一種快速利用工業甲醇的畢赤酵母菌及其應用的製作方法
2023-09-19 02:06:25 1
專利名稱：一種快速利用工業甲醇的畢赤酵母菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程技術領域，具體涉及一種能夠快速利用工業甲醇的 畢赤酵母菌，利用畢赤酵母菌生產單細胞蛋白的方法以及該畢赤酵母菌的應 用。
背景技術：
單細胞蛋白(Single-Cell Protein, SCP)，又稱菌體蛋白或微生物蛋白，是 指通過規模化培養非病源性微生物而生產的用作飼料或食品的菌體蛋白。
以工業甲醇為原料生產出來的甲醇蛋白被稱為第二代單細胞蛋白，與天 然蛋白相比，它的粗蛋白含量比魚粉和大豆都要高，含有豐富的必需胺基酸、 礦物質和維生素，可以部分代替魚粉、大豆、骨粉、肉類以及脫脂奶粉。而 且，甲醇蛋白的原料易得、資源相對豐富、不佔耕地、不依靠海洋、生產不 受氣候條件影響、生產速度快。
2008年4月，聯合國糧農組織稱，由於許多適合種植糧食的土地，已經 被大量用來建造城市、商業中心、甚至是高爾夫球場，使得全球範圍內很多 國家都開始面臨糧食危機，亞洲、非洲地區的一些貧困國家首當其衝，目前 全球糧食儲備己降至1980年以來的最低水平。而以大豆等糧食為主要原料的 飼料行業也理所當然的受到了嚴重衝擊，因此，以工業甲醇為原料的甲醇蛋 白，作為一種新型生物蛋白飼料正受到了世界範圍內的廣泛關注。
有關專家分析，到2010年和2020年，我國蛋白質飼料年需求量分別為 6000萬噸和7200萬噸，而供給量僅為2200萬噸和2400萬噸，供需缺口達 3800萬噸和4800萬噸。隨著市場對蛋白需求的增長，而魚粉和大豆資源有 限，無法滿足市場的需求，對甲醇蛋白的發展十分有利。據專家預測，我國 對甲醇蛋白的市場需求，目前每年約為300-500萬噸。單細胞蛋白可以製成"人造肉"，供人們直接食用，還可以作為食品添加 劑，用以補充蛋白質或維生素、礦物質等。由於某些單細胞蛋白具有抗氧化 能力，使食物不容易變質，因而常用於嬰兒粉及湯料、作料中。乾酵母的含 熱量低，常作為減肥食品的添加劑。此外，單細胞蛋白還能提高食品的某些 物理性能，如義大利烘餅中加入活性酵母，可以提高餅的延薄性能。酵母的 濃縮蛋白具有顯著的鮮味，已廣泛用作食品的增鮮劑。單細胞蛋白作為飼料 蛋白，也在世界範圍內得到了廣泛應用。
世界範圍來看，甲醇蛋白的生產發酵時間一般達到160小時左右，發酵
溫度在30 38'C不等，利用本菌種發酵時間在80 90小時，發酵溫度3(TC，
實現了溫度相對較低、時間較短的高密度發酵。
發明內容
本發明的目的是針對甲醇蛋白生產發酵時間長等缺點，篩選出一株具有 工業化前景的畢赤酵母菌株，為甲醇單細胞蛋白的生產奠定基礎。
本發明的另一目的是提供一種利用畢赤酵母菌從工業甲醇生產單細胞蛋 白的方法。
本發明還有一個目的是提供該菌在詞料或食品添加劑方面的應用。
本發明的目的可以通過以下措施達到
本發明所述的酵母菌株為巴氏畢赤酵母(P/c/z/a pwto&)，編號為 ME-SCPOl，該菌株己於2008年4月29日保存中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，其保藏號為CGMCCNO:2477。
屍/c/z/a; wto&ME-SCP01屬於子囊菌門、半子囊菌綱、酵母目、酵母科、 酵母屬。在YPD培養基上細胞多數呈卵圓形、芽殖；菌落質地均勻，乳白無 光澤，表面溼潤、粘稠，易被挑起。
菌株ME-SCPOl能在無機鹽培養基上正常生長，能以葡萄糖、甘油、甲 醇等作為唯一碳源及能源。當以葡萄糖或甘油作碳源時，菌體中只有l個或 很少幾個小的過氧化物酶體，而以甲醇作為碳源時，過氧化物酶體幾乎佔到 整個細胞體積的80%,醇氧化酶增至細胞總蛋白的35%-40%。菌株ME-SCP01在20 37'C之間均能生長，最適生長溫度為27~30°C， 其中在3(TC的生長速率最快。培養基的pH值範圍在3.0-6.0之間，菌體生 長及合成蛋白質的最佳pH為5.0-6.0。
本發明同時提供了一種利用畢赤酵母以工業甲醇為原料生產單細胞蛋白 的工藝。
甲醇進入畢赤酵母細胞內的溶酶體，誘導醇氧化酶的表達，醇氧化酶則 將甲醇氧化為甲醛。 一部分甲醛繼續氧化為甲酸，最終生成C02釋放能量， 另一部分甲醛則通過5磷酸木酮糖循環生成3-磷酸甘油醛，然後進入主代謝 途徑，合成菌體。
利用巴氏畢赤酵母ME-SCP01生產單細胞蛋白的方法為先將菌株 ME-SCPOl/在初始碳源的條件下迅速繁殖菌體，當初始碳源消耗將盡時， 緩慢流加甲醇進行培養70 100小時，收集菌體，經乾燥、粉碎，得到單細 胞蛋白。具體為在少量甘油或葡萄糖作為初始碳源的條件下，迅速繁殖菌體， 當初始碳源消耗將盡時，緩慢流加甲醇，隨著菌體對甲醇的利用率的升高， 逐漸提高甲醇流加速率，最高可達到8-10mhh、l"左右，經過80-90小時(優 選)的培養，細胞實現了高密度培養，菌體乾重可以達到120-130克/升，粗 蛋白含量達到了50%。通過離心等方法收穫菌體，經流化床乾燥及粉碎機簡 單粉碎後即可用作蛋白飼料；經過深加工，分離提出菌體中的總蛋白，可以 用作飼料或食品添加劑，如蛋白添加劑等。
巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)是少數幾種能以甲醇為唯一碳源及能源 的微生物之一。本專利所述的菌株屍/c/2/a戶加n's ME-SCP01能利用常規的工 業甲醇生產菌體蛋白，與模式畢赤酵母GS115相比，生長速率更快，因此具 有更大的商業前景。
生物材料保藏信息畢赤酵母菌，其分類命名為巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)ME-SCP01，已於2008年4月29日在中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址中國.北京.朝陽區大屯路)保 藏，其保藏號為CGMCCN0.2477。
具體實施例方式
實施例l:菌株ME-SCP01的分離及培養條件
在分析四川宏泰化工有限公司工業廢水處理系統的好氧活性汙泥中主要 微生物種群時，在牛肉膏-蛋白腖培養基上分離出了多株從屬於芽孢桿菌屬、 假單胞菌屬以及酵母屬的微生物。對其中一株畢赤酵母的甲醇利用能力進行 了測試，並以畢赤酵母GS115作為對照。初步試驗表明，該畢赤酵母利用甲 醇的速度比菌株GS115更快、耐受甲醇的濃度更高。因此，利用該畢赤酵母 可以進行單細胞蛋白的生產。將該菌株命名為ME-SCPOl。
菌株ME-SCPOl的培養及保存採用常規的YEPD複合培養基酵母提取 物、1%，蛋白腖、2%，葡萄糖、2%。製備固體培養基時在滅菌前向液體YEPD 中加入2%的瓊脂。
菌株ME-SCP01的最佳培養溫度為30 °C 。液體培養時，在250 ml的三 角瓶中裝液50ml，搖床轉速為200rpm。 實施例2:菌株ME-SCPOl的種子培養
一級搖床種子 一級液體種子的培養採用YEPD培養基(配方同上)。 首先將菌種ME-SCP01從保存的YEPD斜面接種至裝有100 ml液體YEPD 培養基的250ml三角瓶，30 。C搖床培養24-30小時，轉速為200rpm。
二級種子將一級種子按照10%的接種量轉接至裝有6升液體培養基的 IO升發酵罐，培養條件通氣量l-2vv/m，攪拌速度600-800 rpm，培養時 間24-30小時，培養溫度3(TC。培養基選用無機鹽培養基，具體配方如下 甘油、40 g， CaS04、 0.9 g， K2S04、 14.3 g， MgS04'7H20、 11.8 g， KOH、 3.8 g， H3P04(85%)、 20 ml,微量元素液20ml，用蒸餾水定容至1升，121 °C 滅菌30分鐘，冷卻過後用過濾除菌的氨水將pH值調整到5.0-6.0之間。微 量元素液配方CuS04-5H20、 2 g, Nal、 0.05 g， MnS(VH20、 2 g， Na2MoO4.2H2O、0.15 g， H3BO3、0.02 g， CoCl2、0.5 g， ZnCl2、 15 g， FeS04-7H20、 20 g，生物素、0.2 g， H2S04、 3.5 ml，用蒸餾水定容至1升，過濾除菌。
三級及後續種子依次將前一級種子按照10%的接種量接入體積按10倍逐級放大的發酵罐。培養基、培養條件與二級種子所述一致。
實施例3:菌株ME-SCP01的7升罐高密度發酵試驗
甲醇在培養基中的質量分數最多只能保持在1%，過高的甲醇濃度會抑 制菌體ME-SCPOl的生長甚至毒死其細胞。因此，對於甲醇作為碳源的發酵 實驗，採用了連續流加的方式。
對菌株ME-SCPOl進行了 7升罐(NBS改裝罐)的發酵實驗，裝液量為 3.5升，發酵培養基配方與實施例2中二級種子培養基配方一致，採用無機鹽 配方，初始碳源為甘油。發酵罐中加入適量消泡劑。
種子準備按照實施例2所述方法準備300 ml的一級種子； 高密度發酵培養將種子全部接入發酵罐，3CTC攪拌培養，攪拌轉速為 800-1000 rpm。通氣量為1.5 vvm。 pH設定為5.4，採用流加氨水的方法穩定 pH值。在甘油耗盡後(大概20小時左右以後)，溶氧(D02)開始急劇上升， 此時開始緩慢流加甲醇，始終將溶氧水平控制在最大溶氧水平的25%左右。 002低於25%，減緩甲醇流加速度，高於25%，適當增加甲醇流加速度，甲 醇的最高流加速度可以達到8 ml，h—M—1。發酵進行到85小時後，甲醇利用速 率明顯減緩，細胞生長逐步進入衰亡期。
菌體的收集及蛋白含量檢測收集發酵液樣品，離心去水，蒸餾水洗滌 後再次離心去鹽，將離心獲得的溼菌體在105 'C烘箱烘乾至恆重，稱取其質 量，經過估算，通過本實例所述的發酵方法可以使發酵液的細胞乾重達到124 克/升，實現了高密度培養。
用超聲波將菌體破碎，通過考馬斯亮藍法測定了 ME-SCP01菌體的粗蛋 白含量，經過與標準曲線的估算，菌株ME-SCPOl中的總蛋白含量約為50%。 實施例4:菌株ME-SCPOl生產單細胞蛋白的1000升罐發酵工業流程 種子準備按照實施例3所述方法，準備60升三級液體種子。 發酵培養發酵培養基配方與實施例3中發酵培養基配方一致。 將種子罐種子全部接入1000升發酵罐，裝液量為600升，30 。C攪拌培 養，攪拌轉速為300-400rpm。通氣量為l-2vvm。 pH設定為5.4，採用流加氨水的方法穩定pH值。在甘油耗盡後流加甲醇，甲醇的最高流加速度可以 達到8-10ml.h人r1。發酵進行到80-90左右小時後，發酵終止。
甲醇蛋白製備發酵液經自動連續離心機離心濃縮，用自來水洗滌後再 次離心；溼菌體經流化床乾燥除水，將水分保持在10%以下，然後經粉碎機 粉碎成型，包裝即得到飼料級甲醇蛋白成品。
由於甲醇是連續少量流加，所以在產品中檢測不到甲醇的殘留。通過本 實例所述的發酵方法可以使發酵液的細胞乾重達到120-130克/升左右，菌株 ME-SCP01中的總蛋白含量約為50°/。。
權利要求
1、一種快速利用工業甲醇的畢赤酵母菌，其分類命名為巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)ME-SCP01，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，其保藏號為CGMCC NO.2477。
2、 利用權利要求1所述的畢赤酵母菌生產單細胞蛋白的方法，其特徵在 於先將菌株ME-SCPOl，在初始碳源的條件下迅速繁殖菌體，當初始碳源消 耗將盡時，緩慢流加甲醇進行培養70 100小時，收集菌體，乾燥、粉碎。
3、 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於流加甲醇時隨著菌體對甲醇 的利用率的升高，逐漸提高甲醇流加速率，最高達到8-10mHi'M—1。
4、 根據權利要求2所述的方法，其特徵在於培養時間為80 90小時。
5、 權利要求1所述的畢赤酵母菌在飼料或食品添加劑方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種能夠以工業甲醇為唯一碳源和能源的畢赤酵母菌，其分類命名為巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)ME-SCP01，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，菌種保藏號為CGMCC NO.2477。該菌株屬於快速利用甲醇型的畢赤酵母，能夠實現高密度細胞培養。利用該菌株可以進行單細胞蛋白的生產。1000升罐發酵實驗表明在接種量5％的情況下，經過約85小時的發酵培養，細胞乾重達到120-130克/升，粗蛋白含量達到了約50％。
文檔編號A23K1/16GK101307294SQ200810123749
公開日2008年11月19日 申請日期2008年6月2日 優先權日2008年6月2日
發明者何星材, 馮孝庭, 常淑梅, 熊世平, 肖愛華, 南 胡, 範益春, 董永良, 和 黃 申請人:南京工業大學;四川宏泰生化有限公司;江蘇煤化工程研究設計院有限公司