免疫球蛋白嵌合單體-二聚體雜合體的製作方法

2023-09-19 05:34:15

專利名稱：免疫球蛋白嵌合單體-二聚體雜合體的製作方法
技術領域：
本發明主要涉及由兩條多肽鏈組成的治療性嵌合蛋白，其中第一鏈由治療性生物活性分子組成，第二鏈不由第一鏈的治療性生物活性分子組成。更具體的說，本發明涉及由兩條多肽鏈組成的嵌合蛋白，其中兩條鏈都由至少一部分免疫球蛋白恆定區組成，其中第一鏈被修飾成進一步包含生物活性分子，而第二鏈沒有被如此修飾。因此，本發明涉及為單體-二聚體雜合體的嵌合蛋白，即具有二聚體方面和單體方面的嵌合蛋白，其中二聚體方面涉及如下事實，即嵌合蛋白由兩條多肽鏈組成，每條鏈由一部分免疫球蛋白恆定區組成， 而單體方面涉及如下事實，即兩條鏈中只有一條鏈由治療性生物活性分子組成。

圖1闡明了單體-二聚體雜合體的一個實例，其中生物活性分子是促紅細胞生成素(EPO)，免疫球蛋白恆定區部分是IgG Fc區。
背景技術：
免疫球蛋白由四條多肽鏈組成，其中兩條是重鏈，另兩條是輕鏈，它們通過二硫鍵結合，形成四聚體。每條鏈還由一個可變區和一個恆定區組成。可變區介導抗原識別與結合，而恆定區特別是重鏈恆定區介導多種效應子功能，例如補體結合和Fc受體結合(參見例如美國專利 6，086，875 ；5，624，821 ；5，116，964)。恆定區還由表示為CH(恆定區重鏈)結構域(CH1、CH2等)的結構域組成。取決於同種型(即IgG、IgM、IgA、IgD、IgE)，恆定區可由三個或四個CH結構域組成。一些同種型 (例如 IgG)恆定區還包含鉸鏈區(Janeway 等，2001，Immunobiology，Garland Publishing, N. Y.，N. Y.)。已有文獻描述了由目的蛋白或其片段與免疫球蛋白恆定區連接組成的嵌合蛋白的構建(參見例如美國專利 5，480，981 和 5，808，029 ；Gascoigne 等，1987，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :2936 ；Capon 等，1989，Nature 337 :525 ；Traunecker 等，1989，Nature 339 68 ；Zettmeissl 等，1990，DNA Cell Biol.USA 9 347 ；Byrn 等，1990，Nature 344 667 ；Watson 等，1990，J. Cell. Biol. 110 :2221 ；Watson 等，1991，Nature349 :164 ；Aruffo 等，1990，Cell 61 :1303 ；Linsley 等，1991，J. Exp. Med. 173 :721 ；Linsley 等，1991，J. Exp. Med. 174 :561 ；Stamenkovic 等，1991，Cell 66 :1133 ；Ashkenazi 等，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 :10535 ；Lesslauer 等，1991，Eur. J. Immunol. 27 :2883 ；Peppel 等，1991， J. Exp. Med. 174 :1483 ；Bennett 等，1991，J. Biol. Chem. 266 :23060 ；Kurschner 等，1992， J. Biol. Chem. 267 :9354 ；Chalupny 等，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10360 ；Ridgway和 Gorman, 1991，J. Cell Biol. 115，摘要號 1448 ；Zheng 等，1995，J. Immun. 154 :5590)。這些分子通常具有與所連接的目的分子相關的生物活性以及效應子功能，或者某些與免疫球蛋白恆定區相關的其他合乎需要的特性(例如生物穩定性、細胞分泌)。取決於免疫球蛋白的同種型，免疫球蛋白恆定區的Fc部分可包括CH2、CH3和CH4 結構域以及鉸鏈區。包含免疫球蛋白Fc部分的嵌合蛋白賦予嵌合蛋白某些合乎需要的性質，包括穩定性提高、血清半壽期提高(參見Capon等，1989，Nature 337 :525)以及與 Fc 受體如新生 Fc 受體(FcRn)的結合(美國專利 6,086,875,6,485, 726,6,030,613 ；WO 03/077834 ；US2003-0235536A1)。Fcfoi活躍於成人上皮組織中，並表達於腸內腔、肺氣道、鼻表面、陰道表面、結腸和直腸表面(美國專利6，485，726)。包含Fcfoi結合配偶體(如IgG、Fc片段)的嵌合蛋白通過Fcfoi能有效地穿過上皮屏障，從而提供了全身性給予所需治療性分子的非侵入性方法。 另外，包含Fcfoi結合配偶體的嵌合蛋白被表達Fcfoi的細胞所胞吞。但是這些嵌合蛋白不是被標記進行降解，而是被再循環到體內循環中，從而增加這些蛋白的體內半壽期。免疫球蛋白恆定區各部分(例如Fcfoi結合配偶體)通常通過二硫鍵和其他非特異性相互作用互相結合形成二聚體和更高等級的多聚體。本發明部分基於這樣的意外發現，即包含Fcfoi結合配偶體的嵌合蛋白的胞轉作用似乎受限於嵌合蛋白的分子量，分子量較高的蛋白轉運效率較低。一旦給予包含生物活性分子的嵌合蛋白，其通常會與靶分子或細胞發生相互作用。本發明還部分基於這樣的意外發現，即只有一個生物活性分子、但有兩個免疫球蛋白恆定區部分(例如兩個FcfoI結合配偶體)的單體-二聚體雜合體比同源二聚體(在本文中也簡稱「二聚體」)或具有兩個或更多個生物活性分子拷貝的更高等級多聚體能更有效地發揮功能和被轉運。這在部分上是由於這樣一個事實，即包含兩個或多個生物活性分子、以二聚體和更高等級的多聚體形式存在的嵌合蛋白，由於存在兩個或多個相互鄰近的生物活性分子，且生物活性分子對其本身具有很高的親合性，在空間上會被阻礙與其靶分子或細胞發生相互作用。因此，本發明的一個方面提供可被轉運穿過上皮屏障的包含生物活性分子的嵌合蛋白。本發明的另一方面提供包含至少一個能與其靶分子或細胞發生相互作用、而又少有或沒有位阻或自身聚集作用的生物活性分子的嵌合蛋白。本發明各方面提供了包含第一和第二多肽鏈的嵌合蛋白，第一鏈包含至少一部分免疫球蛋白恆定區，其中免疫球蛋白恆定區部分已被修飾成包括生物活性分子，第二鏈包含至少一部分免疫球蛋白恆定區，其中免疫球蛋白恆定區部分沒有同樣被修飾成包括第一鏈的生物活性分子。發明概述本發明涉及包含一個生物活性分子和兩個免疫球蛋白恆定區至少一部分分子的嵌合蛋白。所述嵌合蛋白與由至少兩個生物活性分子和至少兩個疫球蛋白恆定區的一部分組成的嵌合蛋白相比，能夠以較小的位阻與靶分子或細胞發生相互作用。本發明還涉及包含至少一個生物活性分子和兩個免疫球蛋白恆定區至少一部分分子的嵌合蛋白，所述嵌合蛋白比相應的同源二聚體(即其中兩條鏈連接到同一個生物活性分子上)能更有效地轉運穿過上皮屏障。因此，本發明涉及包含連接在一起的第一和第二多肽鏈的嵌合蛋白，其中所述第一鏈包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恆定區，所述第二鏈包含至少一部分免疫球蛋白恆定區，但不含免疫球蛋白可變區並不連接有任何生物活性分子。本發明涉及包含連接在一起的第一和第二多肽鏈的嵌合蛋白，其中所述第一鏈包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恆定區，所述第二鏈包含至少一部分免疫球蛋白恆定區，但不含免疫球蛋白可變區或任何生物活性分子，且其中所述第二鏈不與分子量大於lkD、2kD、5kD、10kD或20kD的任何分子共價連接。在一個實施方案中，第二鏈不與分子量大於0-2kD的任何分子共價連接。在一個實施方案中，第二鏈不與分子量大於5-10kD的任何分子共價連接。在一個實施方案中，第二鏈不與分子量大於15-20kD的任何分子共價連接。本發明涉及包含連接在一起的第一和第二多肽鏈的嵌合蛋白，其中所述第一鏈包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恆定區，所述第二鏈包含至少一部分免疫球蛋白恆定區，所述部分不與除所述第一多肽鏈免疫球蛋白部分之外的任何其他分子共價連接。本發明涉及包含連接在一起的第一和第二多肽鏈的嵌合蛋白，其中所述第一鏈包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恆定區，所述第二鏈由至少一部分免疫球蛋白恆定區和任選的親合標記物組成。本發明涉及包含連接在一起的第一和第二多肽鏈的嵌合蛋白，其中所述第一鏈包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恆定區，所述第二鏈基本由至少一部分免疫球蛋白恆定區和任選的親合標記物組成。本發明涉及包含連接在一起的第一和第二多肽鏈的嵌合蛋白，其中所述第一鏈包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恆定區，所述第二鏈包含至少一部分免疫球蛋白恆定區，但不含免疫球蛋白可變區或任何生物活性分子，任選包含分子量小於10kD、5kD、 2kD或IkD的分子。在一個實施方案中，第二鏈包含分子量小於15-20kD的分子。在一個實施方案中，第二鏈包含分子量小於5-10kD的分子。在一個實施方案中，第二鏈包含分子量小於l-2kD的分子。本發明涉及包含第一和第二多肽鏈的嵌合蛋白，其中所述第一鏈包含生物活性分子、至少一部分免疫球蛋白恆定區和至少第一結構域，所述第一結構域具有至少一種特異性結合配偶體，其中所述第二鏈包含至少一部分免疫球蛋白恆定區和至少第二結構域，但不含任何免疫球蛋白可變區或生物活性分子，其中所述第二結構域是所述第一結構域的特異性結合配偶體。本發明涉及製備包含第一和第二多肽鏈的嵌合蛋白的方法，其中所述第一多肽鏈和第二多肽鏈不相同，所述方法包括用包含編碼第一多肽鏈(包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恆定區)的DNA分子和任選接頭的第一 DNA構建物，及包含編碼第二多肽鏈(包含至少一部分免疫球蛋白恆定區，但不含任何生物活性分子或免疫球蛋白可變區) 的DNA分子和任選接頭的第二 DNA構建物轉染細胞；在第一 DNA構建物編碼多肽鏈得以表達和第二 DNA構建物編碼多肽鏈得以表達的條件下培養細胞；分離包含第一 DNA構建物編碼多肽鏈和第二 DNA構建物編碼多肽鏈的單體-二聚體雜合體。本發明涉及製備包含第一和第二多肽鏈的嵌合蛋白的方法，其中所述第一多肽鏈和第二多肽鏈不相同，其中所述第一多肽鏈包含生物活性分子、至少一部分免疫球蛋白恆定區和至少第一結構域，所述第一結構域具有至少一種特異性結合配偶體，其中所述第二多肽鏈包含至少一部分免疫球蛋白恆定區和至少第二結構域，其中所述第二結構域是所述第一結構域的特異性結合配偶體，但不含任何生物活性分子或免疫球蛋白可變區，所述方法包括用包含編碼所述第一多肽鏈的DNA分子的第一 DNA構建物，及包含編碼所述第二多肽鏈的DNA分子的第二 DNA構建物轉染細胞；在第一 DNA構建物編碼多肽鏈得以表達和第二 DNA構建物編碼多肽鏈得以表達的條件下培養細胞；分離由第一 DNA構建物編碼多肽鏈和第二 DNA構建物編碼多肽鏈組成的單體-二聚體雜合體。本發明涉及製備本發明嵌合蛋白的方法，所述方法包括用包含編碼第一多肽鏈 (包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恆定區)的DNA分子和任選接頭的第一 DNA 構建物轉染細胞；在第一DNA構建物編碼多肽鏈得以表達的條件下培養細胞；分離第一DNA 構建物編碼的多肽鏈；用包含編碼第二多肽鏈(包含至少一部分免疫球蛋白恆定區，但不含任何生物活性分子或免疫球蛋白可變區)的DNA分子的第二 DNA構建物轉染細胞；在第二DNA構建物編碼多肽鏈得以表達的條件下培養細胞；分離第二DNA構建物編碼的多肽鏈； 在包含第一 DNA構建物編碼多肽鏈和第二 DNA構建物編碼多肽鏈的單體-二聚體雜合體得以形成的條件下，合併第一 DNA構建物編碼多肽鏈和第二 DNA構建物編碼多肽鏈；分離所述單體-二聚體雜合體。本發明涉及製備包含第一和第二多肽鏈的嵌合蛋白的方法，其中所述第一多肽鏈和第二多肽鏈不相同，所述方法包括用包含編碼多肽鏈(包含至少一部分免疫球蛋白恆定區)的DNA分子的DNA構建物轉染細胞；在DNA構建物編碼多肽鏈得以表達，其N末端為半胱氨酸，從而形成多肽鏈二聚體的條件下培養細胞；分離由兩個拷貝的DNA構建物編碼多肽鏈組成的二聚體；並使分離的二聚體與生物活性分子在生物活性分子主要只與二聚體一條多肽鏈反應的條件下發生化學反應，其中所述生物活性分子具有C末端硫酯，從而形成單體-二聚體雜合體。本發明涉及製備包含第一和第二多肽鏈的嵌合蛋白的方法，其中所述第一多肽鏈和第二多肽鏈不相同，所述方法包括用包含編碼多肽鏈(包含至少一部分免疫球蛋白恆定區)的DNA分子的DNA構建物轉染細胞；在DNA構建物編碼多肽鏈得以表達，其N末端為半胱氨酸，從而形成多肽鏈二聚體的條件下培養細胞；分離由兩個拷貝的DNA構建物編碼多肽鏈組成的二聚體；使分離的二聚體與生物活性分子發生化學反應，其中所述生物活性分子具有C末端硫酯，使得生物活性分子與二聚體的每條鏈連接；使由與生物活性分子連接的免疫球蛋白部分組成的二聚體變性，形成單體鏈；將單體鏈與包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(其沒有連接生物活性分子)的多肽鏈結合，形成單體-二聚體雜合體；分離單體-二聚體雜合體。本發明涉及製備包含第一和第二多肽鏈的嵌合蛋白的方法，其中所述第一多肽鏈和第二多肽鏈不相同，所述方法包括用包含編碼多肽鏈(包含至少一部分免疫球蛋白恆定區)的DNA分子的DNA構建物轉染細胞；在以下條件下培養細胞DNA構建物編碼的多肽鏈被表達為兩條多肽鏈的混合物，其中所述混合物包含具有N末端半胱氨酸的多肽和鄰近N 末端處具有半胱氨酸的多肽；分離由DNA構建物編碼多肽鏈的混合物組成的二聚體；使分離二聚體與生物活性分子發生化學反應，其中所述生物活性分子具有活性硫酯，從而形成至少一些單體-二聚體雜合體；從所述混合物分離單體-二聚體雜合體。本發明涉及治療疾病或病症的方法，所述方法包括給予本發明嵌合蛋白，從而治療疾病或病症。本發明另外的目標和優點將在下述說明中進行部分闡述，部分從下述說明中將容易理解到，或可從本發明的實施中發現。通過所附權利要求書中具體指出的要素和組合，本發明的目標和優點將得以實現和達到。應當理解，以上概述和以下詳述只是示範性和說明性內容，並不對要求保護的本發明構成限制。附圖簡述圖1是比較EPO-Fc同源二聚體或二聚體的結構與EPO-FC單體-二聚體雜合體的結構的示意圖。圖加是嵌合蛋白VII因子-Fc的胺基酸序列。該序列包括信號肽(下劃線)，其被細胞切割，以及前肽(粗線)，其被維生素K依賴性γ羧化酶識別，所述羧化酶能修飾VII 因子，以獲得完全活性。所述序列隨後被PACE切割，產生VII因子-Fe。圖2b是嵌合蛋白IX因子-Fc的胺基酸序列。該序列包括信號肽(下劃線)，其被細胞切割，以及前肽(粗線)，其被維生素K依賴性γ羧化酶識別，所述羧化酶能修飾IX 因子，以獲得完全活性。所述序列隨後被PACE切割，產生IX因子-Fe。圖2c是嵌合蛋白IFN α-Fc的胺基酸序列。該序列包括信號肽(下劃線)，其被細胞切割，產生成熟的IFNα -Fe。圖2d是嵌合蛋白IFNa-FcA接頭的胺基酸序列。該序列包括信號肽(下劃線)， 其被細胞切割，產生成熟的IFNa-FcA接頭。圖2e是嵌合蛋白Flag-Fc的胺基酸序列。該序列包括信號肽(下劃線)，其被細胞切割，產生成熟的Flag-Fc。圖2f是嵌合蛋白Ep0-CCA-Fc的胺基酸序列。該序列包括信號肽(下劃線)，其被細胞切割，產生成熟的Epo-CCA-Fc。酸性捲曲螺旋結構域也以粗線表示。圖2g是嵌合蛋白CCB-Fc的胺基酸序列。該序列包括信號肽(下劃線)，其被細胞切割，產生成熟的CCB-Fc。鹼性捲曲螺旋結構域也以粗線表示。圖池是嵌合蛋白Cys-Fc的胺基酸序列。該序列包括信號肽(下劃線)，其被細胞切割，產生成熟的Cys-Fc。當該序列在CHO細胞中產生時，一部分序列分子被信號肽酶不正確地切割，使得在N末端保留兩個多餘的胺基酸，從而防止具有C末端硫酯的生物活性分子的連接(例如通過自然連接反應)。當這些不正確切割的序列分子與正確切割的Cys-Fc 形成二聚體並隨後與具有C末端硫酯的生物活性分子反應時，就形成單體-二聚體雜合體。圖2i是嵌合蛋白IFNa -GS15-FC的胺基酸序列。該序列包括信號肽(下劃線)， 其被細胞切割，產生成熟的IFNci -GS15-FC。圖2j是嵌合蛋白Epo-Fc的胺基酸序列。該序列包括信號肽(下劃線)，其被細胞切割，產生成熟的Epo-Fc。8胺基酸接頭也以粗線表示。圖3a是嵌合蛋白VII因子-Fc的核酸序列。該序列包括信號肽(下劃線)和被維生素K依賴性γ羧化酶識別的前肽(粗線)，所述羧化酶能修飾VII因子，以獲得完全活性。翻譯序列隨後被PACE切割，產生成熟的VII因子-Fe。圖北是嵌合蛋白IX因子-Fc的核酸序列。該序列包括信號肽(下劃線)和被維生素K依賴性γ羧化酶識別的前肽(粗線)，所述羧化酶能修飾IX因子，以獲得完全活性。翻譯序列隨後被PACE切割，產生成熟的IX因子-Fe。圖3c是嵌合蛋白IFNa-Fc的核酸序列。該序列包括信號肽(下劃線)，其在翻譯後被細胞切割，產生成熟的IFNα -Fe。圖3d是嵌合蛋白IFNa-FcA接頭的核酸序列。該序列包括信號肽(下劃線)，其在翻譯後被細胞切割，產生成熟的IFNa-FcA接頭。圖3e是嵌合蛋白Flag-Fc的胺基酸序列。該序列包括信號肽(下劃線)，其在翻譯後被細胞切割，產生成熟的Flag-Fc。圖3f是嵌合蛋白Ep0-CCA-Fc的核酸序列。該序列包括信號肽(下劃線)，其在翻譯後被細胞切割，產生成熟的Epo-CCA-Fc。酸性捲曲螺旋結構域也以粗線表示。圖3g是嵌合蛋白CCB-Fc的核酸序列。該序列包括信號肽(下劃線)，其在翻譯後被細胞切割，產生成熟的CCB-Fc。鹼性捲曲螺旋結構域也以粗線表示。圖池是嵌合蛋白Cys-Fc的核酸序列。該序列包括信號肽(下劃線)，其在翻譯後被細胞切割，產生成熟的Cys-Fc。圖3i是嵌合蛋白IFNa -GS15-FC的核酸序列。該序列包括信號肽(下劃線)，其在翻譯後被細胞切割，產生成熟的IFNa -GS15-FC。圖3j是嵌合蛋白Epo-Fc的核酸序列。該序列包括信號肽(下劃線)，其在翻譯後被細胞切割，產生成熟的Epo-Fc。編碼8胺基酸接頭的核酸序列也以粗線表示。圖4表示通過自然連接反應形成單體-二聚體雜合體的方法。圖5a顯示Fc MESNA的胺基酸序列(SEQ ID NO :4)。圖 5b 顯示 Fc MESNA 的 DNA 序列(SEQ ID NO :5)。圖6比較IFN α同源二聚體(即由2個IFN α分子組成)和IFN α單體-二聚體雜合體(即包含1個IFNa分子)的抗病毒活性。圖7是VIIa因子-Fc嵌合單體-二聚體雜合體(一個VII因子分子)和VIIa因子-Fc嵌合同源二聚體(兩個VII因子分子)的凝血活性的比較。圖8比較VIIa因子-Fc嵌合單體-二聚體雜合體(一個VII因子分子)和VIIa 因子-Fc嵌合同源二聚體(兩個VII因子分子)在新生大鼠中的口服劑量。圖9比較IX因子-Fc嵌合單體-二聚體雜合體(一個IX因子分子)和嵌合同源二聚體在新生大鼠中的口服劑量。圖10是比較口服給予新生大鼠IX因子-Fc嵌合單體-二聚體雜合體(一個IX 因子分子)和口服給予嵌合同源二聚體的時間進程研究。圖11說明肺部單劑量給藥後與Epo-Fc單體-二聚體雜合體相比Epo-Fc 二聚體在食蟹猴(cynomolgus monkey)中的藥物動力學。圖12比較皮下給藥的Ep0-Fc單體-二聚體雜合體和皮下給藥的Aranesp (阿法達貝泊汀)在猴中的血清濃度。圖13比較靜脈內給藥的Ep0-Fc單體-二聚體雜合體和靜脈內給藥的Aranesp (阿法達貝泊汀)和;Epogen (阿法依泊汀)在猴中的血清濃度。圖 14 顯示獲自 Mimetic Red2 柱(ProMetic LifeSciences, Inc. ,Wayne, NJ)的曲線及含EpoFc單體-二聚體雜合體、EpoFc 二聚體和Fc的柱級份的SDS-PAGE。EpoFc單體-二聚體雜合體出現在級份11、12、13和14。EpoFc 二聚體出現在級份18。Fc出現在級份 1/2。圖15顯示肺部單劑量給藥後帶有8胺基酸接頭的IFNi3 Fc在食蟹猴中的藥物動力學。圖16顯示食蟹猴中應答IFN β -Fc同源二聚體和IFN β -Fc Ν297Α單體-二聚體雜合體的新蝶呤刺激作用。圖17a顯示β幹擾素-Fc的核苷酸序列；圖17b顯示β幹擾素-Fc的胺基酸序列。圖18顯示Τ20 (a)、T21 (b)和T1249(c)的胺基酸序列。實施方案的說明A.定義親合標記物，在本文中用以指與另一個目的分子連接的分子，其能夠與特異性結合配偶體相互作用，以分離或鑑定所述另一個目的分子。本發明嵌合蛋白或者與本發明嵌合蛋白實際等同的蛋白質或肽的類似物，在本文中用以指蛋白質或肽的相關胺基酸序列與特定序列具有至少701751801851901 95 %、97 %、98 %、99 %或100 %的一致性。舉例說，這種序列可以是衍自各種物種的變體， 或者它們可以通過截短、缺失、胺基酸置換或添加從特定序列衍生。兩個胺基酸序列之間的一致性百分率通過標準的比對算法確定，所述算法例如Altschul等，1990，J. Mol. Biol.， 215 :403-410 中描述的基本局部比對工具(BLAST) ；Needleman 等，1970，J. Mol. Biol. ,48 444-453 的算法；Meyers 等，1988，Comput. Appl. Biosci.，4 :11-17 的算法；或者 Tatusova 等，1999，FEMS Microbiol. Lett.，174 :247-250 等。這些算法整合到 BLASTN、BLASTP 和 "BLAST2序列」程序中(參見www. ncbi. nim. nih. gov/BLAST)。當採用這些程序時，可以使用預設參數。例如，對於核苷酸序列，以下設置可用於「BLAST2序列」程序BLASTN、匹配獎分2、錯配罰分_2、開放空位罰分和拓展空位罰分分別為5和2、gap x_dropoff50、期望值 10、字長11、濾器開。對於胺基酸序列，以下設置可用於「BLAST2序列」程序BLASTP、矩陣 BL0SUM62、開放空位罰分和拓展空位罰分分別11和l、gapX_drOpOff50、期望值10、字長3、 濾器開ο生物利用度，在本文中用以指某物質被吸收到生命系統中或在生理活動位點可得以利用的程度和速度。生物活性分子，在本文中用以指能夠在生物背景中(例如在生物體、細胞或它們的體外模型中)治療疾病或病症，或者通過發揮某種功能或作用，或通過刺激或應答某種功能、作用或反應，將某種分子局限於或靶向體內疾病或病症位點的非免疫球蛋白分子或其片段。生物活性分子可包括至少多肽、核酸、小分子(如有機或無機小分子)之一。嵌合蛋白，在本文中用以指由衍自第一來源的第一胺基酸序列與衍自第二來源的第二胺基酸序列共價或非共價連接組成的任何蛋白質，其中第一和第二來源不相同。互不相同的第一來源和第二來源可包括兩種不同的生物實體，或同一生物實體的兩種不同的蛋白質，或某種生物實體和某種非生物實體。嵌合蛋白可包括例如衍自至少兩種不同生物來源的蛋白質。生物來源可包括任何非合成法產生的核酸或胺基酸序列(例如基因組或cDNA 序列、質粒或病毒載體、天然病毒顆粒或者上述任何一種的突變體或類似物(如本文的進一步描述))。合成來源可包括通過化學法而不是通過生物系統產生的蛋白質或核酸序列 (例如胺基酸序列的固相合成)。嵌合蛋白也可包括衍自至少兩種不同的合成來源的蛋白質或者衍自至少一種生物來源和至少一種合成來源的蛋白質。嵌合蛋白還可包含衍自第一來源的、與衍自任何來源的核酸或者衍自任何來源的有機或無機小分子共價或非共價連接的第一胺基酸序列。嵌合蛋白在第一和第二胺基酸序列之間，或在第一胺基酸序列和核酸之間，或在第一胺基酸序列和有機或無機小分子之間，可包含接頭分子。凝血因子，在本文中用以指在患有止血病症的對象中防止或縮短出血發作持續時間的任何天然或重組產生的分子或其類似物。換句話說，凝血因子指具有凝血活性的任何分子。凝血活性，在本文中用以指參與最終導致形成血纖蛋白塊和/或減少出血或流血發作的嚴重性、持續時間或頻率的生化反應級聯的能力。二聚體，在本文中用以指包含第一和第二多肽鏈的嵌合蛋白，其中所述第一和第二多肽鏈均包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恆定區。同源二聚體指其中兩個生物活性分子相同的二聚體。以二聚體形式連接的單體-二聚體雜合體指包含至少一部分免疫球蛋白恆定區 (例如免疫球蛋白的Fc片段)、生物活性分子和連接上述兩者從而使一個生物活性分子與兩條多肽鏈(每條鏈包含一部分免疫球蛋白恆定區)結合的接頭的嵌合蛋白。圖4給出以二聚體形式連接的單體-二聚體雜合體的一個實例。DNA構建物，在本文中用以指這樣的單鏈或雙鏈DNA分子或這種分子的克隆，所述 DNA分子已通過人工幹預而被修飾，從而含有以某種方式結合在一起的各DNA區段，所述方式使得所述各區段作為整體不會在自然界中另外存在。DNA構建物含有指導目的多肽的表達所需的信息。DNA構建物可包括啟動子、增強子和轉錄終止子。含有指導目的多肽分泌所需信息的DNA構建物也含有至少一種分泌信號序列。結構域，在本文中用以指多肽(根據這個術語的定義，包括蛋白質)中具有某些區別性物理特徵或功能的區域，包括例如由多肽鏈的一段組成的獨立摺疊結構。結構域可含有多肽的區別性物理特徵序列，或可含有保留其結合特性(即其能結合第二結構域)的物理特徵片段。結構域可與另一結構域聯合。換句話說，第一結構域可自然結合第二結構域。片段，在本文中用以指包含具有至少2個連續胺基酸殘基、至少5個連續胺基酸殘基、至少10個連續胺基酸殘基、至少15個連續胺基酸殘基、至少20個連續胺基酸殘基、至少25個連續胺基酸殘基、至少40個連續胺基酸殘基、至少50個連續胺基酸殘基、至少100 個連續胺基酸殘基或至少200個連續胺基酸殘基的胺基酸序列，或者包含蛋白質、肽或多肽的任何缺失或截短的肽或多肽。止血，在本文中用以指停止流血或出血；或者停止血液流過血管或身體部位。止血障礙，在本文中用以指由於血纖蛋白塊形成能力受損或無此能力導致的、以自發性或創傷性出血傾向為特徵的遺傳性或獲得性病症。連接，在本文中用以指第一核酸序列與第二核酸序列共價結合。第一核酸序列可直接與第二核酸序列直接結合或並列，或者插入序列可將第一序列與第二序列共價結合。 連接在本文中也可用以指第一胺基酸序列與第二胺基酸序列共價或非共價結合。第一胺基酸序列可直接與第二胺基酸序列直接結合或並列，或者插入序列可將第一胺基酸序列與第二胺基酸序列共價結合。有效連接，在本文中用以指第一核酸序列與第二核酸序列連接，從而兩個序列都能夠被表達為生物活性蛋白質或肽。多肽，在本文中用以指胺基酸聚合物，但不是指特定長度的產物；因此，肽、寡肽和蛋白質都包括在多肽的定義內。這個術語並不排斥多肽的表達後修飾，例如糖基化、乙醯化、磷酸化、聚乙二醇化、脂質部分的添加或者任何有機或無機分子的添加。包括在此定義內的例如有含有一個或多個胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸)的多肽和含有取代鍵的多肽，以及其他本領域公知的天然或非天然修飾的多肽。高嚴格性，在本文中用以包括技術人員根據例如DNA的長度容易確定的條件。通常，這種條件在 Sambrook 等，Molecular Cloning =ALaboratory Manual，第 2 版，第 1 卷， 1. 101-104頁，Cold Spring HarborLaboratory Press (1989)中定義，包括使用硝酸纖維素濾膜預漂洗溶液5X SSC, 0. 5% SDS, l.OmM EDTA(PH 8.0)；雜交條件50% 甲醯胺，6X SSC, 42V (或其他類似的雜交溶液如Mark溶液，50%甲醯胺中，42°C )；和漂洗條件約68°C，
0.2XSSC,0. 1%SDS。技術人員會認識到，溫度和漂洗溶液鹽濃度可根據例如探針的長度等因素按需要進行調整。中等嚴格性，在本文中用以包括本領域普通技術人員根據例如DNA的長度容易石角定的條件° Sambrook 等，Molecular Cloning :ALaboratory Manual,第 2 版，第 1 卷，
1.101-104頁，Cold Spring HarborLaboratory Press (1989)規定了基本的條件，包括使用硝酸纖維素濾膜預漂洗溶液5X SSC, 0.5% SDS, l.OmM EDTA (pH 8.0)；雜交條件50%甲醯胺，6X SSC, 420C (或其他類似的雜交溶液如Mark溶液，50%甲醯胺中，42°C )；和漂洗條件:60°C,0. 5X SSC,0. 1% SDS0無機小分子，在本文中用以指不含碳原子且不大於50kD的分子。有機小分子，在本文中用以指含至少一個碳原子且不大於50kD的分子。治療，在本文中用以指以下任何一項降低疾病或病症的嚴重性；減少疾病過程持續時間；改善與疾病或病症相關的一種或多種症狀；為患有疾病或病症的對象提供有益效果，而不必治癒疾病或病症；預防與疾病或病症相關的一種或多種症狀。B.本發明一些實施方案提供的改進效果本發明提供包含第一和第二多肽鏈的嵌合蛋白(單體-二聚體雜合體)，其中所述第一鏈包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恆定區，所述第二鏈包含至少一部分免疫球蛋白恆定區，但不含任何生物活性分子或免疫球蛋白的可變區。圖1將傳統的融合蛋白二聚體與本發明單體-二聚體雜合體的一個實例進行對比。如同其他包含至少一部分免疫球蛋白恆定區的嵌合蛋白一樣，本發明提供的嵌合蛋白與單獨的生物活性分子相比，其穩定性提高，生物利用度增加。而且此外，由於嵌合蛋白的兩條鏈中只有一條包含生物活性分子，所述嵌合蛋白的分子量比其中所有的鏈均包含生物活性分子的嵌合蛋白更低，雖然不想囿於任何理論，但這確會導致嵌合蛋白更容易地例如通過與Fcfoi受體結合而被胞轉穿過上皮屏障，從而增加嵌合蛋白的半壽期。在一個實施方案中，本發明因此提供給予本發明治療性嵌合蛋白的改進非侵入性方法(例如通過任何黏膜表面如口腔、口頰、舌下、鼻、直腸、陰道，或者通過肺部或眼部途徑)。本發明因此提供與前述嵌合蛋白(例如由至少一部分免疫球蛋白恆定區和生物活性分子組成的嵌合蛋白，其中嵌合蛋白所有的鏈均包含生物活性分子)相比，使用更低頻率和更少劑量而達到本發明嵌合蛋白的治療水平的方法。在另一實施方案中，本發明提供給予本發明治療性嵌合蛋白的侵入性方法，例如皮下、靜脈內給藥。本發明治療性嵌合蛋白的侵入性給藥方法能增加治療性嵌合蛋白的半壽期，結果與前述嵌合蛋白(例如由至少一部分免疫球蛋白恆定區和生物活性分子組成的嵌合蛋白，其中嵌合蛋白所有的鏈均包含生物活性分子)相比，可採用更低頻率和更少劑量。其中只有一條鏈包含生物活性分子的嵌合蛋白的又一個優點是，其與其中所有的鏈均包含生物活性分子的嵌合蛋白相比，由於位阻減少、疏水作用減少、離子相互作用減少或分子量降低，生物活性分子對靶細胞或分子的可達性提高。C.嵌合蛋白本發明涉及包含一個生物活性分子、至少一部分免疫球蛋白恆定區和任選至少一個接頭的嵌合蛋白。所述免疫球蛋白部分須同時具有N末端或氨基末端和C末端或羧基末端。所述嵌合蛋白可含有與所述免疫球蛋白部分的N末端連接的生物活性分子。或者，生物活性分子可與所述免疫球蛋白部分的C末端連接。在一個實施方案中，連接鍵是共價鍵。 在另一個實施方案中，連接鍵是非共價鍵。嵌合蛋白可任選包含至少一個接頭；因此，生物活性分子不必直接與免疫球蛋白恆定區部分連接。接頭可插入在生物活性分子和免疫球蛋白恆定區部分中間。接頭可連接到免疫球蛋白恆定區部分的N末端，或免疫球蛋白恆定區部分的C末端。如果生物活性分子包含至少一個胺基酸，該生物活性分子須具有N末端和C末端，接頭可連接到生物活性分子的N末端，或生物活性分子的C末端。本發明涉及式X-La-F:F或F:F-La-X的嵌合蛋白，其中X是生物活性分子，L是任選的接頭，F是至少一部分免疫球蛋白恆定區，a是任何任何整數或零。本發明還涉及式 Ta-X-La-F = F或Ta-F = F-La-X的嵌合蛋白，其中X是生物活性分子，L是任選的接頭，F是至少一部分免疫球蛋白恆定區，a是任何任何整數或零，T是第二接頭或者可用以幫助嵌合蛋白純化的標記，例如FLAG標記、組氨酸標記、GST標記、麥芽糖結合蛋白標記，表示化學締合作用，例如至少一個非肽鍵。在某些實施方案中，化學締合作用即是共價鍵。在其他實施方案中，化學締合作用即是非共價鍵，例如離子相互作用、疏水相互作用、親水相互作用、範德華相互作用和氫鍵。技術人員應能理解，當a等於0時，X將直接與F連接。 因此，例如，a可以是0、1、2、3、4、5或大於5。在一個實施方案中，本發明嵌合蛋白包含圖加的胺基酸序列(SEQ ID NO 6)。在一個實施方案中，本發明嵌合蛋白包含圖2b的胺基酸序列(SEQ ID NO :8)。在一個實施方案中，本發明嵌合蛋白包含圖2c的胺基酸序列(SEQ ID N0:10)。在一個實施方案中，本發明嵌合蛋白包含圖2d的胺基酸序列(SEQ ID N0:12)。在一個實施方案中，本發明嵌合蛋白包含圖加的胺基酸序列(SEQ ID N0:14)。在一個實施方案中，本發明嵌合蛋白包含圖 2f的胺基酸序列(SEQ ID N0:16)。在一個實施方案中，本發明嵌合蛋白包含圖2g的胺基酸序列(SEQ IDNO :18)。在一個實施方案中，本發明嵌合蛋白包含圖池的胺基酸序列(SEQ ID NO :20)。在一個實施方案中，本發明嵌合蛋白包含圖2i的胺基酸序列(SEQ ID NO :22)。 在一個實施方案中，本發明嵌合蛋白包含圖2j的胺基酸序列(SEQ ID N0:24)。在一個實施方案中，本發明嵌合蛋白包含圖17b的胺基酸序列(SEQ ID N0:27)。1.嵌合蛋白變體本發明嵌合蛋白的衍生物、抗本發明嵌合蛋白的抗體和抗本發明嵌合蛋白結合配偶體的抗體均被考慮在內，它們可通過置換、添加和/或缺失/截短從而改變胺基酸序列， 或者通過引入能導致產生功能相當分子的化學修飾來製備。本領域普通技術人員應能理解到，任何蛋白質序列中的某些胺基酸可被其他胺基酸置換，而不會對蛋白質的活性產生不利的影響。在本發明嵌合蛋白的胺基酸序列或其DNA編碼序列中可製造各種變化，而又不明顯喪失本發明嵌合蛋白的活性、功能或效用。由這種變化產生的衍生物、類似物或突變體及這種衍生物的應用都在本發明的範圍內。在某個具體的實施方案中，所述衍生物具有功能活性，即能夠表現出與本發明嵌合蛋白相關的一種或多種活性，例如Fcfoi結合、病毒抑制、止血、紅細胞生成。有許多能夠檢測包含生物活性分子的嵌合蛋白的活性的試驗法為本領域所公知。在生物活性分子是HIV抑制劑的情況中，可通過使用公知方法測量逆轉酶活性來檢測活性(參見例如 Barre-Sinoussi 等，1983，Science 220 :868 ；Gallo 等，1984， Science 224 500) 0或者，可通過測量促融活性來檢測活性(參見例如Nussbaum等，1994， J.Virol. 68 (9) :5411)。在生物活性為止血的情況中，可進行MaCLot FVIIa_rTF試驗來評估 VIIa 因子衍生物的活性(Johannessen 等，2000，Blood Coagulation and Fibrinolysis 11 :S159)。序列中胺基酸的置換物可選自該胺基酸所屬類別的其他成員(參見表1)。此外，各種胺基酸通常都用中性胺基酸如丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸來置換(參見例如MacLennan等，1998，Acta Physiol. Scand. Supp 1. 643 :55-67 ；Sasaki 等，1998，Adv. Biophys. 35 :1-24)。表權利要求
1.一種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含第一和第二多肽鏈，其中所述第一鏈包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恆定區，其中所述第二鏈包含至少一部分免疫球蛋白恆定區，不含生物活性分子或免疫球蛋白可變區。
2.一種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含第一和第二多肽鏈，其中所述第一鏈包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恆定區，其中所述第二鏈由至少一部分免疫球蛋白恆定區和任選的親合標記組成。
3.一種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含第一和第二多肽鏈，其中所述第一鏈包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恆定區，其中所述第二鏈基本由至少一部分免疫球蛋白恆定區和任選的親合標記組成。
4.一種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含第一和第二多肽鏈，a)其中所述第一鏈包含生物活性分子、至少一部分免疫球蛋白恆定區和具有至少一種特異性結合配偶體的第一結構域；b)其中所述第二鏈包含至少一部分免疫球蛋白，但不含生物活性分子或免疫球蛋白可變區，進一步包含第二結構域，所述第二結構域是所述第一結構域的特異性結合配偶體。
5.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權利要求1-4任一項的嵌合蛋白和藥物可接受賦形劑。
6.一種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含第一和第二多肽鏈，a)其中所述第一鏈包含生物活性分子、至少一部分免疫球蛋白恆定區和具有至少一種特異性結合配偶體的第一結構域；b)其中所述第二鏈由至少一部分免疫球蛋白、第二結構域和任選的親合標記組成，所述第二結構域是所述第一結構域的特異性結合配偶體。
7.一種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含第一和第二多肽鏈，a)其中所述第一鏈包含生物活性分子、至少一部分免疫球蛋白恆定區和具有至少一種特異性結合配偶體的第一結構域；b)其中所述第二鏈基本由至少一部分免疫球蛋白、第二結構域和任選的親合標記組成，所述第二結構域是所述第一結構域的特異性結合配偶體。
8.一種下式的嵌合蛋白X-La-F:F 或 F:F-La-X其中X是生物活性分子，L是接頭，F是至少一部分免疫球蛋白恆定區，a是任何整數或零。
9.一種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含連接在一起的第一和第二多肽鏈，其中所述第一鏈包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恆定區，所述第二鏈包含至少一部分免疫球蛋白恆定區，但不含第一鏈的生物活性分子，且其中所述第二鏈不與分子量大於2kD的任何分子共價連接。
10.一種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含連接在一起的第一和第二多肽鏈，其中所述第一鏈包含生物活性分子和至少一部分免疫球蛋白恆定區，所述第二鏈包含至少一部分免疫球蛋白恆定區，除所述第一多肽鏈的免疫球蛋白部分之外不與任何其他分子共價連接。
全文摘要
本發明涉及免疫球蛋白嵌合單體-二聚體雜合體。本發明涉及嵌合單體-二聚體雜合體蛋白，其中所述蛋白包含第一和第二多肽鏈，所述第一多肽鏈包含至少一部分免疫球蛋白恆定區和生物活性分子，所述第二多肽鏈包含至少一部分免疫球蛋白恆定區，不含第一鏈的生物活性分子。本發明還涉及本發明嵌合單體-二聚體雜合體蛋白的使用方法和製備方法。
文檔編號C12NGK102234334SQ201110082150
公開日2011年11月9日 申請日期2004年5月6日 優先權日2003年5月6日
發明者A·J·比通蒂, A·R·梅佐, D·S·賴夫拉, J·M·斯塔特爾, R·T·彼得斯, S·C·羅 申請人:辛託尼克斯藥品公司