異甘草素在製備預防和/或治療心腦血管疾病藥物中的應用的製作方法

2023-09-19 02:26:20

專利名稱：異甘草素在製備預防和/或治療心腦血管疾病藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及異甘草素在製備預防和/或治療心腦血管疾病藥物中的應用。
背景技術：
異甘草素(isoliquiritigenin)是從甘草屬植物分離、純化的異黃酮類化合物， 其化學名稱為(E)-l-(2，4-二羥基苯基)-3-(4-羥基苯基)-2-丙烯-1-酮。異甘草素有著很強的生物活性，具有抗菌、抗病毒、抗感染、抗腫瘤、抑制脂質過氧化等多種藥理作用， 備受廣大學者的青睞。長期以來，心腦血管疾病是一種嚴重威脅人類，特別是在中老年人中發生的常見病，心腦血管疾病已成為人類死亡病因最高的頭號殺手，也是影響人們健康的「無聲兇煞」。 現代醫學科學研究證實，目前嚴重危害人類健康的心腦血管病發生主要來自血管內膜增生、血管內皮功能障礙、血管痙攣等，從而使心腦供血不足，甚至供血中斷引發心腦血管病。 而對於心腦血管的疾病發生，血管病變、血管痙攣是最為直接的因素。因此，增加藥物的舒血管活性對於此類疾病的預防治療具有直接的影響。

發明內容
本發明的目的是提供異甘草素的新用途。本發明所提供的異甘草素的新用途一方面是其在製備預防和/或治療心腦血管疾病藥物中的應用；另一方面是其在製備血管舒張藥物中的應用。上述預防和/或治療心腦血管疾病的藥物以及血管舒張藥物可以直接口服或者注射，或者與藥學上可接受的載體輔料混合在一起製成多用藥用劑型，包括滴丸、軟膠囊齊U、硬膠囊劑、口服液、衝劑、膏劑、丹劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、貼劑、納米製劑、緩釋製劑和控釋製劑等。本發明的藥物異甘草素的用藥劑量可為2. 2g/kg體重以下(該劑量為小鼠口服最大耐受劑量(MTD)的換算劑量，小鼠的MTD > 20g/kg,因此其LD5tl > 20g/kg)口服製劑是異甘草素藥物一種重要的給藥劑型，口服藥物的主要吸收部位在小腸，而吸收是評價藥物生物利用度的重要手段。本發明利用Caco-2細胞模型來研究異甘草素的吸收程度，結果表明，異甘草素在通過Caco-2細胞膜時有著很高的表觀滲透係數 (Papp)，並隨著時間的變化其通透率呈現良好的時間依賴關係。血腦屏障是影響腦血管藥物療效的主要阻礙之一，本發明採用大鼠腦微血管內皮細胞和星形細胞聯合培養的方法建立了體外血腦屏障模型來研究異甘草素的跨膜轉運，結果表明，異甘草素在通過血腦屏障時有著很高的表觀滲透係數(Papp)，並隨著時間的變化其通透率亦呈現良好的時間依賴關係。 上述實驗證明，本發明的藥物能夠有效預防和治療心腦血管疾病，而且安全性很高，具有療效確切、毒副作用低、安全方便和價格低廉的特點。


圖1為實施例2中異甘草素在Caco-2細胞單層模型中的轉運滲透率與時間的關係；給藥濃度為異甘草素20 μ Μ,實驗結果以mean士 S. D.表示(n = 3-5)。圖2為實施例3中異甘草素在BBB細胞模型中的轉運滲透率與時間的關係；給藥濃度為異甘草素20 μ Μ,實驗結果以mean士 S. D.表示(n = 3-5)。圖3為實施例4中異甘草素對RBMECs的活力影響；實驗結果以mean士S. D.表示， 與正常對照組相比，*P < 0. 05, **P < 0. 01，C代表正常細胞對照組。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發明進行說明，但本發明並不局限於此。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均從商業途徑獲得。實施例1、異甘草素對大鼠離體胸主動脈的血管舒張作用1、材料和方法1.1實驗動物雄性SD大鼠，體重在250480克，由軍事醫學科學院提供。動物合格證號為 SCXK (京)2007-0001。動物自由飲食，被飼養於清潔室內。1.2試劑配製標準品異甘草素由中國藥品生物製品檢定所提供。異甘草素為黃色粉末，精密稱取異甘草素2. 56mg置於Iml容量瓶中，以DMSO充分溶解配製成IOmM的母液。所有給藥濃度均用三蒸水將母液稀釋而成，所需濃度分別為0. 8 μ Μ、4 μ Μ、20 μ M。1. 3 方法將SD大鼠麻醉後脫臼處死後，迅速打開胸腔，取出胸主動脈放入4°C的KH液中。 仔細撥除血管周圍脂肪和結締組織，分成長約3-5mm的血管環，懸掛在兩個平行的三角環上置於5ml、37°C的KH液中，並持續通以95% 02-5% CO2混合氣。以Powerlab生物信號處理系統記錄血管環張力，血管環懸掛後穩定10分鐘加Ig靜息張力平衡lh，在此期間每隔 20分鐘換1次KH液，並不斷調整張力在Ig左右。Ih後加3M的KCl 100 μ 1，刺激血管收縮連續三次，用KH液衝洗至平臺後加2. 5 X IO-3M的苯腎上腺素(PE) 50 μ 1達到收縮平臺後， 加的乙醯膽鹼(ACh)以檢查血管內皮是否完整。若加ACh後使PE預收縮的血管環舒張60%以上，可認為內皮完整；反之，則認為內皮受損。已完全去內皮的血管，用ACh後不產生舒張。取內皮完整血管，加PE使終濃度為10_6Μ，達最大收縮平臺後，先後加入異甘草素， 使終濃度達0. 8 μ Μ、4 μ Μ、20 μ Μ,記錄張力隨時間變化曲線，至舒張反應達最大，計算舒張百分率(Rex% )。與加入濃度為20 μ M的生理鹽水溶液的空白對照組比較。2、數據統計學處理所有數據用mean士S. D.表示，統計學分析採用SPSS 11. 5分析軟體。以PE 1(Γ6Μ 誘發最大收縮幅度為100%，以加入藥物後的血管張力幅度與PE誘發最大收縮幅度之間的比率反映血管張力的變化。所有數據均通過正態性檢驗，採用獨立樣本t檢驗進行分析，以 P < 0. 05為有顯著性差異。舒張百分比的計算公式為
舒張率_舒張張力(收縮最大張力-舒張最小張力):1% 、卜收縮張力(收縮最大張力-靜息張力)3、實驗結果異甘草素在不同濃度時對PE預收縮血管有著不同的舒張百分率，且呈現一定得線性關係(y = 1. 920X+21. 89)。結果見表1。
表1不同濃度的異甘草素對PE預收縮胸主動脈環的血管舒張作用(n = 6)
組別給藥濃度(μΜ)血管舒張百分率(Rex%) (平均值±標準差)對照組(生理鹽水)201.59±3.93異甘草素0.820.98±6.4**異甘草素432.50±4.64**異甘草素2062.64±7.04**(**與正常對照組相比，P < 0. 01)4、結論結果表明，在本實驗條件下，異甘草素在完整內皮的血管上均可劑量依賴性地減小PE預收縮血管張力。且當其濃度為0. 8 μ M的低劑量時，對血管的舒張還能維持在20% 以上，故說明異甘草素具有血管舒張作用，對由血管痙攣等因素所引起的心血管疾病具有顯著的預防和治療作用。實施例2、異甘草素在體外Caco-2細胞單層模型中的轉運吸收1、材料與試劑1. 1細胞來源Caco-2細胞購於協和細胞中心(源於美國ATCC公司)1. 2試劑配製及給藥精密稱取異甘草素2. 7mg置於Iml容量瓶中，以DMSO充分溶解配製成IOmM的母液。用新鮮配製的pH 7. 4的HBSS溶液稀釋成20 μ M進行給藥。2、方法2. 1體外Caco-2細胞單層模型的建立將狀態甚好的43代Caco-2細胞接種於多聚碳酸酯膜12孔Transwell培養池中的AP側，密度為6 8X IO4/孔，在供給池中加入0. 8ml培養基，在接受池加入Iml培養基培養21天，前一周隔天換液，以後每天換液。記錄的TEER值、酚紅試漏和掃描電鏡的細胞單層圖片、以及陽性藥維拉帕米Papp是鑑定模型成功與否的指標。2. 2異甘草素在Caco-2單層細胞模型中的轉運吸收從溫箱將細胞板取出，測量各孔的TEER值(達600 Ω cm2以上則滿足條件)。將各孔的AP、BL面的培養基全部吸走，用之前在孵箱預熱好的HBSS (pH 7. 4)洗2遍後，在AP、 BL側分別加入0. 8ml、Iml的HBSS放入恆溫搖床平衡30min (37°C，55rpm)。1)為了得到異甘草素的表觀滲透率Papp，則棄去該HBSS，在一部分細胞培養池的 AP側加入所配製好的異甘草素溶液(濃度為20 μ M) 0.5ml ,BUIWnHBSS lml。按90min從BL側取液100μ 1，所得的樣品放於-20°C冰箱保存待測。2)為了測定異甘草素的滲透率與時間的關係，則棄去該HBSS，在另一部分細胞培養池的AP側(絨毛面)加入所配製好的異甘草素溶液(濃度為20μΜ)0. 5ml，BL側加HBSS lml。按 15、30、60、90、120、180min 從 BL 側(基底面)取液 100μ 1，並立即加入 100 μ 1 HBSS, ISOmin後測TEER值。所得的樣品放於_20°C冰箱保存待測。HPLC進樣前，往以上樣品中加入同等體積的甲醇100 μ 1，渦漩振蕩後，高速離心 (13，00(^，511^11)，取上清液5(^1進樣。HPLC進樣檢測的色譜條件如下:)(DB-C18色譜柱 (250mmX4. 6mm, i. d. 5 μ m，美國Agilent公司)，流動相為甲醇和冰醋酸水溶液(from 30 70 to 40 60，￥八)，流速為1.01111/1^11，柱溫為591，進樣量為5(^1。異甘草素的檢測波長為270nm ；3、數據處理和分析方法表觀滲透係數的計算公式為
權利要求
1.異甘草素在製備預防和/或治療心腦血管疾病產品中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於所述產品為藥物或保健品。
3.異甘草素在製備具有血管舒張功能產品中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於所述產品為藥物或保健品。
全文摘要
本發明公開了異甘草素的新用途。該新用途一方面是其在製備預防和/或治療心腦血管疾病藥物中的應用；另一方面是其在製備血管舒張藥物中的應用。實驗證明，異甘草素能夠明顯舒張心腦血管、有效吸收和透過血腦屏障且對血管內皮細胞影響小，本品具有療效確切、安全方便、無毒副作用、價格低廉的特點。本發明的藥物具有明顯的預防和治療心腦血管疾病的作用，可用於多種原因引起的心腦血管疾病的預防與治療。
文檔編號A23L1/29GK102247339SQ20111013855
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月26日 優先權日2011年5月26日
發明者李曉蓉, 楊玉亞, 王麗娟, 白露, 薛明 申請人:首都醫科大學