產生用於生物分析的冷凍血或冷凍血細胞的方法

2023-09-19 02:28:45 5

專利名稱：產生用於生物分析的冷凍血或冷凍血細胞的方法
產生用於生物分析的冷凍血或冷凍血細胞的方法
技術領域：
本發明涉及在-40。C至-60。C的溫度下、優選在-50。C至-60。C下，低 溫保存含有單核細胞和淋巴細胞的人全血或血細胞的改進的方法，由此 單核細胞(monocyte)和淋巴細胞的功能得到保存。本發明特別涉及在不需 要分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)的 情況下，低溫保存含有單核細胞和淋巴細胞的人全血或血細胞的方法。
背景技術：
為了臨床檢查針對受細胞介導的免疫性(即接種個體的細胞免疫狀態) 抵抗的病原體的疫苗，通常從接種個體的血液樣品中分離單個核細胞。 為此，需現場裝備高度專業化的實驗室以及具有相應資格的工作人員。 而且，所有的容器和試劑必須是無熱原的。通常，將細胞在液氮(通常為 氣相)中冷凍、儲藏並裝運。
通常，在發展中國家(如在非洲)進行上述臨床檢查。現場裝備專門化 的實驗室、招募合適的工作人員以及運輸液氮中的樣品，都需要高昂的 資金和高超的技術。而且，在無熱原的條件下分離單個核細胞易受外界 的影響，熱原物質可能激活單核細胞，這使得樣品無價值。
原檢測中的基本工具。簡而言之，將待測量的樣品在加熱的情況下與人 血液或血細胞一起溫育，其後，評估作為單核細胞激活指示劑的促炎細 胞因子的產生。這個步驟也可以用新鮮抽取的人血液進行，但是作為一 條準則，即用型以及充分地表徵的血液或血細胞是標準化和市場分配所 需的。
Lakey等(Lakey JR， Anderson TJ， Rajotte RV. Novel approaches to cryo-preservation of human pancreatic islets (低溫保存人月夷島的新方法). Transplantation. 2001 Sep 27: 72(6):1005-11)記載了具有標準低溫保護劑 二曱亞碸(DMSO)的乙二醇(EG)對分離的人胰島存活和功能的低溫保護作用。結果證明，與2.0 M的DMSO和各種濃度的EG相比，較低濃度
的保存。 卩 、 、' 口
人全血分析日益用於檢測免疫功能或檢測熱原汙染，這是因為它們 提供了諸如便於操作、製備假象少以及生理細胞環境等優點。然而，該
方法經常受到新鮮抽取的血液的利用率、在#:感染供體情況下的推斷的
安全性顧慮、以及個體間供體差異的限制。
EP 0741294 Bl記載了通過與全血接觸和隨後測量內源性熱原的產 生檢測化合物的熱原活性的方法。但沒有記載血液的低溫保存。
Schindler等(Schindler S， Asmus S, von Aulock S， Wendel A, Hartung T: Fennrich S. Cryopreservation of human whole blood for pyrogenicity testing (低溫保存人全血用於熱原性檢測).J Immunol Methods. 2004 Nov; 294(1-2): 89-100)記載了批量產生低溫保存的血液的方法，所述血液在解 凍後可以直接使用而不需任何洗滌步驟。如通過FACS分析所顯示的， 單個核細胞保持完整。細胞因子的釋放可通過多種免疫學刺激進行誘導。 與新鮮的血液相比，細胞製劑釋放更高量的白介素-l(3(IL-l(3)和IL-6,但 無TNF。通過向新鮮血液中加入低溫保護劑二曱亞碸(DMSO),可將這些 差異僅歸因於DMSO的存在。大批量低溫保存的血液可通過混合最多10 位供體的血液捐贈品製備，而不依賴對血型的區分。有關誘導IL-1(3釋放 的世界衛生組織(WHO)的脂多糖(內毒素，LPS)參考製品(EC-6)的檢查限 度是至少0.5個內毒素當量(EU)/ml。可以以一系列藥物檢測歐洲藥典規 定的極限濃度下的內毒素標樣，表明體外熱原檢測(IPT)也可用低溫保存 的血液進行。描述了其他可能的應用，包括高通量篩選免疫調節劑或毒 素以及保存患者的樣品用於稍後的單核細胞功能分析。
EP 05024463.1記載了低溫保存哺乳動物全血的改進的方法，包括提 供人全血樣品，提供稀釋的含水低溫保護劑，以1:2至2:1的比例混合所 述樣品和所述稀釋的含水低溫保護劑，以便產生低溫預混合物 (cyto-premix)，並在-65。C至-100。C的溫度下、優選在-80。C下、在適宜 的冷凍器中冷凍所述預混合物，以便獲得哺乳動物全血的低溫保存的樣
5然而，所有上文引用的文獻都涉及藉助通過投入液氮(-196。C)的休克 冷凍(shock-freezing)的低溫保存或使用幹水(-79。C)。而且，已知的是，保 存的細胞在接近低溫過程中和加熱至室溫時由於溶液作用和細胞內水狀 物的形成而經常受到破壞，這只能通過非常快速的冷凍來防止。
此外，基於人發熱反應的可選擇熱原檢測是通過將檢測樣品與人全 血一起溫育並產生IL-1、 IL-6或TNFa作為讀出的方式建立的。另外， 可選擇熱原4企測的所述試劑盒可在市場上獲得(標準品、緩衝液、ELISA 等)，但新鮮抽取的人血液是每個實驗所需的。最後，如上文，在液氮中 低溫保存PBMCs的技術已完全建立，但是因為其需要實驗設備、產生過 程以及適宜的裝運和儲藏，因而昂貴和費力。
由上文可見，仍然需要簡單還易於使用、有特色、安全和穩定的保 存全血的方法。因此，本發明的目標是提供這種改進的方法以及與這種 方法以及相關方法相關的優勢、特別是在約-60。C至-約-40。C的相對高溫 下。
根據本發明的第一個方面，上述目標是通過低溫保存哺乳動物全血 或血細胞的改進的方法解決的，該方法包括，提供人全血或血細胞的樣
品，提供稀釋的含水低溫保護劑，混合所述樣品和所述稀釋的含水低溫 保護劑，以便產生低溫預混合物，並在適宜的冷凍劑或冷凍器中，在-40。C 至-65。C的溫度下冷凍所述預混合物，以便獲得哺乳動物全血或血細胞的 低溫保存的樣品。
與利用(液體或氣體形式的)氮或幹水的已建立的方法相比，本發明 技術的第一個優勢是，費用低了幾個數量級。對於冷凍和儲藏而言，不 需要儲藏和運輸用自動化制冷機和氮容器或-80。C的深度冷凍器，且對於 運輸而言，不需要幹水。因此， 一方面可節省外圍實驗室以及中心實驗 室的投資，另一方面節省高昂的運輸費用。
本發明技術的第二個優勢是，也可將從個體採集的樣品作為全血直 接冷凍，而沒有汙染風險。在評估用於確定細胞結合免疫性(以及熱原檢 測)的樣品過程中，絕對必須防止PBMCs受到刺激，因為隨後由於高噪 音水平不能再測量特定的信號。在已建立的方法中，在低溫保存進行前， 通過梯度離心的方式分離PBMCs。為了防止細胞的刺激，必須保證無熱原的梯度凝膠，這經常不是使用常規梯度和/或檢測試管的情況。另外， 評估實驗室中的工作必須絕對無菌和無熱原，這在常規條件下難以實現。 後者特別適用於經驗少的實驗室或者資格低的工作人員。
本發明方法的第三個優勢是，為了保護免疫細胞的功能，不需要異
源人AB血清各自血漿。為了成功地低溫保存分離的PBMCs或其他的細 胞，加入人血清(從AB血型供體中獲得的，以排除針對淋巴細胞的血型 同種凝集素的作用)是關鍵的。必須小心地選擇許多適宜的AB血清，因 為一定百分比的AB血清誘導T細胞刺激。在PBMCs的低溫保存中，最 好的試劑是自體血清。低溫保存的全血、自體血清各自血漿是自動包含 於樣品中的，或者，如果需要，加入的。
優選地，所述稀釋的含水低溫保護劑是選自溶解於磷酸鹽緩衝液(如 倫森緩衝液(S6rensenbuffer))、含有約生理濃度(如150mM)的鹽的含水緩 衝液或其他適宜的含水無鹽或基本上無鹽的緩沖液中的10%-30%、優選 20。/。的DMSO。"基本上無鹽"意指，緩沖液僅含有痕量鹽和/或低於10 mM的非常低量的鹽。其他的這些緩沖液對本領域技術人員而言是已知 的。其他適宜的試劑包括幾乙基澱粉(HES)。令人驚訝的發現是，在混合 前，不需要冷卻細胞和DMSO或將他們放置於冰上。在本發明的方法中， 這兩種組分都可以處於室溫下(參閱下文的實施例)。
在本發明方法的另一個實施方案中，所述混合通過小心地混合所述 樣品和所述稀釋的含水低溫保護劑進行。小心的混合可通過將稀釋的含 水低溫保護劑慢慢地滴入全血或血細胞樣品中並顛倒含有樣品的試管或 容器進行。優選在混合低溫保護劑(如DMSO)時，小心地振蕩樣品。
在本發明方法的另 一個優選的實施方案中，樣品還含有抗凝血劑， 如肝素，在適當的時間點，向血液樣品中加入所述抗凝血劑。
在本發明方法的另 一個優選的實施方案中，血細胞選自人外周血單 個核細胞(PBMC)、 apherese-單核細胞、血沉棕黃層、幹細胞(如來自臍 帶血或外周血)、細胞治療(如用於腫瘤治療的樹突細胞)以及基於細胞的 基因治療(如遺傳》務飾淋巴細胞)。
最佳的是，為了避免樣品中單核細胞的冷凍乾燥，將哺乳動物全血 或血細胞的低溫保存樣品填入基本上不含空氣的凍存管(cryotubes)。優選地，混合步驟後，將所述預混合物在室溫下或者4。C至30°C、 優選22+/-2°C下保存30分鐘至180分鐘、優選30分鐘至60分鐘的時間 段。令人驚訝的發現是，與加入低溫保護劑(如DMSO)後直接冷凍的樣品 相比，冷凍前短暫的儲藏步驟提高了冷凍細胞的反應性。再者，在不期 望受限於理論的情況下，看起來這種作用可歸因於低溫保護劑向細胞膜 以及向細胞質整合的改善。
優選地，在-40。C至-60。C的溫度、優選-55。C至-60。C的溫度下冷凍 所述預混合物。冷凍在適宜的冷凍器中進4亍，如-40。C或-60。C的商購的 冷凍器。而且適宜的冷凍劑如幹水都可使用，只要能達到適宜的溫度。
在本發明的另一方面中，提供了本發明的方法，其還包括將所述低 溫保存的樣品在-40。C至-60。C的溫度、優選在-55。C至-60。C下，儲藏1-4 周、優選3周的時段。令人驚奇的發現，與儲藏了較短時間段的細胞相 比，已在-40。C至-60。C下、優選-55。C至-60。C下儲藏了一定時間段(理 想的是約3周)的細胞的反應性/生存力得到改善。在此時間內，實現了 最佳反應性，並且由此應優選使用這種最小儲藏期。
在本發明方法的另一個實施方案中，所述哺乳動物選自小鼠、大鼠、 山羊、貓、犬、馬、山羊、幾內亞豬、倉鼠、猴或人。人是優選的。
在本發明方法的另一個實施方案中，樣品是全血或血細胞樣品的樣 品池(pool)。出於實用的原因，該池可由2-20個、優選約10個樣品組成， 但是樣品的理論數是沒有限制的。
本發明的另 一 方面涉及確定接種個體的個體免疫狀態、特別是細胞 結合免疫性的方法，包括上文的低溫保存方法。
本發明的另 一方面涉及熱原檢測的方法，包括上文的低溫保存方法。
本發明的另 一方面涉及確定CD4以及CD8 T細胞和其他免疫細胞的 穩定性和功能性的方法，包括上文的低溫保存方法。
依然是本發明的另 一方面涉及臨床^r測針對病原體的疫苗的方法， 包括上文的低溫保存方法，所述病原體通過細胞免疫性受到排斥。
依然是本發明的另 一方面涉及進行本文所述方法的試劑盒，其中所 述試劑盒含有進行所述方法的諸如小瓶、標準品、緩衝液的材料、進行 ELISA的材料、進行流式細胞術的材料、手冊和/或裝運冷凍樣品的材料。
8根據本發明，研發了允許冷凍全血樣品的方法，所述樣品用於在無 進一步製備的情況下、特別是無單個核細胞的在前分離的情況下，確定 細胞結合免疫性。樣品的單核細胞和淋巴細胞的功能未受到損壞。低溫 保存的發生，不需要液氮。由此，用很少的資金和技術努力評估個體的 血液樣品(例如，疫苗的臨床檢查)變為可能。
在一個特定的實施方案中，解決了本發明的目標，這是因為預稀釋 (如在上文的緩衝液或磷酸鹽緩沖液中為20%)所需的低溫保護劑(如
DMSO)，且隨後小心地混合血液樣品或血細胞樣品(如以1:1的比例)。 在優選的室溫下靜置後，可在-40。C至-60。C下、在冷凍器中或乾冰上直 接冷凍樣品。不需要額外的輔助物。單核細胞和CD3細胞的功能(例如， 用適宜的標誌物刺激的能力)得到維持。如此產生的低溫血(cryoblood)樣 品在至少 一年內是穩定的。
令人驚訝的是，用於檢測細胞結合免疫性的深度冷凍的血液樣品，(a) 不再需要在高度專業化的實驗室內進行預處理(分離單個核細胞)，以及(b) 不再需要在基於液氮的冷凍器中或在-80。C下進行冷凍和運輸。
本發明的優勢在於費用的實質節省(約90%)以及勞力的實質節省。對 於臨床檢查針對通過細胞結合免疫性排斥的病原體(例如肺結核、瘧疾) 的疫苗，不再需要勞動密集型以及昂貴的實驗室以及高資格的工作人員。 也簡化了樣品的運輸。而且，可基本上減少樣品(例如在細胞分離過程中， 通過非無熱原的裝置以及化學品)汙染的危險。
為了確定患者的細胞免疫狀態，如果例如在醫生或內科醫師辦公室 的檢查點進行，那麼迄今必須採集新鮮血液並在同一天內在專業化的實 驗室中檢查，這需要如快遞等的後勤付出並涉及進一步的費用。本發明 的方法允許在無其他問題的情況下按所需評估樣品。樣品可稍後診斷並 可在幹水上進行簡易裝運。可在獸醫醫藥中考慮相似的情形(因為這也可 涉及疫苗的臨床檢測)，並且包括於本發明的範圍內。
儘管根據本發明的方法在人類中的優選實用性，對其進行了描述， 但本發明的方法也可以在例如就疫苗而言，在類似人(例如牛)的臨床試驗 和研究中，用於其他的動物。
仍然是本發明的另 一方面涉及分析和/或檢測空氣中熱原的方法(優選在不良建築物症候群(sick-building-syndrome)的背景下)，其中，通過膜
血一起溫育，隨後進行本文所述的檢測。
仍然是本發明的另 一方面涉及(例如在運輸/裝運/儲藏/生產前)分析 和/或檢測製藥工業的反應容器、儲藏容器/桶狀物、容器/發酵罐的熱原缺 乏的方法，其中加入根據本發明製備的稀釋的血液，使之反應/接觸，並 隨後確定細胞因子或其他合適的參數。
在下面的實施例中，參考附圖，將對本發明做進一步描述，而不是 對其進行限制。出於本發明的目的，將所有本文引用的文獻在此以全文 的方式通過引用併入。


圖1表示-40。C下產生和儲藏的低溫血的質量檢測。檢測-40。C下深 度冷凍的低溫血在解凍後對內毒素的反應性，並與新鮮抽取血液的反應 相比(相同供體的新鮮和深度冷凍血液樣品分別來自相同血液樣品)。
圖2和圖3表示對-60。C下產生的低溫血質量的另一檢測，並與相同 供體的新鮮抽取的血液(特別地和作為合併樣品)相比，以及與-80。C下的 產生和儲藏相比。
圖2A至圖2D表示從5位供體抽取的新鮮血液樣品對內毒素(WHO 標準)的反應性，IL-1(3 (A)、 IL-6 (B)以及TNFa的誘導(特別測定(particular determination)以及三細胞因子-ELISA (Tri-Cytokine-ELISA)概括測定 (summarising determination)) (C和D)。
圖3A至圖3D表示儲藏7天後低溫血(圖2所示5位供體的合併血液) 對內毒素(WHO標準)的反應性，IL-ip(A)、 IL4(B)以及TNFa(C)的誘導 (特別測定以及三細胞因子-ELISA概括測定)(D)。產生全部數據，以與 -80。C下的產生和4諸藏相比較。
圖4表示-60。C下產生和儲藏的低溫血的穩定性(4A)。檢測了-60。C 下保存的低溫血解凍後對內毒素(WHO標準)的反應性，並與-80。C下保 存的低溫血的反應相比(4B)。
實施例
不同溫度下^f氐溫血的產生利用肝素化管(例如Sarstedt S-monovettes 9ml LH以及Multifly set 21G，無菌且無熱原)，從5位健康個體每位採集約9ml血液。可以容易 地增加待釆集的血液的量。所述量一方面取決於符合輸注醫學考慮的供 體保護，另一方面取決於後勤標準(通過考慮可用的容量，在限定的時間 段內的低溫血的產生或處理)。在抽取血液前，為了儘可能排除供體的單 核細胞的最終預刺激或基於藥物治療的抑制，詢問供體有關急性感染性 疾病或抗炎藥物使用的情況。
抽取後約3小時內，檢測小體積的每一血液樣品的反應性以及新鮮 狀態下的單核細胞的最終預刺激(參閱第l項，用新鮮血液進行預檢測)。 而且，這些結果可作為評估低溫保存成功的參考值。
合併主要體積的血液樣品，並在不同的溫度下冷凍(-40。C、 -60。C以 及-80。C)(參閱第2項，低溫保存)。在冷凍器中短暫儲藏後，檢測低溫保 存的成功(參閱第3項，低溫血的質量控制)。因此，通過在數個時間點分 析單核細胞的反應性，檢測低溫血的儲藏穩定性(參閱第4項，儲藏的穩
定性)。
1.用新鮮血液進行預檢測
抽取後，在全血熱原檢測中檢查而不進一步處理小體積(約200 iil)的 每個血液樣品。這種檢查不應該在血液抽取後的大於3小時後進行。為 此，藉助多道連續分配移液器(Brand HandyStep或Eppendorf Multipette plus 4981)以及無菌且無熱原的附件(如EppendorfCombitips biopur 1 ml), 向細胞培養平板(如BD Falcon 353072， 96孔平底，無菌且無熱原，如果 需要，必須檢測平板的無菌性和熱原的缺乏)中加入各自的血液樣品。之 前用糹田月包i告養基(Cambrex、 Invitrogen、 Biochrom、 Biozol 、 Sigma或Gibco 的RPMI 1640 w/L-穀氨醯胺，內毒素的含量< 0.025 IU/ml)和系列稀釋於 無菌且無熱原鹽水(如Fresenius Kabi或B. Braun的等滲氯化鈉溶液)的分 別的陽性對照(如NIBSC，第二國際標準品-LPS 94/580)以及相應的無菌 和無熱原陰性對照(如Fresenius Kabi或B. Braun的等滲氯化鈉溶液)準 備平板。所用的量如下
220 jil RPMI 1640
+ 20 nl對照+ 20 新鮮血液。
隨後，利用無菌和無熱原的槍頭(如Eppendorf epT丄P.S. bi叩ur)和多 通道移液器(如Eppendorf Research),通過以100-120 )il往復吹打5次， 均勻且無泡沫地混合組分。最後，將蓋著的平板轉移到37°C、 5% C02 以及95%溼度的細胞培養箱(如Heraeus Cytoperm或Labotect C42)中 10-24小時(通常過夜)。
隨後，在ELISA中(參閱第3項)測定個體製備物中的內源性熱原 IL-1(3 、 IL-6以及TNFa (特別的以及多細胞因子的ELISA (Multi-Cytokine-ELISA))。預4企測結果顯示於圖2中。 2.低溫M
主要體積的抽取的血液樣品通過無菌和無熱原的一次性血清移液管 (如Greiner Bio-one或VWR)轉移至去熱原的玻璃容器內，並混合。任選 地，以相同的方式，進行個體供體血液樣品的低溫保存。隨後，將如以 前製備的相同體積的溶解於倫森緩衝液中的20%的DMSO溶液(DMSO: 如Sigma D陽2650; 4侖;^糹爰衝液如Proquant PYROKONTROL,約30 mM 磷酸鹽，兩種試劑都是無菌且無熱原的)力。入該池，並緩慢均勻地淘洗。 然而，也可以使用其他的溶液(如50mMTris緩衝液、PBS、 0.9%鹽水、 RPMI 1640;所有的溶液必須是無菌且無熱原的，如果必要，必須進行4企 測)。與各文獻中所建立的相反，使含有DMSO的溶液處於約20。C(室溫) 的溫度範圍而不是處於水冷的狀態。室溫下30-60分鐘後，將混合物以 1.5ml等分至凍存管(如Nunc凍存管小瓶1.8ml，無菌且無熱原，如果必 要，必須進行;險測)。必須確保管是密封的。在低溫保存前，必須遵從30 分鐘的最小時間段(平衡)。
隨後，在不同的溫度下冷凍血液池。為此，將凍存管分成大約相同 規才莫的三組，轉移至合適的盒子(如Nalgene、 Roth或Brand的9x9塑料 凍存盒)進行儲藏，並在無任何其他輔助裝置的情況下儲藏於下列冷凍器 中
a) -80。C (設備Heraeus Hera冷凍器)
b) 隱60。C (i殳備Forma Scientific Enviroscan生物冷凍器)
c) 畫40。C (設備DJM CryoResearch超低溫冷凍器)。3. 低溫血的質量控制
建議在儲藏約一周後儘早進行低溫血的質量控制，因為顯然即使在 深度冷凍狀態下，平衡過程仍然發生。為了檢查低溫保存的合併樣品， 將一等分試樣各自解凍，優選在乾燥箱(如Heraeus VT5042)中、37°C下 靜置。通過不流動的暖空氣解凍優於其他的方法(如在水浴中和在加熱塊 上)。15分鐘後，將管從加溫箱中取出，小心地上下振蕩，進行充分混合。 隨後，如上文第1項孵育新鮮血液時所述的，再次藉助多道連續分配移 液器以及無熱原的製劑，立即加入到具有培養基和對照的細胞培養平板 上。解凍時間的確切觀察以及快速處理很重要，因為低溫血直到加入到 細胞培養平板都受10。/。DMSO的影響，這會損害單核細胞的功能。如以 下可以看出，DMSO的濃度通過加入培養基中稀釋了 6.5倍。組合物如 下
200plRPMI 1640 + 20 nl對照
+ 40 ^低溫血(由於用含有DMSO的緩衝液進行預稀釋，與新鮮血液 相比，血液的體積加倍)。
在將組分(也參閱新鮮血液溫育部分的第l項)混合後，在此情況下， 也將蓋著的平板轉移至上文所述的細胞培養箱中，在所述條件下培養 10-24小時。
溫育時間期滿後，從培養箱中取出培養平板，利用多通道移液管並 以100 !il吹打5-6次，再次混合孔的內容物。不需要分離上清液和細胞 或碎片。隨後，根據製造商的推薦，將50-200 ^d每一樣品用於單細胞因 子ELISA (single-cytokine-ELISA) (R&D Systems Quantikine或DuoSet)中， 或用於多細胞因子ELISA中，以便能檢測LPS刺激誘導的IL-1卩和/或IL-6 和/或TNFa的釋放。結果顯示於
圖1至圖3中。
4. 有關低溫血儲藏穩定性的檢查
在不同的時間點，從冷凍器中取低溫保存的血液樣品，並和第3項 相似，檢查其單核細胞的反應性。結果顯示於圖4中。
1權利要求
1.低溫保存哺乳動物全血或血細胞的方法，包括-提供人全血或血細胞樣品，-提供稀釋的含水低溫保護劑，-混合所述樣品和所述稀釋的含水低溫保護劑，以便產生低溫預混合物，以及-使用適宜的冷凍器或冷凍劑，在-40℃至-60℃的溫度下，冷凍所述低溫預混合物，以便獲得哺乳動物全血或血細胞的低溫保存的樣品。
2. 如權利要求1所述的方法，其中所述稀釋的含水低溫保護劑選自 溶解於諸如倫森緩衝液、PBS的磷酸鹽緩沖液或含有生理濃度鹽的其他 緩衝液或其他適宜的含水無鹽和/或基本上無鹽的緩沖液和/或自體血漿 的10%-30%DMSO。
3. 如權利要求1或2所述的方法，其中將所述稀釋的含水低溫保護 劑與所述樣品以1:2至2:1的比例混合。
4. 如權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述混合通過小心地 混合所述樣品和所述稀釋的含水低溫保護劑進行。
5. 如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述樣品還含有諸如 肝素的抗凝血劑。
6. 如權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述血細胞選自人外 周血單個核細胞(PBMC)、 aph erese-單才亥糹田月包、jfe^冗^it"^"、幹糹田月包、糹田 胞治療劑以及基於細胞的基因治療劑。
7. 如權利要求1-6中任一項所述的方法，其中將哺乳動物全血或血 細胞的所述低溫保存樣品裝入基本上不含空氣的凍存管。
8. 如權利要求1-7中任一項所述的方法，還包括在環境溫度或4°C 至30°C下、優選22+/-2°C下，將所述混合後的所述低溫預混合物樣品儲 藏30-180分鐘、優選30-60分鐘的時間段的步驟。
9. 如權利要求1-8中任一項所述的方法，其中在-40。C至-60。C的溫 度下、優選-60。C下，冷凍所述低溫預混合物。
10. 如權利要求1-9中任一項所述的方法，還包括在-40。C至-60。C 的溫度下、優選-50。C下，將所述低溫保存的樣品儲藏2-4周、優選3周 的時間^:的步驟。
11. 如權利要求1-10中任一項所述的方法，其中在將所述低溫預混 合物的組分混合前，使所述組分處於室溫下。
12. 如權利要求l-ll中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物是人。
13. 如權利要求1-12中任一項所述的方法，其中所述樣品是來自相 同或不同供體的全血或血細胞樣品的池。
14. 確定個體的全身免疫狀態的方法，包括權利要求1-13中任一項 所述的方法。
15. 熱原^r測的方法，包括權利要求1-13中任一項所述的方法。
16. 確定CD4細胞、CD8 T細胞、單核細胞以及其他免疫細胞功能 性的方法，包括權利要求1-12中任一項所述的方法。
17. 臨床檢測針對通過細胞免疫排斥的病原體的疫苗的方法，包括權 利要求1-13中任一項所述的方法。
全文摘要
本發明涉及在-40℃至-60℃的溫度、優選-60℃下，低溫保存含有單核細胞和淋巴細胞的人全血的改進的方法，由此單核細胞和淋巴細胞的功能得到保存。本發明特別涉及在不需要分離外周血單個核細胞(PBMC)情況下，低溫保存含有單核細胞和淋巴細胞的人全血或血細胞的方法。
文檔編號A01N1/02GK101583268SQ200780038563
公開日2009年11月18日 申請日期2007年9月27日 優先權日2006年9月27日
發明者託馬斯·蒙塔戈-萊辛, 蔭戈·斯普瑞特澤爾, 貝蒂娜·洛斯施納 申請人:聯邦血清與疫苗管理局保羅-埃利希爾-研究所