大環內酯類化合物及其製備方法
2023-09-19 05:32:50 1
專利名稱：大環內酯類化合物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及的是一種抗生素，具體地說是一種大環內酯類抗生素。本發明還涉及這種抗 生素的製備方法。
(二)
背景技術：
目前，國內外應用廣泛的大環內酯類農用抗生素多拉菌素屬雙糖類化合物，是以環己氨 羧酸(cyclohexanecarboxylic)為前體，通過基因重組的阿維鏈黴菌(Wreptowycey flw,'w/"7/s yVE^"/06P)新菌株發酵而成的一種阿維菌素類抗生素，最早發現它驅殺寄生蟲的能力是在驅 鼠繼代的蛇形毛圓線蟲和殺兔癢蟎的動物模型中(參見Goudie, AC.等人，Fefen'"a 7 i^raw'to/ogy.49(1993)5-15)。多拉菌素為內外兼殺劑，對線蟲、節肢動物均有良好的驅殺效果， 與市售的伊維菌素類產品比較，其抗生寄蟲範圍更廣泛、血藥濃度高峰維持時間更長、半衰 期也相對較長。而且多拉菌素在動物體內持效時間更長，是目前最具有開發潛力的獸用抗寄 生蟲藥物之一。
(三)
發明內容
本發明的目的是提供一種具有強的抗寄生蟲及其蟲卵的活性，可用以控制動物體內外寄 生蟲及其蟲卵生存的大環內酯類化合物。 本發明的目的是這樣實現的 它的分子結構如下
! H
OH
當X-Y...R為CH二C...H時為新化合物1的結構；新化合物2的結構特徵是X-Y...R為 CH2-CH...OH。本發明的另一個目的是提供這種大環內酯化合物的製備方法。 本發明涉及的化合物是採用這樣的方法來製備的.-
1、 發酵
(1) 發酵菌種發酵菌種是阿維鏈黴菌突變株(5^e/ Awy^ey mww/"to Wra/'" vV￡^f/ 由東北農業大學生物化工實驗室提供，是於2009年03月11日保藏於"中國生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心"，保藏登記號為CGMCC N0.2943，命名為NEAU 1069
(5^repf纖yce5: averm/"7!'s )的菌株。
(2) 斜面培養採用YMS培養基(可溶性澱粉10g，酵母抽提物2g， KN03lg，瓊脂 20 g，蒸餾水1000ml， pH值7.0)於121。C下滅菌20 min，接菌後在28 。C下培養6-8 d;
(3) 種子培養培養基(葡萄糖20g，大豆粉15g，酵母粉5.0g，蒸餾水1000 ml， pH 值7.0)，用250 ml的三角瓶每瓶分裝25 ml，然後用10 ml無菌水將斜面的冰城鏈黴菌孢子 洗下並製成孢子懸浮液，使其濃度為Ixl07 lxl08個/ml。每瓶加2ml孢子懸浮液，置於搖 床上，轉速250r/min, 28。C培養24h;
(4) 發酵採用液體搖瓶發酵，培養基(玉米粉10%,大豆粉1%，棉花籽粉1%， a-澱粉 酶0.02%， NaCl 0.1%, K2HP04 0.2%， MgS04'7H20 0.1%， CaC03 0.7%，環己烷羧酸鹽0.1%, pH 7.0，加蒸餾水1000ml。於121。C下滅菌20min，分裝於1000ml三角瓶，每瓶100ml。接種 量8% (V/V)，搖床轉速250 r/min， 28 。C振蕩培養12-13 d。
2、 發酵液處理
(1) 發酵液經100 200目篩網過濾後，濾渣用甲醇提取。
(2) 將得到的浸提液濃縮至一定體積後進行溶劑萃取，矽膠柱層析和RP-18層析後，得 到兩種無色的粉末狀化合物。
本發明還涉及結構表徵如下化合物化合物1
formula see original document page 5化合物1的物理化學性質如下 性狀(Appearance):白色粉末 溶解性(Soliibility):易溶於氯仿、丙酮、甲醇 比旋度(Specific rotation): [a]g +123.86 (c 0.088， EtOH); 分子式(Molecular formula): C35H46O6
ESIMS w/z: 563 [M+H]+， High-resolution ESIMS: 585.3102 [M+Na]+ (calcd for C35H4606Na， 585.3187);
UV absorption spectrum Amax (EtOH) nm 0): 249 (37318) 283 (17828) 200 (67032); IR absorption spectrum: vmaxcm-1 3417,2927,2854,1706，1610, 1504,1450,1365,1278,1157,994; !H NMR (CDC13,400 MHz) (5 7.36 (1H， s， H-3) ， 6.56 (1H， s， H-6) ， 6.45 (1H， d， /=15.1， H-8) ， 6.08 (1H， dd， J=10.4， 25.5， H-9) ， 6.03 (1H， dd， J40.4， 24.9， H-10) ， 5.62 (1H， dd， J二9.9， 14.5， H-ll) ， 2.58 (1H， m， H-12) ， 4.04 (IH， brs， H-13) ， 5.29 (1H， brd， 7=10.8， H-15) , 2.31 (2H， m， H-16) ， 3.99 (IH， m， H-17) ， 0.88 (1H， q， /=12.1， H-18a) ， 1.98 (1H， m， H-18b) ， 5.56 (1H， m， H-19) ， 1.50 (IH， t， 7=11.8， H-20a) ， 2.02 (1H， m， H-20b) ， 5.53 (1H， dd， 7=2.4， 10.0， H-22) ， 5.72 (1H， dd， J=1.2， 9.9， H-23) ， 2.29 (1H， m， H-24) ， 3.32 (IH， d， J40.0， H-25) ， 1.53 (1H， m， H-26) ， 1.63 (1H， m， H-26a) ， 1.19-1.37 (IH， m， H-26b) ， 1.19-1.37 (1H， m， H-27a) ， 1.79-1.89 (1H， m， H-27b) ， 1.65 (2H， m， H-29) ， 1.19-1.37 (1H， m， H-30a) ， 1.79-1.89 (1H， m, H-30b) ， 1.48-1.63 (2H， m， H-31) ， 2.21 GH， s， H-32) ，1.22 (3H， d， J=6.9， H-33) ， 1.58 (3H， brs， H-34) ， 0.92 (3H， d，凡1， H-35);
13C NMR (CDC13, 100 MHz) (5 169.6 (s， C-l), 123.6 (S， C-2), 132.5 (d, C-3), 122.7 (s， C-4), 155.6 (s， C-5)， 115.3 (d, C-6), 137.1 (S， C-7)， 128.7 (d， C-8)， 134.4 (d, C-9)， 130.4 (d, C-10), 135.7 (d， C-ll)， 40.6 (d, C-12), 78.5 (d, C-13), 138.1 (s, C-14), 117.7 (d, C-15), 33.8 (t, C-16), 68.6 (d, C-17), 36.5 (t, C-18), 68.1 (d， C-19), 40.8 (t, C-20), 95.9 (d, C-21)， 128.0 (d， C-22)， 136.0 (d， C-23), 30.1 (d， C-24), 77.3 (d， C-25), 38.7 (d， C-26), 25.6 (t, C-27), 26.7 (t, C-28), 26.5 (t, C-29), 27.0 (t, C-30)， 31.6(t，C-31)， 15.3 (q， C-32)， 18.4 (q, C-33)， 14.8 (q, C-34)，16.6 (q, C-35);
本發明還涉及結構表徵如下化合物化合物27頁
化合物2的物理化學性質如下-性狀(Appearance):白色粉末 溶解性(Solubility):易溶於氯仿、丙酮、甲醇 比旋度(Specific rotation): [a]g +66.35 (c 0.104， EtOH); 分子式(Molecular formula): C35H4807
ESIMS w/z: 581 [M+H]+， High-resolution ESIMS: 603.3292 [M+Na〗+ (calcd for C35H4807Na, 603.3292);
UV absorption spectrum Amax (EtOH) nm (￡): 250 (42540) 282 (21403) 200 (105206); IR absorption spectrum: VmaxCm" 3445,2928,2855,1699,1615, 1452,1382,1278,1163,994; 'HNMR(CDCl3,400 MHz) /=12.0， H-18a) ， 1.96 (1H， m， H-18b) ， 5.48 (1H， m， H-19) ， 1.44
(1H， t， >/=11.8， H-20a) ， 1.97 (1H， m， H-20b) ， 1.65 (2H， m， H-22) ， 3.76 (IH， brs， H-23) ， 1.65 (1H， m， H-24) ， 3.41 (1H， d, J:10.7， H-25) ， 1.49 (IH， m， H-26) ， 1.58 (1H， m， H-27a) ， 1.20-1.29 (1H， m， H國27b) ， 1.19-1.30 (1H， m， H-28a) ， 1.77-1.87 (IH， m， H-28b) ， 1.67 (2H， m， H-29) ， 1.19-1.30 (1H， m， H-30a) , 1.77-1.87 (1H， m， H-30b) ， 1.50 (1H， m， H-31a) ， 1.63 (1H， m， H-31b)， 2.21 (3H， s， H-32) ， 1.20 (3H， d，凡9， H-33) ， 1.58 (3H， brs， H-34) ， 0.92
(3H， d， 7=6.9， H-35);
13
C NMR (CDC13, 100 MHz) (5 169.6 (s, C陽l), 123.6 (S， C-2), 132.6 (d， C-3)， 122.9 (s， C-4), 155.9
7
三H陽7)， 128.8 (d， C-8), 134.3 (d, C-9), 130.4 (d, C-10), 135.7 (d, C-ll), 40.6 (d, C-12)， 78.3 (d, C陽13)， 138.6 (s， C-14), 117.0 (d， C-15), 33.6 (t， C-16), 68,6 (d, C-17), 36.2 (t, C-18), 67.3 (d， C-19), 41.1 (t， C-20), 99.9 (d, C-21)， 41.0 (d, C-22)， 70.3 (d, C-23), 35.1 (d, C-24), 72.5 (d, C-25), 38.1 (d， C-26) , 24.5 (t, C-27), 26.6 (t, C-28), 26.5 (t, C-29)， 26.9 (t, C-30), 31.2(t,C-31)，15.4(q, C-32)，18.5 (q, C-33)，14.8 (q, C-34)，13.6 (q, C-35);
採用本發明的方法得到的化合物具有強的殺蟎活性，能殺滅，例如寄生在果樹、蔬菜和
花上的四爪蟎屬、全爪蟎屬和鏽蟎屬的成蟎和卵。它們對於寄生於動物身上的硬蜱科、皮刺
蟎科和疥蟎科也有活性。它們還能殺滅動物體內外寄生物，如對牛體內的奧氏奧斯特線蟲、 琴形奧斯特線蟲、柏氏血矛線蟲捻轉血矛線蟲、似血矛線蟲、艾氏毛圓線蟲、蛇形毛圓線蟲、 腫空古柏線蟲、點狀古柏線蟲櫛狀古柏線蟲、匙形古柏線蟲、菇拉巴德古柏線蟲、牛仰口線 蟲、乳突類圓線蟲和輻射食道口線蟲等的成蟲及幼蟲均顯示驅蟲活性對豬蛔蟲、齒食道口
線蟲、長溝球首線蟲、豬毛首線蟲、蘭氏類圓線蟲、豬肺線蟲、豬腎蟲、鮑傑氏線蟲等具有 很好的驅除效果。對綿羊消化道線蟲包括毛圓線蟲、夏伯特線蟲、奧斯特線蟲、馬歇爾線蟲、
鈍刺細頸線蟲、毛首線蟲、捻轉血矛線蟲驅淨率為95%。 具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步的說明
1、 化合物製備發酵
(1) 種子培養培養基(葡萄糖20g，大豆粉15g，酵母粉5.0g，蒸餾水1000ml， pH 值7.0)，用250 ml的三角瓶每瓶分裝25 ml，然後用10 ml無菌水將斜面的冰城鏈黴菌孢子 洗下並製成孢子懸浮液，使其濃度為Ixl07 lxl08個/ml。每瓶加2ml孢-了懸浮液，置於搖 床上，轉速250r/min, 28。C培養24h;
(2) 發酵採用液體搖瓶發酵，培養基(玉米粉10%，大旦粉1%，棉花籽粉1%， 《-澱粉酶0.02%， NaCl 0.1%， K2HP04 0.2%, MgS04'7H20 0.1%, CaC03 0.7%，環己垸羧酸鹽 0.1%, pH 7.0，加蒸餾水1000ml。於121。C下滅菌20 min，分裝於1000 ml三角瓶，每瓶100 ml。接種量8% (V/V)，搖床轉速250 r/min， 28 。C振蕩培養12-13 d。
2、 化合物的分離
30L發酵液經200目篩網過濾，並且用水清洗慮餅，發酵液和清洗用的水全都棄掉，用 10L甲醇浸提過濾後得到的濾渣，通過減壓蒸餾的方法最後將甲醇溶液濃縮到大約2L，再 將濃縮液用相同體積的EtOAc浸提3次，將得到的EtOAc相減壓蒸餾會產生20 g油狀物質。
將所得油狀物上矽膠柱(粒徑200 300目)進行層析，分別用石油醚乙酸乙酯=9:1- 5:5 兩種洗脫液混合進行梯度洗脫，得到了五個組分，將組分二上RP-18矽膠柱進行層析，n用甲醇水=80:20-95:5 二種洗脫液混合進行梯度洗脫，會得到化合物1 (18mg);將組分三上 RP-18矽膠柱進行層析，用甲醇水=70:30-卯:10 二種洗脫液混合進行梯度洗脫,會得到化合 物2 (15mg)。
其中化合物l的結構式為
OH
3、抗蟲活性測定
對豬體內外寄生蟲及其蟲卵的觸殺作用
將100頭斷奶仔豬分為五組，分別進行如下處理。第一組為高劑量組，皮下注射劑量為400
嗎/kg;第二組為中劑量組，皮下注射劑量為300嗎/kg;第三組為低劑量組200嗎/kg;第四組 為對照組，不做任何處理。依試驗前後豬體內外寄蟲(卵)罹患數量進行比較來確定新化合物 對驅殺豬休內線蟲和體外血蝨的效果。依據豬再感染寄生蟲的時間，確定藥物在豬體內的殘 效期。
…三llu
ol三-:
.o
9化合物1和新化合物2在以300 ^g/kg的計量下能夠有效驅殺豬體內線蟲和體外血蝨。對 抑制線蟲感染長達25 d，對血蝨抑制長達98 d。
權利要求
1、一種大環內酯類化合物，其特徵在於大環內酯類化合物的結構圖為當X-Y...R為CH＝C...H時為化合物1的結構；當X-Y...R為CH2-CH...OH時為化合物2的結構
2、 一種製備權利要求l所述的大環內酯類化合物的製備方法，其特徵是製備化合物l和化 合物2的方法為將來源於產多拉菌素的細胞株，即由阿維鏈黴菌基因工程變異株(5^戶towycM avmm力'fo Wra/w A^L4" ^69)，是於2009年03月11日保藏於"中國生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心"，保藏登記號為CGMCC N0.2943，命名為NEAU1069 (5^^tow;;c^ m^7m力'fo)的菌株，經斜面培養、種子培養、搖瓶發酵、分離純化而得。
3、 根據權利要求書2所述的大環內酯類化合物的製備方法，其特徵是所述的斜面培養為-培養基的組成包括可溶性澱粉20 g、 KN03 1 g、 K2HPO40.5 g、 MgS04'7H20 0.5 g、 FeS04'7H20 0.01 g、瓊脂20 g和蒸餾水1000 ml， pH值7.2 7.4，於1><105 Pa下滅菌30 min，接菌後在 28 32'C下培養4d。
4、 根據權利要求書2所述的大環內酯類化合物的製備方法，其特徵是所述的種子培養為 培養基的組成包括葡萄糖5 10g、可溶性澱粉5 10g、牛肉膏5 10g、蛋白腖10 18g、 氯化鈉5 8 g和蒸餾水1000 ml， pH值7.2，用250 ml的三角瓶每瓶分裝100 ml，然後用1 ml 無菌水將斜面的冰城鏈黴菌孢子洗下並製成孢子懸浮液，使其濃度為1><107個/1111，每 瓶加1 ml孢子懸浮液，置於搖床上28 32t:培養24 36 h。
5、 根據權利要求書2所述的大環內酯類化合物的製備方法，其特徵是所述的搖瓶發酵為-採用液體搖瓶發酵，培養基組成為小米10 30 g加蒸餾水1000 ml煮沸15 min後濾去米粒， 加入葡萄糖15 30g、碳酸鈣2 15g、氯化鈉5 12g和蛋白腖5 15 g， pH值7.2 7.4， 於lx105 Pa下滅菌30 min，分裝於250 ml三角瓶，每瓶20 100ml，按體積比的接種量為 10%，搖床轉速150 240r/min， 28 32。C振蕩培養4 5 d。
6、 根據權利要求書2所述的大環內酯類化合物的製備方法，其特徵是所述的分離和提存的 方法為發酵液經100 200目篩網過濾後，濾渣用甲醇提取，提取液濃縮至一定體積後用 EtOAc萃取，將萃取夜濃縮後依次進行矽膠柱層析，RP-18柱層析所得到的化合物，得到兩 種無色的粉末狀化合物1和化合物2。
7、 根據權利要求書6所述的大環內酯類化合物的製備方法，其特徵是所述的矽膠層析用到 的填料是200-300目的矽膠，流動相為石油醚和乙酸乙酯按不同比例混合進行梯度洗脫。
8、 根據權利要求6所述的製備權利要求1所述的大環內酯類化合物的製備方法，其特徵是 所述的RP-18是使用混合溶劑，即80:20-95:5和70:30-90:10的甲醇與水溶液進行梯度洗脫的。
全文摘要
本發明提供了一種大環內酯類化合物及其製備方法。本發明的化合物是由阿維鏈黴菌基因工程變異株(Streptomyces avermitilis strain NEAU 1069)加入環己烷基羧酸後生物合成獲得的一種十六元環內酯類化合物，發酵液經過濾後，濾渣用甲醇提取，提取液濃縮至一定體積後用EtOAc萃取，將萃取夜濃縮後依次進行矽膠柱層析，RP-18柱層析所得到的化合物。本發明的化合物具有強的抗動物體內外寄生蟲的活性，可用以控制動物體內外寄生蟲及其蟲卵生存，對綿羊消化道線蟲包括毛圓線蟲、夏伯特線蟲、奧斯特線蟲、馬歇爾線蟲、鈍刺細頸線蟲、毛首線蟲、捻轉血矛線蟲驅淨率為95％。
文檔編號C07D493/20GK101619067SQ200910071629
公開日2010年1月6日 申請日期2009年3月25日 優先權日2009年3月25日
發明者向文勝, 玲 姜, 明 王, 王相晶 申請人:東北農業大學