獨立地代表芳基、烷基芳基和高級烷酸酯；以及R3至R12分別獨立地代表H、烷基、烷基羧基、烯烴基、烯烴基羧基、芳基、烷基芳基、OH基、烷氧基、硝基、氟、氯、碘、三滷甲基、醯胺、羰醯胺、羧基、碸基、磺醯胺、胺基或巰基。另一實施方案是，本發明中化合物及其可作為藥用的鹽由上述通式(III)所描述，其中R1、R2、R11和R12代表H；以及R3至R10分別獨立地代表H、烷基、烷基羧基、烯烴基、烯烴基羧基、芳基、烷基芳基、烷氧基、羥基、硝基、滷素、三滷甲基、醯胺基、羰醯胺基、羧基、碸基、磺醯胺、胺基或巰基，其中至少R3至R10之一不為H；(a)當R4至R10每個都為H時，R3不能為2-甲基丁-2-烯-4-基或2-羥基-2-甲基丁-4-基；(b)當R4至R6和R8至R10每個都為H時，R3和R7不能同時為2-甲基丁-2-烯-4-基；(c)當R3至R4，R6至R8和R10每個都為H時，R5和R9不能同時為2-甲基丁-2-烯-4-基或3-甲基-正丁基；(d)當R3、R5至R7、R9至R10代表H時，R4和R8不能同時為2-甲基丁-2-烯-4-基或2-甲基丁-1，4-二烯-4-基，以及R4和R8不能為2-甲基丁-2-烯-4-基和2-甲基丁-1，4-二烯-4-基。本發明還包括上述通式(III)代表的化合物，以及可作為藥用的鹽，其中R3至R5和R7至R9代表H，並且R6和R10之一或兩者均代表2-甲基丁-2-烯-4-基。另一實施方案是，本發明化合物由上述通式(III)及其可作為藥用的鹽所描述，其中至少R1和R2之一代表乙醯基；R11和R12代表H；以及R3至R10分別獨立地代表H、烷基、烷基羧基、烯烴基、烯烴基羧基、芳基、烷基芳基、OH基、烷氧基、硝基、滷素、三滷甲基、醯胺基、羰醯胺基、羧基、碸基、磺醯胺基、胺基和巰基，其中(a)當R1和R2均為乙醯基時，或當R1和R2之一是乙醯基，R3至R4，R6至R8以及R10至R12代表H時，R5和R9不能同時代表2-甲基丁-2-烯-4-基；(b)當R1和R2均為乙醯基，R4至R6和R8至R10代表H，R3和R7不能同時代表2-甲基丁-2-烯-4-基；(c)當R1和R2均為乙醯基，R3、R5至R7以及R9至R10代表H，R4和R8不能同時代表2-甲基丁-2-烯-4-基。另一實施方案是，本發明化合物及其可作為藥用的鹽由上述通式(III)所描述，其中至少R1和R2之一是低級烷基；R11和R12代表H；以及R3至R10分別獨立地代表H、烷基、烷基羧基、烯烴基、烯烴基羧基、芳基、烷基芳基、OH基、烷氧基、硝基、滷素、三滷甲基、醯胺羰醯基、羧基、碸基、磺醯胺、胺基和巰基，其中(a)當R1和R2兩者均為甲基時，至少R3至R10之一必須是不等於H的基團；(b)當R1和R2兩者均為甲基時，R4至R10為H，R3不能代表2-甲基丁-2-烯-4-基；(c)當R1和R2兩者都為甲基時，R4至R6和R8至R10代表H，R3和R7不能同時代表2-甲基丁-2-烯-4-基。(d)當R1和R2兩者都為甲基時，R3至R4、R6至R8和R10代表H，R5和R9不能同時代表2-甲基丁-2-烯-4-基。本發明也還包括上述通式(III)所示化合物，及其可作為藥用的鹽。其中R4代表2-甲基丁-2-烯-4-基，R3和R5至R10代表H，或者R5代表2-甲基丁-2-烯-4-基，R3至R4，R6至R10代表H；或者R6代表2-甲基丁-2-烯-4-基，R3至R5，R7至R10代表H。另一實施方案是，本發明中的化合物及其可作為藥用的鹽由上述通式(III)所描述，其中R1和R2分別獨立代表氫、低級烷基、乙醯基、芳基、烷基芳基或高級烷酸酯；R3至R10分別獨立地代表H、烷基、烷基羧基、芳基、烷基芳基、烯烴基、烯烴基羧基、OH基、烷氧基、硝基、滷素、三滷甲基、醯胺、羧酸醯胺、羧基、碸基、磺醯胺、胺基、巰基、4-甲基苯磺醯胺或2-甲基丁-2-烯-4-基；以及R11和R12代表由下面所選基團氫、甲基、乙基、丙基、丁基、芳基、烷基芳基、烷基羧基、烯烴基羧基、丁-1-烯-4-基、2-甲基丁-1-烯-4-基、4-甲基-n-戊基、2-苯基乙基、2-甲基戊-2-烯-4-基，以及4-羧基-n-丁基，其中至少R11和R12之一必須代表除氫之外的基團。另一實施方案是，本發明化合物及其可作為藥用的鹽由上述通式(III)所描述，其中R1和R2分別獨立地代表氫、低級烷基、乙醯基、芳基、烷基芳基或高級烷酸酯；R3至R10分別獨立地代表H、烷基、烷基羧基、芳基、烷基芳基、烯烴基、烯烴基羧基、OH基、烷氧基、硝基、滷素、三滷甲基、醯胺基、羧酸醯胺、羧基、碸基、磺醯胺基、胺基、巰基、4-甲基苯磺醯胺或2-甲基丁-2-烯-4-基；以及R11和R12兩者均代表3-甲基-n-丁基。再一實施方案是，本發明化合物及其可作為藥用的鹽由上述通式(III)所描述，其中R1和R2分別獨立地代表氫、低級烷基、乙醯基、芳基、烷基芳基或高級烷酸酯；R3至R10分別獨立地代表氫、烷基、烷基羧基、芳基、烷基芳基、烯烴基、烯烴基羧基、OH基、烷氧基、硝基、滷素、三滷甲基、醯胺、羧酸醯胺、羧基、碸基、磺醯胺、胺基、巰基、4-甲基苯磺醯胺或2-甲基丁-2-烯-4-基，其中至少R3至R10之一不能代表氫；以及R11和R12分別獨立地代表氫或3-甲基-n-丁基。化合物1化合物2本發明包括上面描述的化合物及其可作為藥用的鹽。本發明的這些化合物可按本文描述的方法進行合成或分離。本發明中的化合物，可按照標準的有機化學技術，利用易於獲得的原料進行合成。或者，可按下面5.2節所述方法，進行分離獲取。4.2化合物的製備4.2.1天然產物分離本例使用真菌培養(PenLabsInc.#592)方法，下面是發酵條件酵母麥芽提取物，加上微量元素，22℃。種子基由甘露糖醇60.0g；大豆蛋白12.5g，檸檬酸2.5g，酵母提取物0.5g所組成，用水稀至1升。在置於反應釜之前，種子基的pH調至7.0。每250ml燒瓶中懸浮30ml種子基(28℃，6天)，然後再用1ml孢子/菌絲均漿懸浮液接種(2天)。孢子儲液中的肉湯培養基維持於-80℃冰冷。將發酵混合物(菌絲和肉湯)均漿，並用乾酪包布吸濾。濾液以0.5v/v乙酸乙酯提取三次，合併乙酸乙酯層，經旋轉蒸發除去溶劑。將菌絲用0.4v/v乙酸乙酯提取二次。合併乙酸乙酯層，以旋轉蒸發除去溶劑。將均含有星狀醌類物質的油狀殘留物合併，並於真空泵乾燥過夜。將上述獲得的粗品，經PC公司含三重旋式柱的高速逆流層析儀(HSCC)進行分餾。將1∶3∶3∶3v/v/v/v正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水混合，並處理過夜。取下層泵入HSCC柱子中，作為固定相，上層作為流動相。二小時後，將上下層倒過來使用。四小時後HSCC分離完全。粗代謝物8至12分鐘流出。將活性成分合併，並減壓蒸乾。用下面的條件，將合併的HSCC組成份(8-12)進行半製備HPLC分離(WatersHPLC系統，Waters996光導(photodioarray)檢測器，用Millennium軟體)二根半製備C18-軟柱(每根25×100mm，NovaPak，6μ)，流速10mL/min；將合併的HSCC餾分8-12部分共120mg，溶於6mLDMSO中；每次注射250μL；在270nm處PDA檢測；於30分鐘內進行線性梯度70％H2O/30％CH3CN至100％CH3CN；然後再用100％CH3CN，洗脫6分鐘；活性物質於19和24分鐘流出。將十次實驗收集得到的活性成分，合併後減壓蒸乾，得到17mg星狀醌C-3(化合物I)和3mg前星狀醌C-3(化合物II)。用PESciexLC-MS型APIIII(離子噴霧型)儀測定質譜，用高分辨(HR-FAB)測精確分子質量。化合物I的質譜分析，得分子離子峰為507(M+H)+，(分子量506)。分子式C32H31N2O4(M++H)507.2289；測定值為507.2291。用BruckerDRX-500型儀在500MHz記錄化合物I(溶於CDCl3中)的1HNMR譜。用內標TMS為0ppm，溶劑(CDCl3)為7.26ppm，這些相對值記錄化學位移。化合物I8.18(s，2H)，8.05(s，2H)，7.35-7.10(m，8H)，5.40(m，2H)，3.45(m，4H)，1.81(s，6H)，和1.75ppm(s，6H)。化合物I的13CNMR譜的測定，是在BruckerDRX-500儀在125MHz在溶劑DMSO-d6中進行。按相對於內標TMS為0，溶劑(DMSO-d6)峰39.5ppm，測定化學位移，化合物I138.8，136.6，136.3，128.8，128.2，127.3，122.3，121.8，121.0，120.3，119.5，119.3，112.3，111.8，111.6，105.2，102.2，27.3，26.4和18.5ppm。化合物I的熔點為150-154℃。化合物II的質譜分析，得分子離子峰為439(M+H)+(分子量為438)。化合物II的1HNMR譜，繫於DMSO-d6溶劑中，BruckerDRX-500儀在500MHz上進行測定。以相對於內標TMS為0ppm，溶劑峰2.49ppm(DMSO-d6)，測定化學位移11.35(s，1H)，10.96(s，1H)，10.62(s，1H)，7.48(dJ＝1Hz，1H)，7.39(d，J＝10.0Hz，1H)，7.29(d，J＝10.0Hz，1H)，7.14(d，J＝10Hz，1H)，7.07(t，J＝10.0Hz，1H)，6.99(t，J＝10.0Hz，1H)，6.93(t，J＝10.0Hz，1H)，6.88(t，J＝10.0Hz，1H)，5.26(m，1H)，3.30(m，2H)，1.64(bs，3H)和1.61ppm(bs，3H)。化合物II的13CNMR譜，記載於125MHzBruckerDRX-500儀，溶劑CDCl3。相對於內標TMS為0ppm，溶劑(CDCl3)為77.0ppm，測定其化學位移138.4，138.3，135.7，135.2，127.7，121.6，120.0，119.8，119.6，110.7，110.6，100.5，26.8，25.8和18.0ppm。4.2.2化合物的合成例12，5-二羥基-3，6-雙-〔2-(2-甲基丁-2-烯-4-基)吲哚-3-基〕1，4-苯醌100mg2，5-二乙醯氧基-3，6-二溴-1，4-苯醌或其它易於從市售2，5-二溴-3，6-二羥基-1，4-苯醌製備的合適的保護苯醌，如3，6-二溴-2，5-雙三甲矽氧基-1，4-苯醌；3，6-二溴-2，5-雙-(叔丁基二甲基矽氧基)-1，4-苯醌；2，5-二苄氧基-3，6-二溴-1，4-苯醌；3，6-二溴-2，5-二異丁氧基-1，4-苯醌；2，5-二苄氧基-3，6-二溴-1，4-苯醌或2，5-二乙烯氧基羧氧基-3，6-二溴-1，4-苯醌，和用費歇爾吲哚合成法製備的180mg3-〔2-(2-甲基丁-2-烯-4-基)吲哚混合，溶於10mL無水二甲基甲醯胺或吡啶，或二甲基亞碸之中，用粉末狀碳酸鉀處理，於100℃加熱24小時。將混合物冷後，分配於乙酸乙酯和水中，然後將乙酸乙酯層用鹽水洗滌，用硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮。將粗品以中壓液相色譜純化，流動相為二氯甲烷和甲醇混合溶劑，得25mg2，5-二乙醯氧基-3，6-雙-〔2-(2-甲基丁-2-烯-4-基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌。然後在甲醇中用1N氫氧化鈉水溶液水解2，5-二乙醯氧基-3，6-雙-〔2-(2-甲基丁-2-烯-4-基)吲哚-3-基〕1，4-苯醌。過濾後將上面的混合物酸化，得粗品。用乙醇和水重結晶得標題化合物。其它的前面提到的保護基，可通過常規的脫保護法除去，如稀酸、氟化鉀或鈀(0)配合物或鈀碳用氫氣反應，或由Greene和Wuts介紹的其它方法(Protectivegroupsinorganicsynthesis，JohnWileyandSon，1991)。另一方法是，在類似的條件下，將2，3，5，6-四溴-1，4-苯醌，於100℃，在二甲基甲醯胺或二甲亞碸中，在碳酸鉀和氧化鋁的存在下，與過量的吲哚反應，生成取代的2，5-二溴-3，6-(3-吲哚基)1，4-苯醌，它與鹼，如氫氧化鈉，反應得取代的2，5-二羥基-3，6-(3-吲哚)-1，4-苯醌。(HoerherJ；Schwenner，E.；Franck，B.；LiebigsAnn.Chem，1986，101765-1771)。例22，5-二乙醯氧基-3，6-雙-〔2-(2-甲基丁-2-烯-4-基)吲哚-3-基〕1，4-苯醌按例1方法製備2，5-二乙醯氧基-3，6-雙-〔2-(2-甲基丁-2-烯-4-基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌。例32，5-二乙醯氧基-3，6-雙-〔2-(3-甲基-n-丁基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌在甲醇中，1個大氣壓氫氣，5％鈀碳下，使2，5-二乙醯氧基-3，6-雙-〔2-(2-甲基丁-2-烯-4-基)吲哚-3-基〕1，4-苯醌氫化，生成標題化合物。例42，5-二羥基-3，6-雙-〔2-(3-甲基-n-丁基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌按例1所述方法，將2，5-二乙醯氧基-3，6-雙-〔2-(3-甲基-正丁基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌，經鹼性水解，得標題化合物。按例1至4所述的相似條件，以2，5-二溴-3，6-二羥基-1，4-苯醌，或2，3，5，6-四溴苯醌為原料，製備如下化合物例53，6-二-〔5-(溴)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌例63，6-二-〔2-(乙烯基)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌例72，5-二羥基-3，6-二-〔2-(正丙基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌例83，6-二-〔2-(胺基羰基)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌例92，5-二乙醯基-3，6-二-〔2-(胺基羰基)引哚-3-基〕-1，4-苯醌例103，6-二-〔2-乙烯吲哚-3-基〕-2，5-二苯甲醯氧基-1，4-苯醌例112，5-二羥基-3，6-二-〔2-氰基吲哚-3-基〕-1，4-苯醌例122，5-二羥基-3，6-二-〔4-(甲氧羰基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌例132，5-二羥基-3，6-二-〔5，7-(二甲氧基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌例142，5-二羥基-3，6-二-〔4，7-(二甲氧基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌例152，5-二羥基-3，6-二-〔5-(硝基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌例163，6-二-〔4-(4-氯苯甲醯胺基)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌例173，6-二-〔2-(4-氯苯基)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌例182，5-二羥基-3，6-二-〔2-(4-氟苯基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌例192，5-二羥基-3，6-二-〔4，6-(二甲氧基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌例202，5-二羥基-3，6-二-〔2-(5-羥基-6-甲氧基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌例212，5-二羥基-3，6-二-〔4-(氰基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌例222，5-二羥基-3，6-二-〔5-(4-三氟甲基苯胺基羰基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌例232，5-二羥基-3，6-二-〔2-(4-三氟甲基苯基胺基羰基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌例242，5-二羥基-3，6-二-〔2-(乙基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌例253，6-二-〔2-(5-溴-6-硝基)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌例262，5-二甲氧基-3，6-二-〔2-(2-甲基丁-2-烯-4-基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌將例1中化合物，在二甲基甲醯胺之中用碘甲烷和碳酸鉀進行甲基化，再經純化，得標題化合物。該化合物也可在粉末狀碳酸鉀存在下，在甲醇中，通過加熱2，5-二溴-3，6-二-〔2-(2-甲基丁-2-烯-4-基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌來製備。例272，5-二甲氧基-3，6-二-〔2-(3-甲基-正丁基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌按例3所述條件，將例26化合物經氫化，製備標題化合物。例282，5-二羥基-3，6-二-〔2-(3-甲基-正丁基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌的製備取二甲基甲醯胺(10ml)，加入至一玻璃管中，內含2-(3-甲基正丁基)吲哚(400mg)，四溴代對苯醌(431mg)和碳酸鉀(703mg)，加入磁攪拌子。將混合物於室溫攪拌40小時。用1N鹽酸(100ml)稀釋，將粗品用乙酸乙酯(200ml)提取。將有機層用鹽水(100ml)洗滌，用硫酸鈉乾燥。減壓除去溶劑，通過一短的閃式矽膠過濾，用30％乙酸乙酯/己烷洗脫。減壓除去溶劑，殘留物以閃式色譜(15％乙酸乙酯/己烷)純化，得蘭色結晶固狀的2，5-二溴-3，6-二-〔2-(3-甲基正丁基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌(40mg，7％)。將2N氫氧化鈉(0.251ml)醇溶液，加入至2，5-二溴-3，6-二-〔2-(3-甲基正丁基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌(40mg)的甲醇(1.5ml)攪拌液之中。於室溫攪拌24小時，再用水(50ml)稀釋。將產物用乙酸乙酯(100ml)提取，用鹽水(50ml)洗滌，用硫酸鈉乾燥。減壓除溶劑，得黃色晶體2，5-二甲氧基-3，6-二-〔2-(3-甲基正丁基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌(30mg，90％)。將1N氫氧化鉀水溶液(1ml)，加入至2，5-二甲氧基-3，6-二-〔2-(3-甲基正丁基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌(9mg)的乙醇(2ml)攪拌液之中，於85℃加熱該混合物3.5小時，然後用1N鹽酸(25ml)稀釋。將產物用乙酸乙酯(50ml)提取，用鹽水(25ml)洗滌，再用硫酸鈉乾燥。減壓除去溶劑，得紅棕色晶體2，5-二羥基-3，6-二-〔2-(3-甲基正丁基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌(8mg)。28a)2-(2-甲基-1-丁烯-4-基)吲哚的製備在通氮氣下，將1.6M正丁基鋰在己烷(14.3ml)溶液，用注射器慢慢滴加至含2-甲基吲哚(1g)在乙醚(76ml)的攪拌液之中。然後加入叔丁醇鉀(1.711g)，得一棕黃色混合物。室溫通氮攪拌50分鐘，將混合物冷至-78℃，注射器滴加3-溴代-2-甲基丙烯(1.54ml)，得紅黃色溶液。將反應混合物於-78℃攪拌2小時，再加水(10ml)結束反應。加熱至室溫後，再加入水(150ml)和1N鹽酸(1ml)以中和反應混合物。用乙酸乙酯(250ml)提取混合物，再用鹽水(100ml)洗滌有機層，再用硫酸鈉乾燥。減壓除去溶劑，用閃式色譜(4％乙酸乙酯/己烷)純化粗品殘留物，得蠟狀黃色固體2-(2-甲基-1-丁烯-4-基)吲哚(664mg，47％)。28b)2-(3-甲基-正丁基)吲哚的製備於三口園底燒瓶中在通氮下，放置5％鈀碳催化劑(771mg)。取2-(2-甲基-1-丁烯-4-基)吲哚(671mg)在乙醇(36ml)的混合液，加入到燒瓶之中，抽空後再壓入氫氣兩次。將混合物在氫氣中(1個大氣壓)劇烈攪拌2小時，再通過硅藻土過濾。減壓除去溶劑，將粗品用閃式色譜(3％乙酸乙酯/己烷)純化，得黃色結晶狀固體2-(3-甲基正丁基)吲哚(400mg，59％)。例292，5-二羥基-3，6-二-〔2-(甲基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌的製備參照例28的方法，以2-甲基吲哚為原料製備。例302，5-二羥基-3，6-二-〔2-(乙基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌的製備參照例28方法，用2-乙基吲哚為原料製備。30a)2-乙基吲哚的製備參照例28a)，用碘甲烷作為烷化試劑製備。例313，6-二-〔2-丁基吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌的製備參照例28方法，用2-丁基吲哚為起始吲哚原料製備。31a)2-(1-丁烯-4-基)吲哚的製備參照28a)，用溴乙烯作為烷化劑製備。31b)2-丁基吲哚的製備參照28b)，用2-(1-丁烯-4-基)吲哚為起始原料製備。例323，6-二-〔2-(1-丁烯-4-基)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌的製備參照例28，用2-(1-丁烯-4-基)吲哚為原料製備。例332，5-二羥基-3，6-二-〔2-(4-甲基正戊基)吲哚-3-基〕1，4-苯醌的製備參照例28，用2-(4-甲基正戊基)吲哚為原料製備。33a)2-(2-甲基-2-戊烯-5-基)吲哚的製備參照28a)，用4-溴-2-甲基-2-丁烯作為烷化劑製備33b)2-(4-甲基正戊基)吲哚的製備參照28b)，用2-(2-甲基-2-戊烯-5-基)吲哚作為起始原料製備。例342，5-二羥基-3，6-二-〔2-(2-苯乙基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌的製備參照例28，用2-(2-苯乙基)吲哚為原料製備。34a)2-(2-苯乙基)吲哚的製備參照例28a)，用溴苄作為烷化劑製備。例352，5-二羥基-6-(吲哚-3-基)-3-〔2-(3-甲基正丁基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌的製備該化合物的合成，系在二甲基甲醯胺溶液中，在碳酸鉀的存在下，用2個當量的四溴苯醌，與2-(3-甲基正丁基)引哚反應製備，再按例28方法進行處理與純化。再按上面的相同條件，將所得的單吲哚加成物，與2個當量的吲哚反應，得雙吲哚產物。例363，6-二-(5-羧基-2-乙基吲哚-3-基)-2，5-二羥基-1，4-苯醌的製備參照例28，用5-羧基-2-乙基吲哚為起始吲哚原料製備。36a)5-羧基-2-乙基吲哚的製備該物的合成，系以5-氯-2-甲基吲哚為原料，這一原料可從甲基吲哚製備(見例28a)。所得的氯代吲哚，經轉化成格式試劑後，再暴露於二氧化碳中即完成合成製備。例373，6-二-〔5-羧基-2-(正丙基)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌的合成參照例28，用5-羧基-2-丙基吲哚為原料製備。37a)5-羧基-2-丙基吲哚的製備參照36a)，用碘乙烷為烷化劑製備。例383，6-二-〔5-羧基-2-(3-甲基正丁基)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌的製備參照例28，用5-羧基-2-(3-甲基正丁基)吲哚為起始原料製備。38a)5-羧基-2-(2-甲基-1-丁烯-4-基)吲哚的製備參照36a)，用3-溴-2-甲基丙烯為原料製備。38b)5-羧基-2-(3-甲基正丁基)吲哚的製備參照28b)，用5-羧基-2-(2-甲基-1-丁烯-4-基)吲哚為原料製備。例393，6-二-〔2-(4-羧基-正丁基)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌的製備參照例28，用2-(4羧基正丁基)吲哚為原料。39a)2-(4-羧基-3-丁烯-1-基)吲哚的製備參照28a)，用4-溴-2-丁烯酸為烷化劑製備。39b)2-(4-羧基-正丁基)吲哚的製備參照28b)，用2-(4-羧基-3-丁烯-1-基)吲哚為原料製備。例403-〔5-羧基-2-(3-甲基正丁基)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-6-(吲哚-3-基)-1，4-苯醌的製備參照例35，用5-羧基-2-(3-甲基正丁基)吲哚作為第一步原料合成。例413，6-二-(5-胺基-2-乙基吲哚-3-基)-2，5-二羥基-1，4-苯醌的製備參照例28，用5-胺基-2-乙基吲哚為原料製備。41a)5-胺基-2-乙基吲哚的製備該合成參照引文Yokoyama；Tanaka；Yanane；Kurita；ChemLett；71991；1125-1128中類似的標準硝化方法，用亞硝酸鈉和濃硫酸，對α-乙基吲哚進行硝化製備。用類似於28b)的催化氫化方法，將所得5-硝基-2-乙基引哚還原，得所要合成的胺基化合物。例423，6-二-〔5-胺基-2-(正丙基)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌的製備參照例28，用5-胺基-2-(正丙基)吲哚作為原料製備。42a)5-胺基-2-(正丙基)吲哚的製備參照41a)，用2-正丙基吲哚製備。例433，6-二-〔5-胺基-2-(3-甲基正丁基)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌的製備參照例28，用5-胺基-2-(3-甲基正丁基)引哚為起始吲哚原料製備。43a)5-胺基-2-(3-甲基正丁基)吲哚的製備參照41a)，用2-(3-甲基正丁基)吲哚製備。例442，5-二乙醯氧基-3，6-二-〔2-(3-甲基正丁基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌的製備在吡啶存在下，用乙酐處理2，5-二羥基-3，6-二-〔2-(3-甲基正丁基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌進行合成製備。例453，6-二-〔2-乙基-5-(4-甲苯磺醯胺基)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌的製備參照例28，用2-乙基-5-(4-甲苯磺醯胺)吲哚為起始原料製備。45a)2-乙基-5-(4-甲苯磺醯胺)吲哚的製備在三乙胺的存在下，用對甲苯磺醯氯處理5-胺基-2-乙基吲哚，製備上述化合物。例462，5-二羥基-3，6-二-〔5-(4-甲磺醯胺)-2-(正丙基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌的製備46a)5-(4-甲苯磺醯胺)-2-(正丙基)吲哚的製備參照45a)，用5-胺基-2-丙基吲哚合成。例472，5-二羥基-3，6-二-〔2-(3-甲基正丁基)-5-(4-甲苯磺醯胺)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌的合成參照例28，用2-(3-甲基正丁基)-5-(4-甲苯磺醯胺)吲哚作為起始原料合成。47a)2-(3-甲基-正丁基)-5-(4-甲苯磺醯胺)吲哚的製備參照45a)，用5-胺基-2-(3-甲基正丁基)吲哚進行合成。例482，5-二羥基-3，6-二-〔2-(2-甲基-1-丁烯-4-基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌的製備參照例28，用2-(2-甲基-1-丁烯-4-基)吲哚作為起始吲哚原料進行合成。4.3蛋白酪氨酸激酶/接合蛋白配合物如下面所述，PTK/接合蛋白配合物，是由至少PTK家族蛋白中的成員之一和接合家族蛋白中的成員之一所組成，該配合物可被本發明中的方法和組合物所分解。在標準的生理條件下，該配合物的組分能與一個或多個其它的PTK/接合蛋白配合物組分，形成穩定的，非共價結合的粘附體。更好的是，本發明化合物能抑制PTK/接合蛋白配合物，其中PTK成分是一種表皮生長因子受體(EGF-R)蛋白質酪氨酸激酶分子，或是一種源於血小板的生長因子受體(PDGF-R)蛋白酪氨酸激酶分子，或是一種類胰島素生長因子受體酪氨酸激酶分子(IGF-1R)。細胞內PTK/接合蛋白配合物胞質PTK成分，可包括如Src家族成員，這些分子是Src，yes，fgr，fyn，Lyn，hck，lck和blk；Fes家族成員，如fes和fer；Ab1家族成員，如ab1和arg；以及Jak家族成員，如jak1和jak2。轉膜PTK/接合蛋白配合物的受體PTK成分，包括如FGF受體成員，Sevenless/ROS，胰島素受體，PDGF受體，以及生長因子受體家族中EGF受體。PTK/接合蛋白配合物中接合蛋白的成分，包括一個或多個SH2和/或一個或多個SH3非催化區。在關於PTK成分中已描述過的SH2和SH3區，這些區是接合蛋白的一部分。作為PTK/接合蛋白配合物成分的接合蛋白，包括如p85，c-Crk，SHC，Nck，ISGF3α，胍三磷酸酶活化蛋白(GAP)，以及蛋白GRB亞族成員，如GRB1，GRB-2，GRB-3，GRB-4，GRB-7和GRB-10。4.4與PTK/接合蛋白配合物有關的細胞增殖疾病的治療本發明中的化合物和/或藥用組合物(在下面4.4.2節將詳述)，可用來治療細胞增殖疾病，例如癌症疾病，它涉及能與含SH2和/或SH3家族成員的接合蛋白配合的一種PTK。本發明中的化合物可更好地用於治療涉及PTK/接合蛋白配合物的細胞增殖疾病的治療，其中PTK成分為EGF-R，PDGF-R，MCT或IGF-1R。能用本發明化合物治療的癌症疾病，是與BCR-ABL有關聯的癌(如慢性骨髓和急性淋巴細胞白血病)、神經膠質瘤、惡性膠質瘤、黑瘤、人卵巢腫瘤、人乳腺癌(特別是與HER-2/GRB-7有關的人乳腺癌)，以及人前列腺癌。在下面4.4.1節描述了測定了化合物分解PTK/接合蛋白配合物有效性的試驗方法。在下面4.4.2節描述了病人服用本發明化合物和/或藥用組合物的方法。在這裡所用的「分解(disruption)」一詞，是意味著不僅PTK/接合蛋白配合物成分的物理上的分離，而且也意味著幹擾了PTK/接合物配合體的活性，而不管該配合物在物理上是否仍能形成。這裡所用的「活性」一詞，是指形成該配合物的細胞內信號流的傳導中，PTK/接合蛋白配合物的功能，也就是該配合物作用於或抑制細胞內的信號傳導至細胞的功能。但是本發明中的化合物和首用組合物，不能直接幹擾(如抑制或加強)該蛋白酪氨酸激酶的酶活性。4.4.1幹擾PTK/接合蛋白配合物的試驗許多方法可用來試驗本發明化合物分解PTK/接合蛋白配合物的能力。如，可在試管內試驗配合物的形成，首先將該配合物中的一個成分或其功能部分，固定於一個固體載體上。第二步，將固定化的配合物成分，暴露於一個上述結構確定的化合物以及本配合物的第二個成分或其功能部分。第三步，可以測定在化合物的存在下，第二個成分是否能與固定化成分形成配合物。此外，可利用本領域所熟知的共免疫沉澱技術，試驗試管內配合物的形成。簡單地說，將一個能形成該PTK/接合配合物的細胞株，暴露於本發明中一個或多個化合物，從該暴露的細胞株中製備細胞溶胞產物。拮抗該配合物成分之一的抗體，可加入至細胞溶胞產物中，進行標準免疫沉澱技術試驗。在仍形成配合物的情況下，該技術能使配合物沉澱，而在配合物已被分解時，僅抗體拮抗的配合物成分將產生沉澱。可直接測試本發明中的化合物對於PTK/接合蛋白轉化能力的作用。例如，一個或多個本發明化合物，可加入至能形成PTK/接合配合物的細胞，如成纖維細胞或造血細胞之中，這些細胞在沒有本發明配合物的存在時，能導致細胞的轉化。(Muller，A.J.等，1991，Mol.Cell.Biol111785-1792；McLaughlin，J等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA846558-6562)。然後在試管中測定細胞的轉化態，例如通過控制瓊脂中菌落形成的能力來測定。(Lugo和Witte，1989，Mol.Cell.Biol.91263-1270；Gishizky，M.L.和Witte，O.N.，1992，Science256836-839)。另一種方法是，通過測定免疫缺陷裸鼠或嚴重配合免疫缺陷(SCID)小鼠形成腫瘤的能力，來控制體內細胞的轉化態(Sawyers，C.L.等，1992，Blood792089-2098)。此外，也可測定本發明化合物抑制各種腫瘤細胞株的能力，如黑瘤、前列腺、肺和哺乳類腫瘤細胞株等異種SC移植細胞株。4.4.2藥用組合物與給藥方法上述5.1節所述的本發明化合物，可給病人以治療有效劑量服用，以治療或改善涉及PTK/接合蛋白相互作用的細胞增殖疾病。治療劑量係指化合物足以產生改善細胞增殖疾病症狀的量。在下面5.4.2.1節中將描述測定本發明化合物用於治療細胞增殖疾病有效劑量的方法。在下面5.4.2.2節將進一步描述本發明化合物的配方和藥用組合物的方法，以及這些化合物，配方和組合物的服用方法。4.4.2.1有效劑量本發明中化合物的毒性和有效治療量的確定，可通過細胞培養或實驗動物中標準的藥物學法，測定其LD50(50％群體的致死量)和ED50(50％群體的治療有效量)。毒性與治療有效性的劑量之比是治療指數，它也表示為LD50/ED50。顯示出大的治療指數的化合物是優選的。而那些所顯示毒副反應的化合物在應用時，須小心設計釋放系統，使這類化合物直接到達作用的組織部位，以降低對未感細胞可能的危害，由此降低了副反應。從細胞培養以及動物實驗中所獲得的數據，可用來設計人用的劑量範圍。這類化合物的劑量最好是無毒的包括了ED50的濃度範圍。這個劑量可以在依使用的劑量和給藥途徑而定劑量範圍之內變化。本發明的方法中任一化合物，其治療有效劑量，最初可從細胞培養試驗中估計。必須設計動物模型中的劑量，以達到包括了在細胞培養中所測的IC50值(即達到症狀最大抑制的一半時受試化合物的濃度)在內的血循環濃度範圍。這一信息可用來更為精確地測定人用劑量。例如可用高效液相色譜測定血漿水平。可個體地調整劑量以及服藥間隔，以保證活性成分的血漿水平，使得藥物能充分維持對接合蛋白/蛋白酪氨酸激酶相互作用的抑制，或維持最低有效濃度(MEC)。每個化合物的MEC可以不同，但應用體外數據來估算，例如用這裡描述的試驗而得的相互作用數據。MEC劑量的獲得，依賴於個體特點和給藥途徑。但是，可用HPLC試驗或生物實驗來測定血漿濃度。用MEC值可以測定劑量間隔。應間隔服用化合物以維持血漿水平於10至90％時間內高於MEC，優選30-90％，而更為優選的是50-90％。4.4.2.2配方與給藥正如上面所討論的，接合蛋白屬細胞內蛋白。因此不管PTK是轉膜或者是細胞內的類型，PTK/接合蛋白的相互作用都是細胞內的。由此，本發明化合物作用於細胞內幹擾PTK/接合配合物的形成和/或活性。正如本節所討論的，對於作用於細胞內的本發明化合物的給藥，有許多本領域所熟知的方法。按本發明化合物而使用的藥物組合物，可用一個或多個生理上可接受的載體或賦形劑，按常規的方式製成配方這樣化合物和其生理可接受的鹽與溶劑，可製成配方給藥，包括吸入(通過口或鼻)，或經口，口腔，非胃腸系統或直腸給藥。對於口服，其藥用組合物可採用如片劑或膠囊劑的形式，其製備可按常規方式加入藥用賦形劑，如粘合劑(預膠化玉米澱粉，聚乙烯吡咯烷酮，或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(即乳糖，微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(即硬脂酸鎂，滑石或矽膠)；崩解劑(如馬鈴薯澱粉或乙二醇澱粉鈉)；或潤溼劑(如月桂酸硫酸鈉)。也可按本領域所熟知的方法將片劑包膜。口服液體製劑，可採用如溶液劑，糖漿或懸浮劑，或者它們以幹品製劑使用，使用前加水或其它合適的溶劑。該液體製劑可按常規方法添加藥用添加劑使用，如懸浮劑(如山梨醇糖漿，纖維素衍生物或氫化可食用的脂肪)；乳化劑(如杏仁油、油脂、乙醇或分餾植物油)；以及防腐劑(如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯，或山梨酸)。該製劑亦可含緩衝鹽，增香劑，增色劑和甜味劑。口服製劑也可製成含活性物質的緩釋配方。對於口腔給藥，可按常規方式將組合物製成片劑或錠劑配方。對於吸入給藥，本發明所用的化合物，可常規地製成氣霧劑，用加壓容器或噴霧器，並使用一種合適的驅動劑，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體。在使用加壓氣霧劑時，可用一閥釋放定量藥物，以確定釋放的劑量單元。吸入劑中所使用的膠囊或軟膠囊，可製成含化合物的粉狀混合物和一種合適的粉狀基質如乳糖或澱粉的配方。可通過注射，如大量或連續注射的非胃腸道給藥方式，將化合物製成配方。注射配方系以單位劑量形式，例如安瓿或多個單劑量的容器，並加入防腐劑。組合物可製成懸浮液，溶液或以油或水狀的乳劑，並含有如懸浮劑，穩定劑和/或分散劑等配方。另外，活性成分可以粉末狀形式，並添加合適溶劑所構成，如可在使用之前加入滅菌的無熱源的水。化合物也可製成直腸用組合物配方，如栓劑或灌腸保留劑，並含有通常用的栓劑基質如可可油或其它甘油酯。除了上述的配方之外，化合物也可製成倉儲形(depot)製劑配方。這種長效製劑可通過埋植(如皮下或肌內)或肌肉內注射給藥。例如，該化合物配方可採用合適的高分子或疏水材料(如可用的乳劑)，或離子交換樹脂，或難溶衍生物，如難溶鹽製成配方。組合物可按需要製成含活性成分的一個或多個劑量形式，包裝或分散於容器之中。可用金屬或塑料箔包裝，如製成泡沫狀包裝。包裝或分散容器上應附有使用說明。5.例化合物對EGF受體/GRB-2SH2區相互作用的抑制本節中所舉例證明，化合物I能有效抑制酪氨酸磷酸化EGF-受體對GRB-2SH2蛋白區的結合作用。5.1材料與方法接合體-GST融合蛋白這裡所用的接合體-GST(穀胱甘肽-S-轉化酶)融合蛋白，系通過GRB-2/pGEX結構轉化的E.coli表達而製備。融合蛋白的GRB-2部分，僅由GRB-2蛋白中的SH2區所組成。轉化細胞生長於Luria培養基中，並加入青黴素。當達到光密度(OD)為600nm，0.3時，將細胞用異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖(IPTG)誘導6小時，以表達融合蛋白。6小時表達期過後，將細胞沉澱，於4℃微球化10,000×g共10分鐘，洗滌，並再懸浮於磷酸緩衝液鹽水(PBS)中。然後將細胞超聲溶解(6次振蕩，每次5秒鐘)。於4℃將不溶物離心10,000×g共10分鐘除去，將上清液過穀胱甘肽-瓊脂糖凝膠柱。用遞減穀胱甘肽5mM溶液洗脫柱中結合的GRB-2-GST融合蛋白，然後再用PBS透析。固定化的EGF-R酪氨酸激酶分子上皮生長因子受體酪氨酸激酶(EGF-R)。從過於表達EGF-R的細胞，特別是A431(ATCCCRL1551)細胞株分離EGF-R。將細胞溶於HNTG緩衝液中(20mMHepes/HCl，pH7.4，150mMNaCl，1.0％TritonX-100，5％甘油，1mM苯甲磺醯氟(PMSF)，1mg/Laprotonin，1mg/LLeupeptin，10mg/L苯甲脒)。如下所述，通過固定於微形板上將細胞溶解物中EGF-R蛋白分離出來。再將EGF-R逐漸在試管內磷酸化，如下所闡述的。將EGF-R固定化於微滴板上。微滴板的製備是，於40℃將板覆蓋一層直接抗細胞內EGFR區(UBI，#05-101)的抗EGF-R單克隆抗體，濃度為每個微板坑0.5μg(在PBS中)，最終體積為每個板坑150μl，放過夜。經覆蓋過夜後，從微滴板坑中除去覆蓋液，加入阻斷緩衝液(5％幹奶的PBS溶液)室溫30分鐘取而代之，然後再除去阻斷緩衝液，用TBST緩衝液洗滌坑5次以除去未結合的EGF-R。大約每個坑中結合了50至100ngEGF-R蛋白質。利用如這裡所使用的A431細胞株等能大量表達EGF-R的細胞株是很重要的，它能顯示出高的內源性磷酸酶活性。這是因為在用固定化抗體的溶解和孵育期間，磷酸化酶從EGF-R分子中除去了磷酸基團，這樣就阻擋了內源性接合蛋白，如GRB蛋白，與EGFR的結合，這可能導致人為的結果。另外，如果所用的細胞株易於飢餓，那麼在溶解之前可採用飢餓法。自磷酸化EGF-R的製備下面的試管內激酶反應，得到自磷酸化EGF-R。激酶反應開始是加入15μlATP/Mn2+混合物(在50mMMnCl2中，最終濃度為10μMATP，總體積為150μl)。將板於室溫孵育5分鐘，振搖，吸出上清液，然後再用TBST洗滌板5次。試驗步驟在化合物I的存在下，於室溫30分鐘內將30ngGRB-2-GST融合蛋白(即EGF-RGRB-2蛋白為1∶1)或5ngGRB-2-GST融合蛋白(即EGF-RGRB-2蛋白之比為4∶1)，加入到含孵育緩衝液(0.1M磷酸鉀緩衝液，pH6.5)的經磷酸化EGFR包覆的微滴坑中。對照坑系在不存在化合物I時，與GRB-2-GST融合蛋白孵育。孵育後，將坑用TBST徹底洗滌。將結合於固定化EGF-R上的GRB-2-GST融合蛋白的量，以抗融合蛋白GST-區的純化抗兔血清(AMRAD，NewVictoria，澳大利亞；目錄號0001605)進行測定。於室溫孵育30分鐘。孵育後，除去抗體，用TBST徹底洗滌坑。為了便於觀察，再將坑用TAGO山羊抗兔過氧化酶抗體孵育，室溫30分鐘。孵育後，除去抗體，先用自來水，再用TBST洗滌坑。將底物溶液，即ABTS(2，2′-連氮基雙(3-乙基苄噻唑啉磺酸)/H2O2(1.2μlH2O2加至10mlABTS中)，加入到坑中，於室溫孵育20分鐘。加入5NH2SO4停止反應。對每個坑測定410nm處的O.D.值。利用這一技術，通常可測定低至相對於背景空白的2ngGRB-2-GST。另外，在EGF-R坑中的受試物質和GRB-2-GST融合蛋白孵育之後，可利用生物素衍生化的單克隆抗體，如EL-6或EL-12，試驗融合蛋白的結合能力。通過抗體在GRB-2上SH2區的分布識別其抗原決定簇，但它不幹擾GRB-2與磷酸化EGFR的結合。利用鏈球菌親和素-生物素化馬(horseradish)過氧化酶反應物，測定這些抗體的結合力。此外，在EGF-R坑中的受試物質和GRB-2-GST融合蛋白孵育之後，可在孵育緩衝液中，通過用1mM1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)和1.54mg/ml遞減穀胱甘肽孵育，測試融合蛋白對固定化EGFR的結合力。然後測定340nm處O.D.值，該反應在O.D.高達1.0時仍為線性，並按照Mannervik和Danielson所描述的方法(Mannervik，B.和Danielson，U.H.，1988，CRCCriticalReviewsinBiochemistry23238)，加入競爭性GST抑制劑來終止反應。5.2結果按照上述5.1節所述方法，測試化合物對於酪氨酸磷酸化EGF受體與GRB-2接合蛋白中SH2肽區結合的抑制能力。化合物I被證明是GRB-2/SH2結合的強抑制劑，其IC50值是2.9μM。(這裡所用的IC50值，係指當無受試化合物存在時GRB-2/SH2結合量被受試化合物抑制一半時，該化合物的濃度)。6.化合物對bcr/ab1活性的抑制這裡所提出的例子證明，本發明化合物能抑制bcr/ab1轉化細胞株的存活。6.1材料與方法(1)試驗所用細胞株是32Dcl.3從屬IL-3的鼠胚樣細胞。32Dcl.3J2/Leuk與IL-3無關的，表達raf和myc的32Dcl.3。32Dbcr/ab1與IL-3無關的，混合的，大量表達bcr/ab1激酶32D。(2)上述細胞株均生長於37℃，5％CO2的孵育箱中。其生長條件是32Dcl.3RPM1加10％FBS加1ng/mlIL-3加2mM穀氨醯胺。32Dcl.3J2/leukRPM1加10％FBS加2mM穀氨醯胺。32Dbcr/ab1RPM1加10％FBS加2mM穀氨醯胺。IL-3鼠白介素-3(LIBI目錄號01-374)(3)PBS(Dulbecco磷酸鹽緩衝液)，Gibco目錄號450-1300EB(4)MTT(溴化3-〔4，5-二甲基噻唑-2-基〕-2，5-二苯基四唑；噻唑蘭)，Sigma目錄號M-2128。工作溶液5mg/mlPBS，於4℃暗處貯藏。(5)增溶緩衝液SDS電泳級，Fisher目錄號BP166。二甲基甲醯胺(DMF)，Fisher目錄號BP1160。冰乙酸，Fisher目錄號A38。工作溶液將200gSDS溶於250ml溫水和500mlDMF中，低熱下攪拌。當SDS幾乎全溶後，加入25ml80％乙酸和25ml1NHCl至溶液中。將體積調至1000ml。6.2步驟如果不特別指明，下面每步反應物在室溫下進行。6.2.1細胞接種(1)細胞生長於組織培養皿(10cm，Corning25020-100)至約1×106細胞/ml，每三天亞培養1∶10(對32Dbcr/ab1株為1∶20)。(2)按標準步驟，用錐蟲蘭計數活細胞。(3)將細胞再懸浮於新鮮基質中，密度為2×105細胞/ml，將細胞再轉移到96坑的組織培養板上(Corning，25806-96)，每個抗50μl，含約2×104個細胞。每個細胞株均含自身正負對照(負對照僅為基質)置於板上。32Dcl.3種子基應含IL-32ng/ml。6.2.2試驗步驟(1)將化合物I藥物儲液(10mM的DMSO中)稀釋至1∶50，組織培養板中的每個細胞株在其8個坑中均按1∶2進行連續稀釋。對照坑中僅含基質。細胞和藥物於37°，在5％CO2中孵育15小時。(2)將15μlMTT加至每個坑中。將板於37℃孵育4小時。(3)4小時後，將100μl增溶液加至每個坑中。(4)將板用鋁箔覆蓋，置於ELISA振搖器中，於室溫振蕩過夜，以使甲晶體溶解完全。(5)用DynatechELISA，MR500型板計數器，記錄570nm處波長的吸收，參考波長為630nm。6.3結果測試化合物I影響bcr/ab1活性的能力，發現其是一個bcr/ab1功能的抑制劑。用上述6.1節所述細胞生長試驗，測試化合物I對bcr/ab1功能的影響。簡化起見，本試驗採用三種細胞株。首先，使用依賴IL-3的細胞株(32Dcl.3)它需要在IL-3細胞質的存在下生存。另外使用了不依賴於IL-3的細胞株，包括32Dcl.3J2/leuk，它由raf和myc轉型的32Dcl.3細胞株組成；和包括32Dbcr/ab1，它由bcr/ab1轉型的32Dcl.3細胞株所組成。後二細胞株由於其被轉型的基因序列而產生具有活性的產物，它們是不依賴於IL-3的，如果產物無活性，細胞又不暴露於IL-3，那麼細胞就不能存活。例如，如果在32Dcl.3bcr/ab1細胞株中bcr/ab1失活，那麼細胞在無IL-3時，就將不會存活。化合物I能抑制無IL-3存在時，32Dcl.3bcr/ab1細胞株的存活能力。由於該細胞株相當強壯，這一結果很有意義。7.例化合物I對細胞增殖的抑制該例證明本發明化合物I是細胞增殖的強抑制劑。7.1材料與方法硫氰酸胺B(SRB)生長試驗試驗1MCF-7SRB生長試驗在常用的含10％FBS/RPMI並添加2mM穀氨酸的生長基質中，將MCF-7(ATCC#HTB22)細胞(H+B22)接種於96個坑的平底板中，每個坑含200個細胞。將細胞經每孔用等體積的化合物稀釋使每坑總體積為200μl後，於37℃孵育24小時。將化合物按其所需最高濃度的2倍製備，並在96坑的園底板上連續稀釋於常用生長基質中，再轉至含細胞的板上，用DMSO作為溶媒對照，加入量為達總濃度的0.2％。在含5％CO2的加溼孵育箱中，將細胞於37℃孵育。加入化合物4天後，棄去基質，按每坑200μl加入冰冷的10％TCA(三氯乙酸)以固定細胞。4℃，60分鐘後，棄去TCA，將板用水漂洗5次。將板經空氣中乾燥，於室溫將0.4％SRB(硫氰酸胺B，購於Sigma)20在1％乙酸的溶液按每坑100μl加入使細胞染色10分鐘。棄去SRB，用1％乙酸漂洗板5次。當板完全乾燥後，按每坑100μl加入10mMTris鹼，以溶解染料。5至10分鐘後，於570和630nm的雙波長DynatechELISA板計數器上記錄板的情況。試驗2PDGF-R/SRB粘附細胞生長試驗用Skehan等，1990，J.Natl.CancerInst.821107-1112所述的量熱試驗，測試化合物對固定依賴性腫瘤細胞生長的抑制作用。用硫氰酸胺B(SRB，購自Sigma)染料的相反離子的結合作用，測定酸固定化細胞中的蛋白質含量。將化合物溶於DMSO(Sigma，細胞培養級)中，並按最終試驗濃度的二倍稀釋於合適的生長基質之中。在試驗中使用C6細胞(CCL107)，將化合物(100μl)加入至含連有細胞單層(100μl坑中含2000個細胞)的96坑板中。C6(ATCC#CCL107)細胞置於Ham’sF10中，並添加5％胎牛血清(FBS)和2mM穀氨酸(GLN)。4天後(37℃，5％CO2)，該單細胞層用PBS洗三次，用冰冷的10％TCA200μl固定(FisherScientific)，並於4℃放置60分鐘。除去TCA，用自來水洗滌固定單層5次，置於吸水紙上使其室溫乾燥完全。將細胞蛋白質用100μl0.4％SRB溶於1％乙酸的溶液，固定10分鐘。用自來水洗滌5次，將染料溶解於10mMTris鹼(每坑100μl)中，在MR5000型Dynatech板計讀器上記錄570nm處吸收。生長抑制數據可表示為，僅以0.4％DMSO處理的對照坑吸收度的百分數。在常規生長基中，DMSO對照與細胞生長組沒有區別。用四參數曲線法測定IC50值。對於固定依賴性腫瘤生長試驗，系將細胞(每皿3000至5000)在加或不加入化合物時，懸浮於含0.4％瓊脂糖的試驗介質中(含10％FCS的DMEM)，再鋪於35mm的皿中，該皿預先覆蓋了一層固定化瓊脂糖基質(含0.8％瓊脂糖)。於37℃孵育2至3周後，用Omnicon3800腫瘤菌落計數儀測量大於50μm的菌落。試驗3MCF-7/HER-2B生長試驗。這裡所用的方法基本上類似於上述方法(MCF-7生長試驗)，區別是在加入化合物I之前，立即將正常的生長基除去，並將添加了2mM穀氨酸的5％FBS/RPMI加入至細胞之中。也可在0.5％血清介質中製備化合物溶液。將板上的細胞孵育4天，並按標準的技術方法進行實驗。試驗4A431/SRB生長試驗。基本上按照上述MCF-7/HER2B生長試驗，進行A431(ATCC#CRL1555)細胞試驗。7.2結果利用上述7.1節SRB方法，用多種細胞株與化合物相接觸，測定化合物I對細胞增殖的作用。正如下面所述，對於受試的四種細胞株的每一種細胞株，化合物I都被證明是細胞增殖的強抑制劑。細胞株化合物I的IC50值(MM)C68A4317.5MCF710MCF-7-HER26這裡所用的IC50值，代表抑制未與受試化合物(這裡指化合物I)相接觸的細胞株細胞增殖的50％時，受試化合物的濃度。因此，本節結果證明化合物I顯示出對細胞增殖的抑制作用。加上上述5節中的舉例，這些結果證明化合物I對蛋白酪氨酸激酶受體EGFR的SH2區與接合蛋白的結合具有抑制作用，表明化合物I能作為細胞生長的抑制劑，起到阻斷接合蛋白與其配對體(例如蛋白質酪氨酸激酶分子)的相互作用的作用。化合物I的活性，表明它是一個抗細胞增殖劑。8.例3T3細胞增殖抑制試驗下面的方法描述了，在大量表達EGFr，IGF1r或PDGFr產生3T3的細胞株上，用來測定化合物抑制細胞增殖的能力的步驟。8.1材料與試劑(1)EGF配基儲存濃度為16.5μM；EGF201，系購自TOYOBO，Co.，Ltd.Japan。(2)IGF1配基人，重組；G511，PromegaCorp，USA產。(3)PDGF配基人PDGFB/B；1276-956，BoehringerMannheim，德國產。(4)SRB硫氰酸胺B；S-9012，SigmaChemicalCo，USA。SRB染料溶液0.4％SRB在1％冰乙酸中。(5)冰乙酸A38-212，FisherScientific，USA，(6)小牛白蛋白fractionV粉末；A-8551，SigmaChemicalCo.，USA。(7)TCA緩衝液10％三氯乙酸(A32-500，FisherScientific，USA)。(8)Tris鹼緩衝液10mMtris鹼(BP152-5，FisherScientific，USA)。8.2方法(1)產N-1H3T3(ATCC#1658)的脾細胞3T3-EGFr，3T3-IGF1r，3T3-PDGFr。(2)在一個含96坑的板中，按每坑8000個細胞，將細胞接種於10％FBS加2mMGLNDMEM中。於37℃5％CO2將細胞孵育過夜，以使細胞連接於板上。(3)第二天，將細胞靜置於無血清基質(0％FBSDMEM)24小時。(4)第三天，將細胞用配基(EGF為5nM，IGF1為20nM或PDGF為100ng/ml)和藥物同時處理。在無血清的DMEM和0.1％小牛白蛋白中製備配基溶液。負對照細胞組僅加入不含血清的DMEM與0.1％牛白蛋白；正對照細胞組加入不含藥物的配基(EGF，IGF1或PDGF)。在含無血清DMEM的96坑板內製備藥物溶液，並進行連接稀釋。將稀釋的藥物每坑取10μl，加入至細胞中。每坑總體積是200μl。對每個藥物，取一式四份(坑數)和11個濃度點。(5)第四天，將配基(EGF，IGF1或PDGF)再加至細胞之中，按前述同樣濃度製備細胞內最終配基的濃度。(6)第五天，用PBS洗滌細胞，並在0-5℃條件下用冰冷的10％TCA，按每坑200μl量加入以固定細胞，共1小時。(7)除去TCA，用去離子水漂洗5次。用紙巾上下右左使板乾燥。按每坑100μl加入0.4％SRB使細胞染色10分鐘。(8)傾去SRB，用1％乙酸漂洗板5次。使板充分乾燥。(9)在振蕩器中，按每坑100μl加入10mMTris鹼，使染料溶解10分鐘。(10)在570nm和630nm雙波長DynatechElsia板計讀器上，記錄板的情況。8.3試驗步驟(1)在第一個坑內RPMI介質中，按1∶50稀釋藥物儲液(10mMDMSO溶液)，然後在組織培養板上每8個點進行1∶2稀釋。將每坑中50μl的該溶液，轉至細胞中。對照細胞組僅加入基質。用藥物於37℃，5％CO2中孵育細胞共15小時。(2)每坑加入15μlMTT。於37℃孵育板4小時。(3)4小時後，每坑加入100μl增溶溶液。(4)用鋁箔覆於板上，令板置ELISA板振蕩器上，室溫振蕩過夜，以使甲結晶完全溶解。(5)用MR500型DynatechELISA板計讀器，於570nm波長記錄吸收情況，參考波長為630nm。顯然，這裡對本發明提出了許多改良與變更，但未超過本發明的範圍與實質。上面僅以舉例形式描述了一些特定的具體情況，本發明僅由附於後面的權利要求書的條款所限定。權利要求1.一種適合於人服用的藥物組合物，它包括如下式所示的化合物或該化合物的一種藥用的鹽；以及一種藥用載體2.一種適合於人服用的藥物組合物，它包括如下式所示的化合物或該化合物的一種藥用的鹽；以及一種藥用載體3.一種改善細胞增殖疾病症狀的方法，其中細胞增殖疾病涉及一種蛋白酪氨酸激酶多肽/接合多肽配合物，使用足量的能干擾細胞內蛋白酪氨酸激酶多肽/接合多肽配合物的化合物，以使細胞增殖疾病的症狀得以改善；其中所述的化合物如下列兩個化學式所示4.權利要求3中的方法，其中細胞增殖疾病發生於哺乳動物，該化合物與哺乳動物細胞相接觸，使得哺乳動物上細胞增殖疾病的症狀得到改善。5.權利要求3中的方法，其中細胞增殖疾病是一種與BCR-ABL相關的腫瘤，一種神經膠質瘤，一種惡性膠質瘤、黑瘤、卵巢瘤、乳腺瘤或一種前列腺瘤。6.一種改善細胞增殖疾病症狀的方法，其中細胞增殖疾病涉及蛋白質酪氨酸激酶多肽/接合多肽配合物，該方法包括將能形成蛋白酪氨酸激酶多肽/接合多肽配合物的細胞，與能干擾細胞內蛋白質酪氨酸激酶多肽/接合多肽配合物的足量的權利要求1或2中藥用組合物相接觸，使得細胞增殖疾病的症狀得以改善。7.一種如下式所示的化合物或其藥用的鹽，其中R1和R2分別獨立代表氫、低級烷基、乙醯基、芳基、烷基芳基或高級烷酸酯，並且至少R1和R2之一不是氫；R3至R12分別獨立代表氫、烷基、烷基羧基、烯烴基、烯烴基羧基、芳基、烷基芳基、OH基、烷氧基、硝基、滷素、三滷甲基、醯胺基、羰醯胺基、羧基、碸基、磺醯胺、胺基、巰基或2-甲基丁-2-烯-4-基；其中至少R11和R12之一代表2-甲基丁-2-烯-4-基。8.一種如下式所示的化合物或其藥用鹽，其中R1和R2均各自獨立地代表氫；R3至R10分別獨立代表氫、烷基、烷基羧基、烯烴基、烯烴羧基、芳基、烷烴芳基、OH基、烷氧基、硝基、滷素、三滷甲基、醯胺、羰醯胺、羧基、碸基、磺醯胺、胺基、巰基或2-甲基丁-2-烯-4基；以及R11和R12分別獨立代表氫或2-甲基丁-2-烯-4-基，其中至少R11和R12之一為2-甲基丁-2-烯-4-基；其中至少R3至R10之一不是氫。9.一種如下式所示的化合物或其藥用鹽其中R1和R2分別獨立代表芳基、烷基芳基和高級烷酸酯；以及R3至R12分別獨立代表氫、烷基、烷基羧基、烯烴基、烯烴羧基、芳基、烷烴芳基、OH基、烷氧基、硝基、氟、氯、碘、三滷甲基、醯胺、羰醯胺、羧基、碸基、磺醯胺、胺基或巰基。10.一種如下式所示的化合物或其藥用鹽，其中R1、R2、R11和R12代表氫；以及R3至R10分別代表氫、烷基、烷基羧基、烯烴基、烯烴基羧基、芳基、烷基芳基、烷氧基、羥基、硝基、滷素、三滷甲基、醯胺基、羰醯胺基、羧基、碸基、磺醯胺基、胺基或巰基，其中R3至R10之一至少不是氫；(a)當R4至R10分別代表氫時，R3不可代表2-甲基丁-2-烯-4-基或2-羥基-2-甲基丁-4-基；(b)當R4至R6和R8至R10分別代表氫時，R3和R7不可同時代表2-甲基丁-2-烯-4-基；(c)當R3至R4，R6至R8和R10代表氫時，R5和R9不可同時代表2-甲基丁-2-烯-4-基或3-甲基-正丁基；(d)當R3、R5至R7、R9至R10代表氫時，R4和R8不可都代表2-甲基丁-2-烯-4-基或2-甲基丁-1，3-二烯-4-基，以及R4和R8不可代表2-甲基丁-2-烯-4-基和2-甲基丁-1，3-二烯-4-基。11.權利要求10的化合物，其中該化合物具下列通式其中R3至R5和R7至R9代表氫，R6與R10之一或兩者代表2-甲基丁-2-烯-4-基。12.一種如下式所示的化合物或其藥用鹽其中R1和R2之一至少代表乙醯基；R11和R12代表氫；以及R3至R10分別獨立代表氫、烷基、烷基羧基、烯烴基、烯烴基羧基、芳基、烷基芳基、羥基、烷氧基、硝基、滷素、三滷甲基、醯胺、羰醯胺基、羧基、碸基、磺醯胺基、胺基和巰基，其中(a)當R1和R2兩者都代表乙醯基；或當R1和R2之一代表乙醯基，R3至R4，R6至R8和R10至R12代表氫；R5和R9不可同時代表2-甲基丁-2-烯-4-基；(b)當R1和R2兩者都代表乙醯基和R4至R6以及R8至R10都代表氫時，R3和R7不可同時代表2-甲基丁-2-烯-4-基；(c)當R1和R2都代表乙醯基以及當R3、R5至R7以及R9至R10代表氫時，R4和R8不可同時代表2-甲基丁-2-烯-4-基。13.一種如下式所示的化合物或其藥用鹽，其中R1和R2至少之一代表低級烷基；R11和R12代表氫；以及R3至R10分別獨立代表氫、烷基、烷基羧基、烯烴基、烯烴羧基、芳基、烷基芳基、羥基、烷氧基、硝基、滷素、三滷甲基、醯胺、羰醯胺、羧基、碸基、磺醯胺、胺基和巰基，其中(a)當R1和R2兩者都代表甲基時，R3至R10至少之一必須代表除氫之外的基團；(b)當R1和R2都代表甲基，R4至R10代表氫時，R3不可代表2-甲基丁-2-烯-4-基；(c)當R1和R2都代表甲基，R4至R6以及R8至R10代表氫時，R3和R7不可同時代表2-甲基丁-2-烯-4-基。(d)當R1和R2都代表甲基，R3至R4、R6至R8以及R10代表氫時，R5和R9不可同時代表2-甲基丁-2-烯-4-基。14.權利要求10的化合物，其中R4代表2-甲基丁-2-烯-4-基以及R3和R5至R10代表氫，或R5代表2-甲基丁-2-烯-4-基，R3至R4和R6至R10代表氫；或R6代表2-甲基丁-2-烯-4-基以及R3至R5，R7至R10代表氫。15.下列各化合物(a)2，5-二乙醯氧基-3，6-二-〔2-(2-甲基丁-2-烯-4-基)吲哚-3-基〕1，4-苯醌；(b)2，5-二乙醯氧基-3，6-二-〔2-(3-甲基-正丁基)引哚-3-基〕-1，4-苯醌；(c)2，5-二羥基-3，6-二-〔2-(3-甲基-正丁基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌；(d)3，6-二-〔5-(溴)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基1，4-苯醌；(e)3，6-二-〔2-(烯丙基)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌；(f)2，5-二羥基-3，6-二-〔2-(正丙基)吲哚-3-基〕1，4-苯醌；(g)3，6-二-〔2-(胺基羰基)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌；(h)2，5-二乙醯氧基-3，6-二-〔2-(胺基羰基)吲哚3-基〕1，4-苯醌；(i)3，6；-二-〔2-烯丙基吲哚-3-基〕-2，5-二苯甲醯氧基-1，4-苯醌(j)2，5-二羥基-3，6-二-〔2-(氰基)吲哚-3-基〕1，4-苯醌；(k)2，5-二羥基-3，6-二-〔4-(甲氧羰基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌；(l)2，5-二羥基-3，6-二-〔5，7-(二甲氧基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌；(m)2，5-二羥基-3，6-二-〔4，7-(二甲氧基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌；(n)2，5-二羥基-3，6-二-〔5-(硝基)吲哚-3-基〕1，4-苯醌；(o)3，6-二-〔4-(4-氯苯甲醯胺)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌；(p)3，6-二-〔2-(4-氯苯基)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌；(q)2，5-二羥基-3，6-二-〔2-(4-氟苯基)吲哚-3-基〕1，4-苯醌；(r)2，5-二羥基-3，6-二-〔4，6-(二甲氧基)吲哚-3-基〕1，4-苯醌；(s)2，5-二羥基-3，6-二-〔2-(5-羥基-6-甲氧基)吲哚-3-基〕1，4-苯醌；(t)2，5-二羥基-3，6-二-〔4-(氰基)吲哚-3-基〕1，4-苯醌；(u)2，5-二羥基-3，6-二-〔5-(4-三氟甲基苯胺甲醯基)吲哚-3-基〕1，4-苯醌；(v)2，5-二羥基-3，6-二-〔2-(4-三氟甲基苯胺甲醯基)吲哚-3-基〕1，4-苯醌；(w)3，6-二-〔2-(5-溴-6-硝基)-吲哚-3-基〕2，5-二羥基-1，4-苯醌；(x)2，5-二甲氧基-3，6-二-〔2-(2-甲基丁-2-烯-4-基)吲哚-3-基〕1，4-苯醌；(y)2，5-二甲氧基-3，6-二-〔2-(3-甲基-正丁基)吲哚-3-基〕1，4-苯醌。16.下列各化合物(a)2，5-二羥基-3，6-二-〔2-(甲基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌；(b)3，6-二-(2-乙基吲哚-3-基)-2，5-二羥基-1，4-苯醌；(c)3，6-二-(2-丁基吲哚-3-基)-2，5-二羥基-1，4-苯醌；(d)3，6-二-〔2-(1-丁烯-4-基)吲哚-3-基〕2，5-二羥基-1，4-苯醌；(e)2，5-二羥基-3，6-二-〔2-(2-甲基丁-1-烯-4-基)吲哚-3-基〕1，4-苯醌；(f)2，5-二羥基-3，6-二-〔2-(4-甲基-正戊基)吲哚-3-基〕1，4-苯醌；(g)2，5-二羥基-3，6-二-〔2-(2-苯乙基)吲哚-3-基〕1，4-苯醌；(h)3，6-二-〔(5-羧基-2-乙基)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌；(i)3，6-二-〔〔5-羧基-2-(正丙基)〕吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌；(j)3，6-二-〔〔5-羧基-2-(3-甲基-正丁基)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌；(k)3，6-二-〔2-(4-羧基-正丁基)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌；(l)3-〔〔5-羧基-2-(3-甲基正丁基)〕吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-6-(吲哚-3-基)1，4-苯醌；(m)3，6-二-〔(5-胺基-2-乙基)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌；(n)3，6-二-〔〔5-胺基-2-(正丙基)吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌；(o)3，6-二-〔5-胺基-2-(3-甲基正丁基)〕吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌；(p)2，5-二乙醯氧基-3，6-二-〔2-(3-甲基-正丁基)吲哚-3-基〕1，4-苯醌；(q)3，6-二-〔〔2-乙基-5-(4-甲基苯磺醯胺)〕吲哚-3-基〕-2，5-二羥基-1，4-苯醌；(r)2，5-二羥基-3，6-二-〔〔5-(4-甲苯磺醯胺)-2-(正丙基)〕吲哚-3-基〕1，4-苯醌；(s)2，5-二羥基-3，6-二-〔〔2-(3-甲基正丁基)-5-(4-甲基苯磺醯胺)吲哚-3-基〕1，4-苯醌；(t)2，5-二羥基-3，6-二-〔2-(2-甲基戊-2-烯-5-基)吲哚-3-基〕-1，4-苯醌。17.一種如下式所示的化合物或其藥用鹽其中R1和R2分別獨立代表氫、低級烷基、乙醯基、芳基、烷基芳基或高級烷酸酯；R3至R10分別獨立代表氫、烷基、烷基羧基、芳基、烷基芳基、烯烴基、烯烴基羧基、羥基、烷氧基、硝基、滷素、三滷甲基、醯胺、羰醯胺、羧基、碸基、磺醯胺、胺基、巰基、4-甲基苯磺醯胺或2-甲基丁-2-烯-4-基；以及R11和R12系選自氫、甲基、乙基、丙基、丁基、芳基、烷基芳基、烷基羧基、烯烴基羧基、丁-1-烯-4-基、2-甲基丁-1-烯-4-基、4-甲基-正戊基、2-苯乙基、2-甲基戊-2-烯-4-基，以及4-羧基-正丁基，其中R11和R12至少之一不代表氫。18.一種如下式所示的化合物或其藥用鹽，其中R1和R2分別獨立代表氫、低級烷基、乙醯基、芳基、烷基芳基或高級烷酸酯；R3至R10分別獨立代表氫、烷基、烷基羧基、芳基、烷基芳基、烯烴基、烯烴基羧基、羥基、烷氧基、硝基、滷素、三滷甲基、醯胺、羰醯胺、羧基、碸基、磺醯胺、胺基、巰基、4-甲基苯磺醯胺或2-甲基丁-2-烯-4-基；以及R11和R12均代表3-甲基-正丁基。19.一種如下式所示的化合物或其藥用鹽，其中R1和R2分別獨立代表氫、低級烷基、乙醯基、芳基、烷基芳基或高級烷酸酯；R3至R10分別獨立代表氫、烷基、烷基羧基、芳基、烷基芳基、烯烴基、烯烴基羧基、羥基、烷氧基、硝基、滷素、三滷甲基、醯胺、羰醯胺、羧基、碸基、磺醯胺、胺基、巰基、4-甲苯磺醯胺或2-甲基丁-2-烯-4-基，其中R3至R10至少之一不代表氫；以及R11和R12分別獨立代表氫或3-甲基-正丁基。20.一種適於人服用的藥物組合物，包括由權利要求7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19中的化合物；以及藥用載體。21.一種改善細胞增殖疾病的方法，其中細胞增殖疾病涉及一種蛋白酪氨酸激酶多肽/接合多肽配合物，該方法包括將能形成蛋白質酪氨酸激酶多肽/接合多肽配合物的細胞，與能干擾細胞蛋白質酪氨酸激酶多肽/接合多肽配合物的權利要求20中的足夠量的藥物組合物相接觸，使得細胞增殖疾病的症狀得到改善。全文摘要本發明涉及抑制接合蛋白/蛋白酪氨酸激酶相互作用的方法與組合物,其中這些相互作用系與細胞增殖疾病相關聯,涉及能夠同含SH2和/或SH3成員的接合蛋白家族相配合的一種蛋白質酪氨酸激酶。特別地,本發明涉及特殊的化合物,特別是喹唑啉衍生物化合物,以及利用這些化合物的方法。文檔編號A61K31/40GK1192680SQ96196106公開日1998年9月9日申請日期1996年6月5日優先權日1995年6月7日發明者鄧炳初,G·麥馬雄,G·D·哈裡斯申請人:蘇根公司