甘氨酸的測定方法與甘氨酸測定試劑盒--9010的製作方法

2023-09-19 01:37:55 1

專利名稱：甘氨酸的測定方法與甘氨酸測定試劑盒--9010的製作方法
甘氨酸的測定方法與甘氨酸測定試劑盒一9010
技術領域：
本發明涉及食品檢驗測定技術領域，更具體地，本發明涉及甘氨酸測定方法及其 試齊U盒。
背景技術：
甘氨酸為非人體必需胺基酸。甘氨酸有獨特的甜味，能緩和酸、鹼味，掩蓋食品中 添加糖精的苦味並增強甜味。人體若攝入甘氨酸的量過多，不僅不能被人體吸收利用，而且 會打破人體對胺基酸的吸收平衡而影響其它胺基酸的吸收，導致營養失衡而影響健康。甘 氨酸不能被人體利用，只能分解轉化為熱能，這樣會增加肝臟負擔。而分解產物中的含氮化 合物要通過尿液排出體外，又會增加腎臟負擔。如果大量、長期食用這類食品，可能造成肝 腎損傷。部分含乳飲料企業為提高產品中蛋白質含量，在生產加工中違規使用甘氨酸，對青 少年及兒童的正常生長發育很容易帶來不利影響。按照我國《食品添加劑使用衛生標準》GB2760規定，甘氨酸在作為食品添加劑只允 許在調味劑與豆奶中使用，且最高限量為每公斤1克，但在含乳飲料中不允許使用。

發明內容[要解決的技術問題]本發明的目的是提供一種甘氨酸的測定方法。本發明的另一個目的是提供一種甘氨酸測定試劑盒。[技術方案]本發明是通過下述技術方案實現的。本發明的方法是一種採用二倍擴增法、酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)與酶(偶)聯法(Couple Reaction)的聯用技術，利用測定還原型煙 醯胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處的吸光度變化測定甘氨酸的方法。本發明甘氨酸測定方法的的技術原理是根據下述甘氨酸脫氫酶、異檸檬酸裂解 酶、異檸檬酸脫氫酶的系列催化反應完成 甘氨酸+水+輔酶甘氨酸脫氫酶乙酵酸+氨+還原型輔酶琥珀酸+乙酵酸異檸檬 酸裂解酶異檸檬酸異檸檬酸+輔酶異檸檬酸脫氫酶二氧化碳+酮戊二酸+還原型輔酶本發明的方法利用甘氨酸脫氫酶(glycine dehydrogenase ；EC 1.4.1.10) 酶(偶)聯異檸檬酸裂解酶(isocitrate lyase ；EC 4. 1. 3. 1)、異檸檬酸脫氫酶 (isocitratedehydrogenase ；EC 1. 1. 1. 41 ；EC 1. 1. 1. 42)酶促反應終點法。甘氨酸脫氫酶 酶解甘氨酸反應產生乙醛酸，再通過(偶)聯合異檸檬酸裂解酶、異檸檬酸脫氫酶的作用， 最終將輔酶(在MOnm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而 得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，這樣可以通過測量340nm處吸光度上 升的程度，可以測算甘氨酸的濃度大小。
本發明是通過下述技術方案實現的。本發明涉及一種甘氨酸的測定方法。該甘氨酸測定方法的步驟如下A、樣品準備A. 1標準樣品的製備將一定量的甘氨酸溶於水或緩衝液中，再將甘氨酸濃度調整到1毫摩爾/升，得到 的溶液作為標準樣品；A. 2待測樣品的製備待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像製備標準樣品 一樣溶於水或緩衝液中；A. 3空白樣品所述的水或緩衝液作為空白樣品，其甘氨酸濃度為0毫摩爾/升；B、試劑溶液的製備分別移取或稱取緩衝液、穩定劑、輔酶、甘氨酸脫氫酶、異檸檬酸裂解酶、異檸 檬酸脫氫酶、琥珀酸，然後將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度 分別是 20-500mmol/L、0. 001-7mol/L、0. l-5mmol/L、1000-80000U/L、1 000-80000U/L、 1000-80000U/L 與 l-100mmol/L ；C、待測樣品與在步驟B)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在 溫度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制可以不設 副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；D、在與步驟C)同樣的條件下測定步驟A)標準樣品的吸光度隨時間的變化；E、在與步驟C)同樣的條件下測定在步驟A)空白樣品的吸光度隨時間的變化；F、數據處理由步驟C-E)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據下式計算得到
甘氨酸的含量
權利要求
1.一種利用二倍擴增法、酶比色法及酶聯法技術的甘氨酸濃度測定方法，其測定的 技術原理是根據下述甘氨酸脫氫酶、異檸檬酸裂解酶、異檸檬酸脫氫酶的系列催化反應完 成甘氨酸+水+輔酶甘氨酸脫氫酶乙醛酸+氨+還原型輔酶 琥珀酸+乙醛酸異檸檬酸裂解酶異檸檬酸異檸檬酸+輔酶異檸檬酸脫氫酶二氧化碳+酮戊二酸+還原型輔酶
2.一種甘氨酸的測定方法，其特徵在於該方法的步驟如下 2. 1樣品準備·2. 1. 1標準樣品的製備將一定量的甘氨酸溶於水或緩衝液中，再將其濃度調整到1毫摩爾/升； 2. 1.2待測樣品的製備待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像製備標準樣品一樣 溶於水或緩衝液中； 2. 1.3空白樣品所述的水或緩衝液作為空白樣品，其甘氨酸濃度為0毫摩爾/升； 2. 2試劑溶液的製備分別移取或稱取緩衝液、穩定劑、輔酶、甘氨酸脫氫酶、異檸檬酸裂解酶、異檸檬 酸脫氫酶與琥珀酸，然後將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度 分別是 20-500mmol/L、0. 001-7mol/L、0. l-5mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、 1000-80000U/L 與 l-100mmol/L ；·2. 3待測樣品與在步驟2. 2)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫 度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制，可以不設 副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；·2. 4在與步驟2. 3)同樣的條件下測定步驟2. 1. 1)標準樣品的吸光度隨時間的變化； 2. 5在與步驟2. 3)同樣的條件下測定在步驟2. 1. 3)使用的水或緩衝液作為空白溶液 的吸光度隨時間的變化；·2.6數據處理由步驟2. 3-2. 5)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據下式計算得到 甘氨酸的含量
3.根據權利要求1、2所述的測定方法，其特徵在於使用全自動生化分析儀測定時，待 測樣品、所述標準樣品與所述空白樣品由該分析儀在設定條件下自動取樣，然後在下述條 件下進行測定測定方法為終點法，溫度37°C，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測甘氨酸樣品與試劑的體積比例為1/10-1/500，反應方向為正反應，延遲時 間1/0分鐘，檢測時間4/5分鐘。
4.根據權利要求1、2或3所述的測定方法，其特徵在於，所述的穩定劑是一種或多種 選自硫酸銨、氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉、疊氮鈉等防腐劑的穩定劑；所述的 緩衝液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液、咪唑-鹽酸 緩衝液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液、硼砂-鹽酸緩衝液、巴比妥鈉-鹽酸緩衝液、硼酸-硼 砂緩衝液、二乙醇胺緩衝液或「PBS」緩衝液的緩衝液；所述的輔酶是一種或多種選自NADP+、 NAD+ 或 thio-NAD+ 的輔酶。
5.根據權利要求1、2或3所述的測定方法，其特徵在於 5. 1所述的試劑溶液配製成如下單劑試劑它是由所述的緩衝液、穩定劑、輔酶、琥珀酸、甘氨酸脫氫酶、異檸檬酸裂解酶與異檸檬 酸脫氫酶組成的；5. 2所述的試劑溶液配製成如下雙劑試劑試劑1，它是由所述的緩衝液、穩定劑、輔酶、琥珀酸組成的；試劑2，它是由所述的緩衝液、穩定劑、甘氨酸脫氫酶、異檸檬酸裂解酶與異檸檬酸脫氫 酶組成的；其中輔酶、甘氨酸脫氫酶、異檸檬酸裂解酶、異檸檬酸脫氫酶、琥珀酸在試劑1或試劑2 中的位置是不限定的。5.3所述的試劑配製成如下三劑試劑試劑1，它是由所述的緩衝液、穩定劑、輔酶、琥珀酸組成的； 試劑2，它是由所述的緩衝液、穩定劑、異檸檬酸裂解酶與異檸檬酸脫氫酶組成的； 試劑3，它是由所述的緩衝液、穩定劑與甘氨酸脫氫酶組成的； 其中輔酶、甘氨酸脫氫酶、異檸檬酸裂解酶、異檸檬酸脫氫酶、琥珀酸在試劑1、試劑2 或試劑3中的位置是不限定的。
6.一種甘氨酸測定試劑盒，其特徵在於6. 1它由下述粉狀試劑組成，在使用時用水將它們溶解得到具有下述濃度範圍的可直 接使用的液體試劑 緩衝液 穩定劑 輔酶甘氨酸脫氫酶 異檸檬酸裂解酶 異檸檬酸脫氫酶 琥珀酸6. 2根據權利要求6 組成如下的試劑1 緩衝液 穩定劑 輔酶320-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.l-5mmol/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L 1000-80000U/L l-100mmol/Lo .1所述的甘氨酸測定試劑盒，其特徵在於它有20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.l-5mmol/L琥珀酸l-100mmol/L ；組成如下的試劑2 緩衝液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L甘氨酸脫氫酶1000-80000U/L異檸檬酸裂解酶1000-80000U/L異檸檬酸脫氫酶1000-80000U/L。6. 3根據權利要求6. 1所述的甘氨酸測定試劑組成如下的試劑1 緩衝液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L輔酶0.l-5mmol/L琥珀酸l-100mmol/L ；組成如下的試劑2 緩衝液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L異檸檬酸裂解酶1000-80000U/L異檸檬酸脫氫酶 1000-80000U/L ；組成如下的試劑3 緩衝液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L甘氨酸脫氫酶1000-80000U/L。
全文摘要
本發明涉及利用二倍擴增法、酶比色法及酶聯法技術的甘氨酸含量的測定方法、試劑的組成及成分，其測定的技術原理是依據甘氨酸脫氫酶、異檸檬酸裂解酶、異檸檬酸脫氫酶的系列催化反應完成，本發明還涉及一種甘氨酸測定試劑盒。本發明的測定方法靈敏度高、誤差小，因此本發明的測定方法與試劑盒可以廣泛地應用於食品檢驗。
文檔編號G01N33/68GK102087291SQ20091023195
公開日2011年6月8日 申請日期2009年12月4日 優先權日2009年12月4日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司