一種白色鏈黴菌及其應用的製作方法

2023-09-19 05:42:35

一種白色鏈黴菌及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種產ε-聚L-賴氨酸的白色鏈黴菌Ls2，其保藏號為CGMCC?NO.8472，在高氏一號固體培養基上單細胞繁殖生長形成的菌落為白色絲狀，邊緣乾燥中央塌陷；鏡檢細胞為杆狀，無隔斷，長度1.0-3.0mm；革蘭氏陰性；在20-40℃的溫度下均能生長，最適生長溫度為28-30℃；生長pH範圍為3.0-9.5，最適生長pH為6.8-7.2；需氧生長；碘化鉍鉀實驗生成橙紅色沉澱，甲基橙實驗生成橙色沉澱。本發明還涉及白色鏈黴菌Ls2在製備ε-聚L-賴氨酸的應用。
【專利說明】一種白色鏈黴菌及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種產聚賴氨酸的白色鏈黴菌及其應用。

【背景技術】
[0002] ε -聚L-賴氨酸（ε -PL)是必需胺基酸L-賴氨酸通過α -羧基和ε -氨基形成 的同聚物，是一種具有抑菌功效的多肽，抑菌譜廣，對於酵母菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性 菌和黴菌均有明顯的抑菌效果。ε -PL能在人體內分解為賴氨酸，是人體必需的8種氨基 酸之一，世界各國均允許在食品中強化賴氨酸，因此，ε -PL是一種營養型的抑菌劑。ε -PL 在食品添加劑領域作為天然食品防腐劑正日益受到人們的重視，其安全性明顯高於其他的 化學防腐劑。
[0003] 現有技術已知可以利用白色鏈黴菌生產ε-PL，但多存在白色鏈黴菌對培養條件 要求高、生長速度慢、ε -PL產量低以及分離純化工藝複雜等缺陷。


【發明內容】

[0004] 本發明提供了一種能夠產生聚賴氨酸的白色鏈黴菌（Streptomyces albus)Ls2， 其能夠代謝產生ε -聚L-賴氨酸（ε -PL)，從而能夠用於生產ε -PL。
[0005] 本發明的白色鏈黴菌Ls2在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 保藏，保藏號為CGMCC N0. 8472,保藏時間為2013年11月15日，其16SrDNA片段長度為 1462bp，具體如SEQ ID N〇:l所示。BLAST檢索發現菌種Ls2與白色鏈黴菌基因組序列的同 源性很高，達到99 %，結合形態學和生理生化性狀的鑑定結果，可以確認本發明的菌種Ls2 為白色鏈黴菌（Streptomyces albus)。
[0006] 本發明的白色鏈黴菌Ls2從採自杭州的土壤中篩選分離得到，在高氏一號固體培 養基上單細胞繁殖生長形成的菌落為白色絲狀，邊緣乾燥中央塌陷；鏡檢細胞為杆狀，無隔 斷，長度1. 0-3. 0mm ;革蘭氏陰性；在20-40°C的溫度下均能生長，最適生長溫度為28-30°C; 生長pH範圍為3. 0-9. 5,最適生長pH為6. 8-7. 2 ;需氧生長；碘化鉍鉀實驗生成橙紅色沉 澱，甲基橙實驗生成橙色沉澱；高氏一號固體培養基的配方為：葡萄糖50份，氯化鈉0. 5 份，硝酸鉀1份，磷酸氫二銨0. 5份，硫酸鎂0. 5份，硫酸亞鐵0. 01份，硫酸銨0. 66份，硫 酸鋅0. 01份，酵母膏0. 1份，瓊脂粉15份和水1000份。
[0007] 本發明的白色鏈黴菌Ls2能夠代謝產生ε -聚L-賴氨酸，因此，本發明還涉及白 色鏈黴菌Ls2在生產ε-聚L-賴氨酸中的應用。本發明的白色鏈黴菌Ls2代謝所產生的 ε -PL具有很強的抑菌性，分子量大約在3KDa左右，可廣泛應用於食品防腐劑和藥物載體 等其他領域。
[0008] 本發明還涉及生產ε -聚L-賴氨酸的方法，其包括如下步驟：
[0009] (1)將白色鏈黴菌Ls2的試管種接種於液體搖瓶發酵培養基中，培養溫度為 28-30°C，培養時間為2-3天，獲得發酵液，在培養過程中無需調節pH值；
[0010] 液體搖瓶發酵培養基的組成以重量份計為：
[0011] 酵母膏5份，葡萄糖50份，硫酸銨10份，硫酸亞鐵0. 03份，硫酸鎂0. 5份，硫酸鋅 〇. 04份，磷酸氫二鉀0. 8份，磷酸二氫鉀1. 36份，和水1000份；
[0012] 製備液體搖瓶發酵培養基的方法為：稱取酵母膏、硫酸銨、硫酸亞鐵、硫酸鎂、硫酸 鋅、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀放入水中，充分混勻後將pH值調節至6.8,121°C溼熱滅菌20分 鍾，然後再加入經單獨滅菌的葡萄糖水溶液，混勻冷卻後備用；
[0013] (2)將發酵液離心，取上清液用lmol/L的NaOH溶液將其pH值調節至8,靜置0· 5h 後用濾紙過濾去除沉澱，得濾液；
[0014] (3)用弱酸性陽離子交換樹脂HD-2對濾液進行震蕩吸附8-16h，優選12h，例如可 以搖床震蕩，150r · min-1，其中，濾液要浸過樹脂，並高於樹脂約3釐米，靜置0. 5-lh後過 濾，將樹脂用蒸餾水衝洗3-5次，然後用0. lmol/L的HC1溶液對樹脂進行震蕩洗脫8-16h， 優選12h，靜置0. 5-lh後過濾，用lmol/L的NaOH溶液將洗脫液的pH值調節至6. 5,然後減 壓濃縮得濃縮液；
[0015] (4)在濃縮液中加入乙醇乙醚體積比為2:1的混合液，濃縮液與乙醇乙醚混合液 的體積比大約為1:10,混勻，過濾除去液體，保留沉澱物，即ε -聚L-賴氨酸，經檢測，其純 度達80%，產量達0.6克/L發酵液。將所得的ε-聚L-賴氨酸溶於去離子水中，用G-250 柱進行吸附解析，可得純度超過98%的ε -聚L-賴氨酸，產量達0. 42克/L發酵液。
[0016] 本發明的優點在於：⑴本發明的白色鏈黴菌Ls2適應環境的能力強，在 pH3. 0-9. 5和溫度為20-40°C條件下均能很好地生長，並產生ε -聚L-賴氨酸，從而在生產 賴氨酸的過程中無需監測和調節培養基的pH值，簡化了生產工藝；（2)本發明的白色鏈黴 菌Ls2能夠快速產生ε -聚L-賴氨酸，培養時間僅需2-3天，降低了生產成本；(3)本發 明的白色鏈黴菌Ls2以葡萄糖為碳源，以酵母膏和硫酸銨為氮源，培養基成分簡單，價格低 廉，便於後期對ε -聚L-賴氨酸的分離純化；(4)本發明的白色鏈黴菌Ls2生產的ε -聚 L-賴氨酸性質穩定，分子量在3KDa左右，抑菌效果好，且穩定性好，不易降解。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0017] 圖1 :本發明的白色鏈黴菌Ls2在含有染料亞甲基藍的選擇性培養基中產生排斥 圈；
[0018] 圖2 :本發明的白色鏈黴菌Ls2的搖瓶發酵液在碘化鉍鉀實驗中生成橙紅色沉澱， 其中，第1個試管為發酵液；第2個試管為在不產聚賴氨酸菌種的發酵液中加入碘化鉍鉀試 齊U ;第3個試管為在白色鏈黴菌Ls2發酵液中加入碘化鉍鉀試劑；第4個試管為在水溶聚賴 氨酸標準品中加入碘化鉍鉀試劑；
[0019] 圖3 :本發明的白色鏈黴菌Ls2分別對革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌（圖3a)和革 蘭氏陰性大腸桿菌（圖3b)的抑菌試驗；
[0020] 圖4 :本發明的白色鏈黴菌Ls2的16SrDNA PCR後瓊脂糖凝膠電泳圖。

【具體實施方式】
[0021] 實施例1.白色鏈黴菌Ls2的分離和保藏
[0022] 本發明的白色鏈黴菌Ls2通過如下步驟分離得到：
[0023] (1)利用富集培養基對採自杭州的土壤中的微生物進行富集培養，培養溫度為 28-30°C，培養時間為6-7天，得到邊緣乾燥中央塌陷的白色放線菌。
[0024] 富集培養基的組成以重量份計為：
[0025] 可溶性澱粉20份，氯化鈉0. 5份，硝酸鉀1份，磷酸氫二鉀0. 5份，硫酸鎂0. 5份， 硫酸亞鐵0. 01份，硫酸銨0. 66份，硫酸鋅0. 01份，酵母膏0. 1份，重鉻酸鉀0. 05份，瓊脂 粉15份，和水1000份。
[0026] 製備富集培養基的方法為：稱取可溶性澱粉、氯化鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、硫酸 鎂、硫酸亞鐵、硫酸銨、硫酸鋅、酵母膏、重鉻酸鉀和瓊脂粉放入水中，充分混勻後將pH值調 節至7. 0-7. 2,121°C溼熱滅菌20分鐘，冷卻後備用。
[0027] (2)利用選擇性培養基篩選產物中含有帶正電物質的菌種。將含染料亞甲基藍的 選擇性培養基滅菌後，倒平板，待培養基凝固後，用劃線法進行接種。培養溫度為28-30°C， 培養時間為6-7天，結果如圖1所示，周圍存在排斥圈的菌落其產物中含有帶正電物質。挑 選單菌落在高氏一號固體培養基中進行劃線純化，純化菌株於4°C保存。
[0028] 選擇性培養基的組成以重量份計為：
[0029] 葡萄糖50份，氯化鈉0. 5份，硝酸鉀1份，磷酸氫二銨0. 5份，硫酸鎂0. 5份，硫酸 亞鐵0. 01份，硫酸銨0. 66份，硫酸鋅0. 01份，酵母膏0. 1份，亞甲基藍0. 02份，瓊脂粉15 份，和水1000份。
[0030] 製備選擇性培養基的方法為：稱取氯化鈉、硝酸鉀、磷酸氫二銨、硫酸鎂、硫酸亞 鐵、硫酸銨、硫酸鋅、酵母膏、亞甲基藍和瓊脂粉放入適量水中，充分混勻後將pH值調節至 7. 0-7. 2,121°C溼熱滅菌20分鐘，然後再加入經單獨滅菌的葡萄糖水溶液，混勻冷卻後備 用。
[0031] 本發明的白色鏈黴菌Ls2在高氏一號固體培養基上單細胞繁殖生長形成的菌落 為白色絲狀，邊緣乾燥中央塌陷；鏡檢細胞為杆狀，無隔斷，長度1. 0-3. 0mm ;革蘭氏陰性； 在20-40°C的溫度下均能生長，最適生長溫度為28-30°C;生長pH範圍為3. 0-9. 5,最適生長 pH為6. 8-7. 2 ;需氧生長；碘化鉍鉀實驗生成橙紅色沉澱（結果如圖2所示），甲基橙實驗 生成橙色沉澱。高氏一號固體培養基的配方為：葡萄糖50份，氯化鈉0. 5份，硝酸鉀1份， 磷酸氫二銨〇. 5份，硫酸鎂0. 5份，硫酸亞鐵0. 01份，硫酸銨0. 66份，硫酸鋅0. 01份，酵母 膏〇. 1份，瓊脂粉15份和水1000份。
[0032] 本發明的白色鏈黴菌Ls2在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保 藏，保藏號為CGMCC N0. 8472,保藏時間為2013年11月15日。
[0033] 實施例2.利用白色鏈黴菌Ls2生產ε -聚L-賴氨酸
[0034] (1)將白色鏈黴菌Ls2的試管種接種於液體搖瓶發酵培養基中，培養溫度為 28_30°C，培養時間為2天，獲得發酵液，在培養過程中無需調節pH值；
[0035] 液體搖瓶發酵培養基的組成以重量份計為：
[0036] 酵母膏5份，葡萄糖50份，硫酸銨10份，硫酸亞鐵0. 03份，硫酸鎂0. 5份，硫酸鋅 〇. 04份，磷酸氫二鉀0. 8份，磷酸二氫鉀1. 36份，和水1000份；
[0037] 製備液體搖瓶發酵培養基的方法為：稱取酵母膏、硫酸銨、硫酸亞鐵、硫酸鎂、硫酸 鋅、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀放入適量水中，充分混勻後將pH值調節至6. 8,121°C溼熱滅菌 20分鐘，然後再加入經單獨滅菌的葡萄糖水溶液，混勻冷卻後備用；
[0038] (2)將發酵液離心，取上清液用lmol/L的NaOH溶液將其pH值調節至8,靜置0· 5h 後用濾紙過濾去除沉澱，得濾液；
[0039] (3)取20ml的濾液加入到裝有大約5g弱酸性陽離子交換樹脂HD-2的100ml三角 瓶中，其中，濾液要浸過樹脂，並高於樹脂約3釐米，放置在搖床中，150r · min-1震蕩吸附 12h，，然後靜置0. 5h，過濾，將樹脂用適量蒸餾水衝洗4次，重新放入100ml三角瓶中，再加 入20ml0. lmol/L的HC1溶液，放置在搖床中，震蕩洗脫12小時。用lmol/L的NaOH溶液將 洗脫液的pH值調節至6. 5,然後用旋轉蒸發儀進行減壓蒸發濃縮，得濃縮液；
[0040] (4)在濃縮液中加入乙醇乙醚的混合液（體積比2:1)，不斷的向濃縮液中添加乙 醇乙醚的混合溶液，直至不在有沉澱析出，邊加混合液，邊震蕩，濃縮液與乙醇乙醚混合液 的體積比例大約為1:10。混勻，過濾除去液體，沉澱物即ε-聚L-賴氨酸，經檢測，其純度 達80 %，產量為0. 6克/L發酵液。
[0041] 實施例3· ε -聚L-賴氨酸的純化和檢測
[0042] 將實施例2所得的ε -聚L-賴氨酸溶於去離子水中，用G-250柱進行吸附解析， 可得純度超過98%的ε-聚L-賴氨酸，產量為0.42克/L發酵液。通過SDS-PAGE電泳，可 知該 ε _聚L-賴氨酸的分子量大約為3000Da。
[0043] 取實施例2所得的ε -聚L-賴氨酸用去離子水溶解，製成濃度為0. 1克/升的溶 液，進行濾紙片抑菌試驗，結果表明其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有明顯抑制作用， 如圖3a和3b所示。
[0044] 將實施例2所得的ε -聚L-賴氨酸存放於4°C冰箱中1個月後，分子量和抑菌性 能均沒有變化。
[0045] 實施例4
[0046] 使用DNA提取試劑盒進行菌種總DNA的提取。以菌種Ls2的總DNA為模板，上遊 引物 P1 :5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下遊引物 P2 :5' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，對 16SrDNA進行PCR擴增提取，然後進行瓊脂糖凝膠電泳，16SrDNA片段長度為1500bp左右， 結果如圖4所示。對膠進行回收純化後測序，結果表明，菌種Ls2的DNA為1462,具體如 SEQ ID No :1所示。BLAST檢索發現菌種Ls2與白色鏈黴菌基因組序列的同源性很高，達到 99%，結合形態學和生理生化性狀的鑑定結果，可以確認菌種Ls2為白色鏈黴菌。
[0047] SEQ ID Nol ：
[0048] 〈110>北京化工大學
[0049] 〈120>-種白色鏈黴菌及其應用
[0050] 1
[0051] 1
[0052] 1462
[0053] DNA
[0054] 〈213> 白色鏈黴菌（Streptomyces albus)
[0055] 1
[0056] CGGGGCTGCTCTTGTTCGACTTCGTCCAATCGCCAGTCCCACCTTCGACGATTCCCTCCCACAAGGGGT TGGGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCGTGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACC GCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCAACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGAC CGGCTTTTTGAGATTCGCTCCACCTCGCGGTATCGCAGCTCATTGTACCGGCCATTGTAGCACGTGTGCAGCCCAAG ACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCCTGTGAGTCCCCAT CACCCCGAAAGGCATGCTGGCAACACAGAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACG AGCTGACGACAGCCACGCACCACCTGTACACCGACCACAAGGGGGACCGTGTCTCCACGGTTTTCCGGTGTATGTCA AGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAGCCACATGCTCCGCTGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCT TTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGAACTTAATGCGTTTAGCTGCGGCACGGACGACGTGGATG TCCCCACACCTAGTTTCCCAACGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCRC TCCTACAGCGTCAGWATCGGCCCARAKATCCGCYTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATGTGCGCATTTCACCGCT ACACCAGGAAATCCGATCTCCCCTACCGAGCTCTAGCCTGCCCGTATCGAATGCAGACCCGGGGTTAAGCCCCGGGC TTTCACATCCGACGTGACAAGCCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTCGCGCCCTACGTAT TACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTC TGCAGGTACCGTCACTCTCGCTTCTTCCCTGCTGAAA GAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCC CACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCG TCGTCGCCTTGGTGAGCCACTACCTCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGGGCTCATCCTTCACCGCCGGAGCTTTCCA CACGGAGATCATGCGACCCCGTGTCATATCCGGTATTAGACCCCGTTTCCAGGGCTTGTCCCAGAGTGAAGGGCAGA TTGCCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTAATCCCCTCCCGAAGGAGGTTCATCGTCGACTGCATGGTAGACCCG CCACTGGT
【權利要求】
1. 一種白色鏈黴菌（Streptomyces albus) Ls2,其特徵在於，其保藏號為CGMCC NO. 8472。
2. 如權利要求1所述的白色鏈黴菌Ls2,其特徵在於，其在高氏一號固體培養基上單 細胞繁殖生長形成的菌落為白色絲狀，邊緣乾燥中央塌陷；鏡檢細胞為杆狀，無隔斷，長度 1. 0-3. Omm ;革蘭氏陰性；在20-40°C的溫度下均能生長，最適生長溫度為28-30°C ;生長pH 範圍為3. 0-9. 5,最適生長pH為6. 8-7. 2 ;需氧生長；碘化鉍鉀實驗生成橙紅色沉澱，甲基 橙實驗生成橙色沉澱；其中，所述高氏一號固體培養基的配方為：葡萄糖50份，氯化鈉0. 5 份，硝酸鉀1份，磷酸氫二銨0. 5份，硫酸鎂0. 5份，硫酸亞鐵0. 01份，硫酸銨0. 66份，硫酸 鋅〇. 01份，酵母膏〇. 1份，瓊脂粉15份和水1000份。
3. 如權利要求1或2所述的白色鏈黴菌Ls2在生產ε-聚L-賴氨酸中的應用。
4. 一種生產ε-聚L-賴氨酸的方法，其包括如下步驟： (1) 將如權利要求1或2所述的白色鏈黴菌Ls2的試管種接種於液體搖瓶發酵培養基 中，培養溫度為28-30°C，培養時間為2-3天，獲得發酵液，在培養過程中無需調節pH值； 其中，液體搖瓶發酵培養基的組成以重量份計為： 酵母膏5份，葡萄糖50份，硫酸銨10份，硫酸亞鐵0. 03份，硫酸鎂0. 5份，硫酸鋅0. 04 份，磷酸氫二鉀〇. 8份，磷酸二氫鉀1. 36份，和水1000份； 製備液體搖瓶發酵培養基的方法為：稱取酵母膏、硫酸銨、硫酸亞鐵、硫酸鎂、硫酸鋅、 磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀放入水中，充分混勻後將pH值調節至6.8,121°C溼熱滅菌20分鐘， 然後再加入經單獨滅菌的葡萄糖水溶液，混勻冷卻後備用； (2) 將發酵液離心，取上清液用lmol/L的NaOH溶液將其pH值調節至8,靜置0. 5h後 用濾紙過濾去除沉澱，得濾液； (3) 用弱酸性陽離子交換樹脂HD-2對濾液進行震蕩吸附8-16h，其中，濾液浸過樹脂並 高於樹脂約3釐米，靜置0. 5-lh後過濾，將樹脂用蒸餾水衝洗3-5次，然後用0. lmol/L的 HC1溶液對樹脂進行震蕩洗脫8-16h，靜置0. 5-lh後過濾，用lmol/L的NaOH溶液將洗脫液 的pH值調節至6. 5,然後減壓濃縮得濃縮液； (4) 在濃縮液中加入乙醇乙醚體積比為2:1的混合液，其中，濃縮液與乙醇乙醚混合液 的體積比大約為1:10,混勻，過濾除去液體，沉澱即ε-聚L-賴氨酸。
【文檔編號】C12P13/02GK104120095SQ201410216869
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年5月21日 優先權日:2014年5月21日
【發明者】羅施中, 劉欣, 高紅柳, 陳慧 申請人:北京化工大學