基質濃度的測定方法和其裝置的製作方法

2023-09-19 05:40:55

專利名稱：基質濃度的測定方法和其裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及測定基質濃度的方法和用於其的裝置(生物傳感器)。
背景技術：
生物傳感器是將下述裝置作為變換器(transducer)來測定基質的傳感器，所述 裝置通過生物體催化劑利用生物體催化劑的反應而與作為基質的化合物反應，由此可以檢 測生物體催化劑反應的結果所產生的產物、減少的基質、與產物反應而生成的化學物質。或 者，是指將可檢測生物體催化劑反應的結果所產生的光、色調變化、螢光等物理信號的裝置 作為變換器來測定該基質的傳感器。生物體催化劑可以列舉酶、細胞器、細胞、微生物等。
S卩，生物傳感器是指下述那樣的傳感器，S卩，使用生物體催化劑作為分子識別元 件，通過使其信號與電化學裝置、光裝置、熱檢測裝置等的變換器組合，將生物體催化劑的 反應變換為電子儀器可檢測的信號，從而能夠分析生物體催化劑可識別的基質。代表性的 生物傳感器之一是以酶作為生物體催化劑的酶傳感器。例如為了測定葡萄糖(glucose)，開 發了葡萄糖傳感器，其以下述為指標，即，氧化葡萄糖的酶固定在氧電極、過氧化氫電極等 電極表面上，電化學地測定由葡萄糖氧化反應消耗的氧量，同時測定生成的過氧化氫量。目前多使用的酶傳感器以使用了氧化還原酶的傳感器為主流，其主要原理基於下 述方法，即，利用電流計或者利用在陰極還原時陽極與陰極之間產生的電位差來測定下述 那樣產生的電子，所述電子是從外部對於由陽極的酶反應生成的還原物質施加電位，將其 再氧化時所產生的電子。另外，作為在簡易血糖診斷裝置等中使用的方法，也可以採用按照常規方法使由 酶反應產生的過氧化氫或還原型人工電子受體等還原物質生色，並通過光學傳感器判斷其 色彩的方法。作為其它特殊酶的例子，就採用螢火蟲等發光生物來源的酶、螢光素酶作為酶的 酶傳感器而言，還報導了以下述為特色的酶傳感器對螢光素酶的基質反應時由酶反應產 生的光進行檢測。但是，對於該方法，受限於作為螢光素酶基質的物質、例如ATP的檢測，或 者受限於可採用下述原理等的應用例使用螢光素酶的情況，所述原理是在檢測抗體反應時 通過用螢光素酶標記抗體而間接地用光信號進行檢測的原理。非專利文獻1 =Katz et al.，J. Am. Chem. Soc. 2001，123，10752-1075
發明內容
在以上現有的生物傳感器中，使用了酶傳感器等生物傳感器的測定儀器(以下稱 作為酶傳感器系統)由基於生物傳感器的測定部和接收測定信號並對其進行處理的監控 部而構成，主流是將它們一體化，或者如可見於個體血糖診斷裝置那樣的使相當於測定部 的部分可分離以便用完即扔的類型。並且，檢測基質濃度的測定部和檢測生物傳感器信號 的監控部存在下述那樣的問題，即，必須與生物體催化劑反應的場所直接接觸、或連線，或 者必須另外準備起動特殊發送器的電路和用於其的電源。
另一方面，迄今為止雖報導了以酶燃料電池的電動勢為指標的酶傳感器，但該 燃料電池單體的電動勢小於IV，因此不能直接利用燃料電池的電動勢使傳感用裝置運 轉。當以燃料電池型酶傳感器的電動勢作為指標測定基質濃度時，需要將該電動勢直接 與電壓計連接，通過測定電壓來測定基質濃度，或者需要連接測定該電動勢的電壓計，將 電壓計的應答值通過由外部電源起動的無線裝置發射到外部接收機上。(參考「A Novel Wireless Glucose Sensor Employing DirectElectron Transfer Principle Based Enzyme Fuel Cell，，Noriko Kakehi，Tomohiko Yamazaki,Wakako Tsugawa and Koji Sode Biosensors&Bioelectronics Epub 2006 Dec.11)S卩，儘管燃料電池型酶傳感器是小型的且具有高性能傳感能力的傳感器，但若欲 以無線方式將其信號埋入或組裝在生物體中，用無線檢測時，如果不使用新的電源，則不能 讀出燃料電池型酶傳感器的數據。因此，為了增加酶燃料電池的電動勢，可考慮串聯連接酶 燃料電池，由此使電動勢對應於電池數目而增加，但當以生物體內的發電或生物體內監控 為目標時，在生物體內配置串聯接接的酶燃料電池的方式，作為裝置是複雜的，另外，還存 在有電極變得大型化的問題，不能實用。因此，在本發明中，提出了將酶等生物體催化劑反應的結果所生成的能量進行蓄 積，以該蓄積的速度、或者暫時蓄積的能量釋放時的頻率作為指標來進行測定的方案。艮口， 在本發明中，著眼於由依賴於基質濃度的生物體催化劑的反應生產一定的能量時，其生產 速度依賴於基質濃度的事實，對下列事實進行了利用將蓄積的能量規定在一定水平，如果 在該能量蓄積到一定水平時釋放該能量，則其釋放頻率依賴於生物體催化劑的基質濃度。 本發明提出了通過測定該釋放頻率來測定生物體催化劑的基質濃度的方案。特別地，通過使酶等的生物體催化劑與裝備了下述那樣電路的裝置組合而可提供 基質濃度的測定方法和用於其的裝置，所述電路是利用放電的電量而產生信號的電路，所 述放電是將作為生物體催化劑反應的結果所產生的能量的電能在電容器中蓄積至一定水 平而進行的放電。另外，通過與由蓄積於電容器中的電能而產生光、聲波、電磁波等的電路進行組 合，由傳感器產生的信號可以容易地利用非接觸的監控部側的信號檢測裝置接收，因而可 使監控部與測定部分離。這樣，由於測定部與監控部的分離變得可能，故測定側能夠進一步 的小型化，對於移動或體內安裝·嵌入型傳感器極為有利。進而，在本發明的其它側面，提供將由酶反應產生的電能蓄積在電容器中，利用其 電動勢起動無線裝置而可將其信號發射至外部接收機的新型無線酶傳感器的電路。即，提 供可用酶燃料電池的電動勢以無線的方式發射同傳感器(力 >一)信號的、不需要電源的 自動式無線酶傳感器。另外，對於本發明的裝置，與目前的電位測定等不同，在超過無線發 射裝置的起動電位時，無線信號可以在接收側檢測，基於此，可以提供以無線發射裝置的起 動頻率為指標來測定所述基質濃度的裝置。本發明的構成如下所示。(1)測定基質濃度的方法，其特徵在於，將生物體催化劑與識別該生物體催化劑的 基質反應的結果所產生的能量蓄積至一定水平，該蓄積速度依賴於基質濃度，以此為指標 進行測定。(2)根據上述(1)所述的方法，其特徵在於，前述指標通過前述能量達到一定水平以上而釋放之際的一定時間內的能量釋放頻率來進行測定。(3)根據上述(1)或(2)所述的方法，其特徵在於，前述生物體催化劑是酶、細胞 器、微生物、細胞。(4)根據上述⑴ (3)中任一項所述的方法，其特徵在於，前述生物體催化劑催化的反應是氧化反應。(5)根據上述(3)所述的方法，其特徵在於，前述生物體催化劑是酶。(6)根據上述(5)所述的方法，其特徵在於，前述酶是氧化還原酶。(7)根據上述(1) (6)中任一項所述的方法，其特徵在於，將蓄積的能量作為電 荷蓄積到電容器中。(8)測定基質濃度的裝置，其是具有燃料電池、電容器和測定器的裝置，所述燃料 電池具有設置了生物體催化劑的基質的陽極和設置了外部電子受體的陰極，所述電容器串 聯連接於前述燃料電池，所述測定器以前述電容器的充電速度為指標進行測定，該裝置的 特徵在於，通過將由前述基質與生物體催化劑反應而產生的電子轉移至前述陰極的前述外 部電子受體而生成電動勢，將該電動勢充電至前述電容器，利用前述測定器測定其充電速 度。(9)根據上述(8)所述的裝置，其特徵在於，前述測定器是充電至前述電容器的電 位達到一定水平以上時將該蓄積的電位放電，從而測定前述放電的頻率的裝置。(10)根據上述⑶或(9)所述的裝置，其特徵在於，進一步具有電荷泵，該電荷泵 用於在向前述電容器充電時，升高基於前述生物體催化劑反應的電動勢，而向前述電容器 充電。(11)根據上述(9)或(10)所述的裝置，其特徵在於，前述測定器是具有利用來自 電容器的放電而產生信號的信號發生電路，並測定前述信號的頻率的測定器。(12)根據上述(11)所述的裝置，其特徵在於，前述信號發生電路是無線發射裝置。(13)根據上述(11)或(12)所述的裝置，其特徵在於，前述測定器測定前述信號發 生電路工作時產生的物理信號和/或化學信號。(14)根據上述(13)所述的裝置，其特徵在於，前述物理信號和/或化學信號是聲 波、光或電磁波。(15)根據上述(11) (14)中任一項所述的裝置，其特徵在於，前述測定器進一 步具有接收機，所述接收機用於接收前述電容器由充電而超過前述無線發射機的起動電壓 時，因前述電容器的放電而產生的信號。(16)根據上述⑶ (15)中任一項所述的裝置，其特徵在於，設置於前述陽極的 生物體催化劑是酶。(17)根據上述(16)所述的裝置，其特徵在於，前述酶是氧化還原酶。(18)根據上述(16)所述的裝置，其特徵在於，前述酶是催化葡萄糖氧化的酶。可以使用酶、細胞器、細胞、微生物等作為本發明中使用的生物體催化劑，另外，其 催化的反應期望是測定對象的氧化還原反應。酶可以使用各種氧化還原酶，可以列舉例如 以FAD為輔酶的醇、葡萄糖、膽固醇、果糖胺(fructosyl amine)、甘油、尿酸的氧化酶；以 FAD為輔酶的醇、葡萄糖、甘油的脫氫酶；以PQQ為輔酶的醇、葡萄糖、甘油的脫氫酶等。特別地，當以葡萄糖為測定對象時，期望葡萄糖氧化酶或以FAD或PQQ為輔酶的葡萄糖脫氫 酶。其可以是從產生該酶的微生物、細胞分離精製而成的酶，也可以是大腸菌等中重組生產 的酶。 另外，本發明中使用的生物體催化劑即使不是酶單體，但如果可在陽極氧化基質， 並將其電子傳輸至適當的電子受體或直接傳輸至電極，則也可以是含有酶的膜、含有酶的 細胞器、含有酶的細胞，只要通過這些酶反應以及與其共軛的多個酶的反應結果可以實現 上述基質的氧化反應，就可以使用。作為使用本發明的酶來產生電能的方法，可以採用酶燃料電池。即下述酶燃料電 池，其特徵在於將氧化酶或脫氫酶固定在陽極上。此時，當使用膽紅素氧化酶那樣還原氧的酶作為陰極時，或者可以使用組合了適 當的電子受體的電極。或者，可以使用鉬或含有鉬的無機催化劑等具有氧還原能力的催化 劑。另外，陽極可以認為是同時含有酶和電子受體的構成。即，可以使用下述那樣的構 成將由酶反應得到的電子傳遞給人工電子受體，使其在電極上氧化。或者，在陽極，電子傳 遞亞單元上具有細胞色素的酶等、與電極直接進行電子轉移的脫氫酶等可以不添加人工電 子受體而構成阻極。阻極和陰極的電極材料可以使用填充或塗布了碳粒子的電極、碳電極、 金電極、鉬電極等。陽極或陰極的人工電子受體沒有特別地限定，可以使用鋨配位化合物、釕配位化 合物、吩嗪硫酸甲酯和其衍生物、醌系化合物等。陰極用酶沒有特別地限定，可以應用膽紅素氧化酶或漆酶。陰極的人工電子受體 沒有特別地限定，可以使用鐵氰化鉀、ABTS等。陽極用酶可以使用各種氧化酶或脫氫酶。特別是以葡萄糖作為測定對象時，可以 使用葡萄糖氧化酶、以PQQ或FAD為輔酶的葡萄糖脫氫酶。在本發明中，作為將酶安裝在電極上的方法，可以將其直接與碳糊等的電極材料 混合來使用。或者可以使用一般的酶固定化方法調製成固定化酶後安裝在電極上。可以列 舉例如在將兩者混合後用戊二醛等的二交聯性試劑進行交聯處理的方法，和在光交聯性聚 合物、導電性聚合物或氧化還原聚合物等合成聚合物或天然高分子基質中進行包埋固定的 方法。將下述那樣的混合物安裝在由碳或金、或鉬等構成的電極上，所述混合物是在將上 述調製的混合蛋白質與碳粒子混合、或者與由碳粒子構成且以易於與酶交合的方式存在的 碳糊進行混合後，進而通過交聯處理來調製的。碳粒子可以使用比表面積從10m2/g左右至 500m2/g以上、更優選800m2/g以上的碳粒子。例如，前者可以列舉作為市售品的力>， 後者可以列舉科琴黑等。進而，當如此在電極上安裝酶時，也可以同時固定人工電子受體。典型地，將以FAD 為輔酶的葡萄糖脫氫酶、FADGDH和甲氧基吩嗪硫酸甲酯(mPMS)混合，並將其進而與碳糊混 合後進行冷凍乾燥。將其安裝在碳電極上，在該狀態下浸入戊二醛水溶液，將蛋白質交聯， 製成酶電極。 對於酶燃料電池，在陽極電極上固定以測定對象為基質的氧化或脫氫酶。在陰極 上固定氧還原酶。將這樣製成的電極作為陽極和陰極用電極，陽極可以例如以m-PMS為人 工電子受體，而陰極例如能夠以ABTS為人工電子受體。
通過將這樣製成的利用酶反應產生電能的部分連接在電容器上，可以將該電能蓄 電。即，基於由酶反應得到的電動勢，圖2所示的連接在電路中的電容器蓄電，直至電容器 的容量得到填充。因此，當利用相同基質濃度的溶液進行酶反應時，如果使用容量大的電容 器，則在充電結束前有較長的時間，相反如果使用容量小的電容器，則直到充電結束的時間 變短。或者當使用相同容量的電容器時，如果酶的基質濃度低，則電能每單位時間的生成量 少，因此直到充電結束的時間變長，如果基質濃度高，則相反直到充電結束的時間變短。即， 通過使電容器為一定的容量，充電所需要的時間根據酶的基質濃度而變化，因此通過以充 電所需要的時間(充電速度)為指標，可以測定基質濃度。即，預先記錄觀測到的充電所需 時間(充電速度)與基質濃度的相關性，以此為基礎製成校正曲線，可以由觀測的充電所需 要的時間來測定未知試樣的基質濃度。進而，在電容器上連接適當的電路，在充電結束時可以引發放電，從而測定每單位 時間的充電放電的頻率，由此也可以同樣地測定基質濃度。即，預先記錄觀測到的每單位時 間放電的頻率與基質濃度的相關性，以此為基礎製成校正曲線，由觀測的放電頻率可以測 定未知試樣的基質濃度。進而，如果利用連接在其上電路產生光、聲波或電磁波，則通過觀測該光、聲波或 電磁波，可以測定每單位時間觀測到的頻率、或觀測到的間隔，由此來測定基質的濃度。即， 預先記錄觀測的光、聲波或電磁發生所需要的時間或單位時間的頻率與基質濃度的相關 性，以此為基礎製成校正曲線，可以由觀測的光、聲波或電磁發生所需要的時間或單位時間 的頻率來測定未知試樣的基質濃度。另外，根據起動的電路，也可以適當地設定電容器的電位。即，通過使酶燃料電池 的電動勢與升壓電路組合，可以升高向電容器中充電的電壓，所述酶燃料電池使由酶反應 產生的電能作為電動勢而產生。對於該升壓，可以使用市售的電荷泵、或其IC電路。根據 組合的電荷泵的種類以及其數量，可以調節在電容器中蓄電的電壓，根據起動的信號發生 電路，可以設定電容器的電壓。電容器充電·放電的頻率如前述那樣依賴於電容器的容量以及基質的濃度。即， 只要基質濃度一定，則電容器容量越小，充放電的頻率越高，而如果電容器容量變大，則充 放電的頻率變低。另外，如果電容器容量一定，則充放電的頻率根據基質濃度而變化，基質 濃度低，則充放電的頻率變低，基質濃度越高，則充放電的頻率變高。例如，在電容器的兩端連接電壓系統，對其進行觀測，則如圖3所示。在該方式下， 使用葡萄糖濃度一定的試樣作為基質，採用催化葡萄糖脫氫化的酶作為酶，介由電荷泵將 由酶燃料電池產生的電動勢從酶燃料電池的0.3V升壓至1.8V，而對電容器進行充電。如 圖3所示，電容器的電壓以一定的間隔達到1. 8V,由酶反應產生的電能進行蓄電，可以觀察 其釋放的情形。此時，連接的、電容器的容量從0. 47 μ F改變至1 μ F時所觀測到的充放電 的間隔發生變化。即，在電容器容量為0.47yF時，其間隔為0.2秒(充放電頻率5次/秒 5Hz)，相對於此，在電容器容量為IyF時，為2. 4Hz，在10 μ F時，變化為0. 27Hz，在IOOyF 時，變化為0. 028Hz。進而，對使用IOyF的電容器、使葡萄糖濃度變化並向電容器充電的狀態進行觀察時，則葡萄糖濃度低時充放電間隔長，葡萄糖濃度高時充放電間隔短(參考圖4)。相反， 作為充放電頻率對其進行觀測時，則葡萄糖濃度低時充放電頻率低，葡萄糖濃度高時充放電頻率高。同樣，通過在該電路上連接根據電容器的充放電而產生信號的電路，可以觀測由 其產生的光、聲波或電磁波，由此同樣能夠測定基質濃度。例如，當連接發光二極體時，通過 觀察發光二極體發光的間隔或發光的頻率，可以測定基質濃度。如圖5所示，顯示葡萄糖濃度低時發光的間隔長，而葡萄糖濃度高時發光的間隔 短。相反，如果作為發光的頻率對其進行觀測，則顯示葡萄糖濃度低時發光頻率低，葡萄糖 濃度高時發光頻率高。另外，同樣在該電路中連接發生電磁波的共振電路時，通過觀察電磁波發射的間 隔或頻率，可以測定基質濃度。該情況下，葡萄糖濃度低時發射的電磁波間隔長，而葡萄糖 濃度高時間隔短。如果作為電磁波的發射頻率對其進行觀測，則葡萄糖濃度低時發射頻率 低，而葡萄糖濃度高時發信頻率高。由這種形式可知，當連接利用電容器的電容量以及電壓而起動的信號發射電路 時，不論由其發出的信號的種類、即光、聲波或電磁波，均可通過觀察其間隔和頻率來測定 酶反應的基質濃度。另外，顯然該酶不限於這裡所示的以葡萄糖為基質的脫氫酶，可以使用 各種氧化酶、脫氫酶。例如可以列舉以FAD為輔酶的醇、葡萄糖、膽固醇、果糖胺、甘油、尿酸 的氧化酶、以FAD為輔酶的醇、葡萄糖、甘油的脫氫酶、以PQQ為輔酶的醇、葡萄糖、甘油的脫 氫酶等。另外，觀看迄今為止使用了各種催化氧化還原反應的生物體催化劑的生物傳感器 的研究案例即可清楚地知道即使不是酶單體，但只要可在陽極氧化基質並將其電子傳送 至適當的電子受體或直接傳送至電極，則也可以是含有酶的膜、細胞器、細胞、微生物，只要 利用這些生物體催化劑反應的結果可以實現前述基質的氧化反應，就能夠使用。另外，作為其它的方式，可以使用在無線通信中使用的發射電路作為連接在電容 器上的信號發射電路。對於這些發射電路，為了啟動其電路，需要達到一定的電壓以上，當 電動勢低於其時，電路停止，從而發射停止。另外在一定的電壓以下不能起動。即，在電容器 上連接以1. 5V起動的無線發射電路，當對遠離該發射信號的接收系統進行觀察時，可以觀 察到與電容器的充放電相應的無線的發射。即，無線發射電路依賴於酶反應的基質濃度而 起動，信號被發射，酶基質濃度越低，其間隔越長，越高，其間隔越短，另外酶基質濃度越低， 信號的發射頻率越低，酶基質濃度越高，信號的發射頻率越高。因此，通過觀察接收的發射 記錄，可以測定酶的基質濃度。這樣的無線發射電路可以使用共振電路。另外該共振電路內的電容器還可以使用 容量可變的電容器。


[圖1]是表示本發明的基質測定方法和其裝置的模式圖。[圖2]是表示本發明中使用的電容器的電路圖。[圖3]表示本發明裝置的電容器的、由充電 放電的反覆導致的電壓變化。[圖4]表示電容器的充電頻率與葡萄糖濃度的關係。[圖5]表示發光二極體相對於葡萄糖濃度變化的發光間隔(時間)。[圖6A]表示電容器的充電所需要的時間(電阻100kQ)。[圖6B]表示電容器的充電所需要的時間(電阻500kQ)。
[圖6C]表示電容器的充電所需要的時間(電阻500kQ)。[圖7A]表示相對於葡萄糖濃度變化的、電容器充電所需要的時間(10kQ)。[圖7B]表示相對於葡萄糖濃度變化的、電容器充電所需要的時間(500kQ)。[圖8A]表示利用了酶燃料電池的電容器的電壓相對於時間的變化(0.47 y F)。[圖8B]表示利用了酶燃料電池的電容器的電壓相對於時間的變化(1P F)。[圖8C]表示利用了酶燃料電池的電容器的電壓相對於時間的變化(10yF)。[圖8D]表示利用了酶燃料電池的電容器的電壓相對於時間的變化(100yF)。[圖9]表示葡萄糖濃度變化時的信號頻率。[圖10]表示相對於葡萄糖濃度變化的、電容器達到1.8V時的時間的變化。[圖11]電容器每單位時間達到1.8V的頻率相對於葡萄糖濃度變化的相關性。[圖12]表示無線傳感器中觀察到的信號頻率與葡萄糖濃度的相關性(1.8V升 壓)。[圖13]表示無線傳感器中觀察到的信號頻率與葡萄糖濃度的相關性(2.4V升 壓)。[圖14]表示使用作為信號發射電路的共振電路作為發射機的計測 發射電路的 例子。[圖15]表示記錄使用圖14所示的發射電路而觀測到的電磁波的例子。[圖16]表示使用共振電路作為發射機的計測 發射電路的例子，所述共振電路使 用變容二極體作為信號發射電路。[圖17]記述了對使用圖16所示的發射電路而觀測到的電磁波的頻率和試樣葡萄 糖濃度進行計測的例子。
具體實施例方式以下，基於實施例來詳細地說明本發明，但本發明不限定於這些實施例。實施例1陽極的製作將科琴黑油墨10mL、100mM PPB (pH7. 0) 10mL 和 FADGDH 複合物溶液 40mL(l. 2U/ mL)進行混合，將其中50mL均勻塗布在lcm2的碳織物上，在4°C風乾3小時。通過將其在 室溫下在戊二醛溶液(10ml)中浸漬30分鐘，進行交聯處理。接著，通過將該碳織物在 10mM Tris-HCl(lOml)中浸漬20分鐘來除去未反應的戊二醛後，浸漬在lOOmM PPB (pH7. 0) (10ml)中進行1小時的平衡化，製作陽極。陰極的製作將擔載了鉬的碳墨10mL和lOOmM PPB (pH7. 0) 50mL混合，將其50mL均勻塗布在 碳織物上，在4°C風乾3小時。在其中滴加50mL由乙醇稀釋的3% (w/v)聚二甲基矽氧烷 (PDMS)，風乾一晚，將由此得到的物質作為陰極。電池和電路的構建使用製作的陽極、陰極，以含有20mM葡萄糖的lOOmM PPB(pH7. 0)作為反應溶液來 構建電池。將電池、可變電阻器、電容器、開關全部串聯連接來製作電路。對於這樣製成的電路，研究電容器充電時間。即，使用二種電容器(0. lmF、lmF)，在20mM的葡萄糖濃度下進行充電，對電容器所帶電壓和開關與電阻連接時流過電路的電流進 行測定，進行電容器的充電時間的研究。此時，電容器使用lmF的電容器且電阻為100k Q，500kW、1000k Q時的結果示於圖
6。開關打開的同時電流流過。另外，隨著時間經過電流減少，電容器所帶電壓增加。另外， 當改變電阻值，並減少或增加電流值時，與之相伴電容器的充電時間增加、減少。對於任何 的電阻，當由流過電路的電流值計算充電至電容器的電荷量時，與電容器的容量都大致一 致。另外，在使用0. lmF的電容器時，也可以得到同樣的結果，但與lmF相比，充電時間短。 即使使用酶燃料電池作為電源時，電容器也表現出充分的功能。使用同樣製成的電路來評價電容器充電時間的葡萄糖濃度依賴性。使用lmF的電 容，使電阻為10kw或500kW，測定電容器所帶電壓。此時，緩慢添加葡萄糖試樣使反應溶液 的葡萄糖濃度增加，研究各個葡萄糖濃度下的充電時間。其結果示於圖7。對於10kW、500kW，充電時間都伴隨著葡萄糖濃度的增加而減少。 對於500kW，在6mM左右的濃度下不能觀察到充電時間的減少，相對於此，對於10kW，直至 llmM的濃度可以觀察到電流值的增力口。由此可知，以向電容器充電的時間為指標，可以測定 酶的基質濃度。實施例2陽極的製作將科琴黑油墨10mL、100mM PPB (pH7. 0) 10mL 和 FADGDH 複合物溶液 40mL(4. 2U/ mL)進行混合，將其中300mL均勻塗布在6cm2的碳織物上，在4°C風乾3小時。通過將其在 室溫下在戊二醛溶液(10ml)中浸漬30分鐘，進行交聯處理。接著，通過將該碳織物在 10mM Tris-HCl(lOml)中浸漬20分鐘來除去未反應的戊二醛後，浸漬在lOOmM PPB (pH7. 0) (10ml)中進行1小時的平衡化，製作陽極。陰極的製作將擔載了鉬的碳墨60mL和lOOmM PPB (pH7. 0) 300mL混合，將其中300mL均勻塗布 在碳織物6cm2上，在4°C風乾3小時。在其中滴加300mL由乙醇稀釋的3% (w/v)聚二甲 基矽氧烷(PDMS)，風乾一晚，將由此得到的物質作為陰極。電池和電路的構建使用製作的陽極、陰極，以lOOmM PPB(pH7. 0)作為反應溶液構建電池。將該燃料電 池與可從0. 3V升壓至1.8V的電荷泵(升壓IC;S-882Z18七〗- 一〗義社制)組合， 來構建如圖1所示的電路。另外連接橙色發光二極體作為信號發生電路，進而連接0.47 lOOmF的各種電容器。測定電容器所帶電壓以及發光二極體的發光間隔和頻率，進行充放電 循環的評價。#用升壓IC的申i各的構建禾ng於申,容器容射言號步頁率的i平價本電路用酶燃料電池起動，對此以發光二極體的閃爍、或電容器電壓的經時變化 來評價。另外，對將電容器更換為0.47 lOOmF時所得的信號頻率的不同進行評價。反應 溶液的葡萄糖濃度定為20mM。此時的電容器的電壓經時變化示於圖8。在使用0.47mF的電容器時，以每一秒5 次的頻率(5/s)觀測到脈衝y 「)上的信號。另外，以同樣的周期觀察到二極體的 閃爍。改變電容器的容量，結果信號的頻率變化，周期分別是lmF為2. 4/s, 10mF為0. 27/s，100mF為0. 028/s。通過使電容器的容量變小，可以增加信號的頻率。 電容器充放電循環的葡萄糖濃度依存性作為使作為酶基質的葡萄糖的濃度變化，用發光二極體的閃爍、或電容器電壓的 經時變化來評價此時得到的信號頻率的電容器，使用容量為10mF的電容器。其結果示於圖 9。隨著葡萄糖濃度增高，電容器達到最大電壓的時間變短，另外可以觀察到每單位時間達 到峰電壓的頻率增加。以該結果為基礎，可以得到葡萄糖濃度和LED的閃爍、即電容器達到1.8V的時間(圖10)和每單位時間的LED的閃爍次數、即電容器每單位時間達到1. 8V的頻 率(圖11)。如這些曲線所示，由所得的曲線可知LED的閃爍、即電容器達到1. 8V的時間和 每單位時間的LED的閃爍次數、即電容器每單位時間達到1. 8V的頻率存在葡萄糖濃度依賴 性。由此可知，通過以信號頻率作為指標，可以測定葡萄糖濃度，能夠構建利用了電容器的 充放電的新型生物傳感器。基於升壓的酶燃料電池的無線系統的起動使用製作的陽極、陰極，以lOOmM PPB(pH7. 0)作為反應溶液構建電池。將該燃料 電池與可從0. 3V升壓至1.8V的電荷泵(升壓IC;S-882Z18七〗- 一〗義社制)或 可從0. 3V升壓至2. 4V的電荷泵(升壓IC ；S-882Z24七〗-一〗> ^ 〃義社制)組合，來 構建如圖1所示的電路，形成信號發生電路，並連接無線系統發射機(紅外線發射)。即，將 無線發射機的電源部分連接在圖1的信號發生電路上，利用在電容器充電時放電的電壓起 動無線發射系統，以此為指標構建生物傳感器。反應溶液的葡萄糖濃度定為0 25mM。其結果是在葡萄糖的存在下，起動無線系統發射機，以一定的間隔向接收機發送 信號。圖12表示在1. 8V升壓中觀察到的信號頻率與葡萄糖濃度的相關性，圖13表示在
2.4V升壓中觀察到的信號頻率與葡萄糖濃度的相關性。這樣，對於任意的升壓，信號的接收 頻率都與葡萄糖濃度相關，通過監控該頻率可以計測葡萄糖濃度。在任何情況下，可計測的 葡萄糖濃度都涵蓋了足夠的範圍，以計測從0. 5mM至20mM這樣的糖尿病的血糖值，能夠充 分地應用到以連續血糖診斷裝置為代表的血糖診斷裝置中。由此可知，通過使用充電至電容器中的酶反應的結果所蓄積的電動勢，可以起動 無線系統。因此，在本新型生物傳感器中，可以應用無線發射機作為信號發射電路。使用共振電路作為發射機的計測 發射電路的構建構建與實施例1同樣製作的燃料電池，並在其中組合10 iiF電容器、從0.3升壓至 1. 8V的升壓IC，構建生物電容器，將生物電容器的輸出連接在兩端作為電源，製作哈脫萊 (Hartley)型發射電路。使用這種發射機，也可以通過接收電路測定電磁波的接收頻率。其 結果是在葡萄糖的存在下，如圖15所記述的那樣，觀測到以一定的間隔接收到電磁波。該 電磁波的接收頻率依賴於葡萄糖濃度，這可以從以上記述中清楚地知道。將使用變容二極體的共振電路用作發射機的計測 發射電路的構津構建與實施例1同樣製作的燃料電池，並在其中組合0.47 yF電容器、從0.3升壓 至1.8V的升壓IC，構建生物電容器，將生物電容器的輸出連接在變容二極體(lsV149)的兩 端作為電源，製作哈脫萊型發射電路。使用這種發射機，也可以通過接收電路測定電磁波的 接收頻率。圖17記述了使用該發射電路來計測觀測到的電磁波頻率和試樣葡萄糖濃度的 例子。如此可以使用本電路來測定葡萄糖濃度。
權利要求
測定基質濃度的方法，其特徵在於，將生物體催化劑與識別該生物體催化劑的基質的反應結果所產生的能量蓄積至一定水平，該蓄積速度依賴於基質濃度，以此為指標進行測定。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，前述指標通過前述能量達到一定水平以 上而釋放之際的一定時間內的能量釋放頻率來進行測定。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，前述生物體催化劑是酶、細胞器、微生 物、細胞。
4.根據權利要求1 3中任一項所述的方法，其特徵在於，前述生物體催化劑催化的反應是氧化反應。
5.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，前述生物體催化劑是酶。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，前述酶是氧化還原酶。
7.根據權利要求1 6中任一項所述的方法，其特徵在於，將蓄積的能量作為電荷蓄積 到電容器中。
8.測定基質濃度的裝置，其是具有燃料電池、電容器和測定器的裝置，所述燃料電池具 有設置了生物體催化劑的基質的陽極和設置了外部電子受體的陰極，所述電容器串聯連接 於前述燃料電池，所述測定器以前述電容器的充電速度為指標進行測定，該裝置的特徵在 於，通過將由前述基質與生物體催化劑反應而產生的電子轉移至前述陰極的前述外部電子 受體而生成電動勢，將該電動勢充電至前述電容器，利用前述測定器測定其充電速度。
9.根據權利要求8所述的裝置，其特徵在於，前述測定器是充電至前述電容器的電位 達到一定水平以上時將該蓄積的電位放電，從而測定前述放電的頻率的裝置。
10.根據權利要求8或9所述的裝置，其特徵在於，進一步具有電荷泵，該電荷泵用於在 向前述電容器充電時，升高基於前述生物體催化劑反應的電動勢，而向前述電容器充電。
11.根據權利要求9或10所述的裝置，其特徵在於，前述測定器是具有利用來自電容器 的放電而產生信號的信號發生電路，並測定前述信號的頻率的測定器。
12.根據權利要求11所述的裝置，其特徵在於，前述信號發生電路是無線發射裝置。
13.根據權利要求11或12所述的裝置，其特徵在於，前述測定器測定前述信號發生電 路工作時產生的物理信號和/或化學信號。
14.根據權利要求13所述的裝置，其特徵在於，前述物理信號和/或化學信號是聲波、 光或電磁波。
15.根據權利要求14所述的裝置，其中，前述物理信號是電磁波，前述電磁波的發射電 路中使用變容二極體。
16.根據權利要求11 15中任一項所述的裝置，其特徵在於，前述測定器進一步具有 接收機，所述接收機用於接收前述電容器因充電而超過前述無線發射機的起動電壓時，由 前述電容器的放電而產生的信號。
17.根據權利要求8 16中任一項所述的裝置，其特徵在於，設置於前述陽極的生物體 催化劑是酶。
18.根據權利要求17所述的裝置，其特徵在於，前述酶是氧化還原酶。
19.根據權利要求17所述的裝置，其特徵在於，前述酶是催化葡萄糖氧化的酶。
全文摘要
本發明提供測定基質濃度的方法和用於其的裝置，該方法是將生物體催化劑與識別該生物體催化劑的基質反應的結果所產生的能量蓄積至一定水平，該蓄積速度依賴於基質濃度，以此為指標進行測定的方法。特別地，提供通過蓄積在電容器中的能量達到一定水平以上而釋放之際的一定時間內的能量釋放頻率來測定蓄積速度的方法和其裝置。
文檔編號G01N27/327GK101802601SQ200880107700
公開日2010年8月11日 申請日期2008年9月18日 優先權日2007年9月18日
發明者早出廣司, 津川若子 申請人:究極酵素國際股份有限公司