在培養基上分離微生物的方法及相關裝置製造方法

2023-09-19 07:29:20 2

在培養基上分離微生物的方法及相關裝置製造方法
【專利摘要】本發明涉及從可能被至少一種微生物汙染的樣品中分離所述至少一種微生物的方法，所述方法包括下述步驟：(a)提供用於分離微生物的裝置，所述裝置包含：不透水的底層、營養層、分離層和保護性頂層，所述營養層放置在所述底層上並且包含脫水的培養基，所述分離層是營養層中包括的成分可透過的，能夠將細菌保留在其表面上，並且覆蓋全部或部分營養層；(b)將預定體積的樣品沉積在所述分離層上；(c)通過用分離工具耗盡或者分層所述樣品而分離所述微生物；(d)將所述裝置在允許所述微生物生長的預定溫度溫育預定時間，所述方法還包括至少一個在步驟b)和/或c)和/或d)之前或同時用預定體積液體再水化培養基的步驟，優選在步驟b)和/或c)之前或同時。
【專利說明】在培養基上分離微生物的方法及相關裝置
[0001] 本發明一般地涉及微生物學分析領域。更具體地，本發明涉及分離至少一種得自 汙染樣品的微生物的方法。
[0002] 從待分析樣品或微生物懸液開始在凝膠培養基上分離微生物通常是許多微生物 學分析方法中不可或缺的步驟。這個步驟尤其用於進行鑑定、驗證樣品的微生物純度或者 通過計數由此獲得的分離的菌落進行細菌計數。
[0003] 分離技術的目的是在凝膠營養培養基上獲得可以直接使用的菌落（CDU)，用於鑑 定及確定對抗生素的敏感性。它們是本領域技術人員熟知的，劃線技術是參考技術。後者 包括通過以相等的每單位經過面積概率在表面上劃線而沉積接種物。在工具經過時，分布 的局部密度大約指數性降低。因此，從單一接種物製備一些塗布帶，所述帶之間有或沒有重 疊，以獲得合適的分布效果及在下一個塗布區段細菌的稀釋。在塗布結束時，細胞彼此充 分分離，由此以⑶U形式生長的微生物（可見的菌落或微菌落）沒有迭生，即使是部分迭 生。這種技術也可以通過旋轉平板單一連續螺旋接種而進行，或者通過由裝置驅動的磁珠 進行，產生不重疊或者任選地部分重疊的連續接種。
[0004] 另一種廣泛使用的技術包括通過在表面上塗布而在一皿膠化的培養基上分離。在 這種情況中，將低細胞密度的細胞混合物塗布在直徑9cm的培養皿中的凝膠表面上，所述 混合物使得可以對30-300個細胞進行培養，每個細胞生長成分離的菌落。當少於30個細 胞與營養凝膠接觸時，統計學問題影響計數準確度。
[0005] 當計數的數量超過300個細胞時，由於菌落表面的重疊產生計數誤差。塗布通常 通過一種包括例如與凝膠接觸的線性部分的工具實現，或者使用以無序運動在表面上隨機 滾動的直徑為幾毫米的珠實現。這種技術僅適合輕微汙染或者稀釋的樣品，因為由於生長， 高細胞數增加菌落的匯合概率。
[0006] 還可以在培養皿上通過深度接種進行分離。初始樣品稀釋若干次以充分降低微生 物群體數量及獲得分離的菌落。然後將小體積的每種稀釋樣品與液體凝膠混合，通常是過 度冷卻到大約45°C的瓊脂。立即將混合物倒入培養皿中，膠凝及溫育後，每個細胞被固定並 形成菌落。
[0007] 由於裝置的發展一些手工方法已自動化。例如在文獻EP-O 242 114的情況中就 是如此，其描述了用於用樣品接種培養基的設備和方法。所述方法包括從一個接種物進行 若干區段塗布。這些區段呈圓弧形並且通過4個不同塗布頭進行。通過後續區段的部分重 疊獲得樣品稀釋的效果。該文獻中描述的方法事實上非常類似於手工分離的參考方法。
[0008] 最近，已開發了新分離方法，通過使用如文獻W0-A-2005071055中描述的優化的 塗布器而改良細菌耗盡Gpuisement)。這尤其適用於 申請人:以P REVITM Isola出售的自 動化裝置中採用的接種方法。
[0009] 但是，這些分離技術僅在凝膠培養基上有效。
[0010] 在臨床診斷和食品工業微生物控制領域、藥品或化妝品工業領域，自19世紀末開 始，在培養皿中的凝膠培養基（最經常是瓊脂）構成了檢測和鑑定病原體微生物的不可或 缺的工具。
[0011] 但是，已開發了非常多的替代培養皿的產品。對於這些產品，再水化在原位進行， 即直接在用於接種和用於溫育的空間中。其中之一，包含可再水化營養素的petrifilm?系 統，被非常廣泛地使用。Nissui Pharmaceutical公司開發的另一種系統Compact Dry也包 括脫水培養基。這些培養基的優點是它們比即用瓊脂培養基保存更長時間。像petrifilm?， 它們也可以非常緊湊，因此使用的溫育空間小。可用於培養的表面有限，每細胞可利用的營 養素濃度適合產生比在傳統凝膠培養基上產生的直徑小的菌落，並且由於所用凝膠的低硬 度或者細菌的高擴散係數而導致菌落形態也可以被改變。
[0012] 無論如何，只能通過在再水化期間形成的凝膠在這些培養基上分離菌落，並且因 此從具有低汙染水平或者經歷一系列稀釋的初始樣品分離。要沉積在培養基上的終濃度必 須是300CFU/ml以下（CFU:菌落形成單位），這些常規數據取決於菌落大小。
[0013] 另外，這些培養基不能禁得起耗盡分離工具的機械應力而不受磨損。因此，這些可 以直接原位（即在用於接種和保溫的空間）再水化的培養基的主要問題之一是它們與手工 或自動化機械分離微生物不相容。當初始樣品被重汙染時（超過300CFU/ml)，它們需要進 行一系列稀釋，這意味著取更大樣品，浪費時間及消耗大量試劑（培養基、稀釋劑試管等）、 產生大體積廢物（高壓滅菌、處理成本）。另外，如果進行大量稀釋，有通過稀釋作用丟失靶 病原體微生物的風險，如果所述靶病原體微生物相對於總微生物群以少量存在。
[0014] 從所考慮的現有技術可以明了，還沒有在原位可以再水化的培養基上從待分析樣 品或細菌懸液開始進行的簡便分離方法，以允許獲得分離的菌落。
[0015] 因此，本發明的第一個目的是提供分離微生物的方法及相關裝置，其提供比現有 技術的方法和裝置更好的性能及應用更簡便。
[0016] 本發明的第二個目的是提供分離微生物的裝置和方法，其可以在微生物分離之前 或與其同時直接在用於接種和保溫的空間中可再水化或者再水化的培養基上使用。
[0017] 本發明的第三個目的是提供從具有高初始微生物濃度的樣品分離微生物的方法。
[0018] 本發明的第四個目的是提供分離方法，其也與微生物計數相容。
[0019] 本發明的第五個目的是提供與生色培養基的使用相容的分離裝置和方法。
[0020] 其中，這些目的由本發明實現，本發明提出一種用於從可能被至少一種微生物汙 染的樣品分離所述至少一種微生物的方法，所述方法包括如下步驟：
[0021] (a)提供用於分離微生物的裝置，所述裝置包含：
[0022] 〇不透水的底層，
[0023] 〇設置在底層上的營養層，包含脫水的培養基，
[0024] 〇分離層，其是營養層中包含的成分可透過的，能夠將細菌保留在其表面上，並且 覆蓋全部或部分營養層，
[0025] 〇保護性頂層；
[0026] (b)將限定體積的樣品沉積在所述分離層上；
[0027] (C)通過用分離工具耗盡或者塗布所述樣品而分離所述微生物；
[0028] (d)將所述裝置在允許所述微生物生長的預定溫度溫育預定時間，
[0029] 所述方法還包括至少一個在步驟b)和/或c)和/或d)之前或同時用預定體積 液體再水化培養基的步驟，優選在步驟b)和/或c)之前或同時。
[0030] 根據優選的實施方案，步驟a)中提到的裝置通過包括如下步驟的方法獲得：
[0031]-將所述預定體積液體倒在不透水層上，
[0032]-在營養層上設置分離層，將其整體放置在已事先接受所述預定體積液體的不透 水層上，以使所述脫水培養基瞬間均勻再水化，及
[0033] -然後將保護性頂層放在上面。
[0034] 換句話說，有利地，所述裝置通過依次疊加下述層而獲得：1)不透水層（優選已接 受所述預定體積液體），2)營養層，3)分離層，及4)保護性頂層，至少營養層2)和分離層 3)是彼此機械獨立的，由此它們可以容易地被分離。這尤其提供了上述兩層的每一層均可 以單獨出售和/或儲存的優勢。它們可以然後被用戶容易地疊加。優選地，所有層均彼此 機械獨立，從而它們可以容易地彼此分離。
[0035] "彼此機械獨立的層"是指未通過至少一種結合手段連接在一起的層，特別地，所 述結合手段可以是：
[0036] -物理性質的，例如一或多個夾子，或者
[0037] -化學性質的，如膠，在溶劑作用下使兩層的一些或全部融化，產生複合/雜合層 (也稱為"粘結層"），或者凝膠或膠凝劑，其至少部分置於所述層之間（即至少部分在所述 層之間的界面）。
[0038] 除了上述優勢（單獨出售和/或儲存營養層和分離層）， 申請人:發現與所有預期相 反，省略形成營養層和分離層之間的界面的結合手段使得可以通過降低這兩層之間的距離 而獲得沉積在分離層上的微生物的更好的生長和/或存活。事實上，這種結合手段的性質 是其減緩了營養素從再水化的營養層向存在於分離層上的微生物的傳遞，由此降低了這些 微生物的生長和/或存活機會。
[0039] 樣品是指通過通常稱為取樣的消減行為從實體分離的少部分或少量，用於分析目 的。
[0040] 樣品可以是生物學、人、動物、蔬菜或環境來源的。其可以涉及工業方法過程中的 產品或者終產品，例如食品。其因此可以對應生物學液體（全血、血清、血漿、尿、腦脊液、器 官分泌物）的樣品、組織樣品或分離的細胞樣品。其可以是工業來源的，即根據非窮舉列 表，空氣樣品、水樣品（從處理或製造過程中的表面、塊或產品取樣），食品來源的產品。在 食品來源的樣品中，非窮舉地，有來自乳製品（酸奶、奶酪等）、肉、魚、蛋、水果、蔬菜、水、飲 料（牛奶、果汁、蘇打水等）及終產品的組分或輔助產品的樣品。食品樣品可以最終從用於 動物的飼料獲得，如特別是作為動物飼料的食物。在分析之前，這個樣品可以經歷製備，如 通過本領域技術人員已知的方法富集、提取、濃縮、純化。根據優選的實施方案，沉積在培養 基上的樣品體積在10和1000 μ 1之間。
[0041] 就本發明而言，術語微生物包括革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌、酵母、黴菌、變形 蟲，及更一般地，肉眼不可見的單細胞生物，其可以在實驗室中操作和繁殖。
[0042] 根據本發明優選的實施方案，所述微生物是革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌，或者 酵母。
[0043] 革蘭氏陽性細菌有下述屬的細菌：腸球菌（Enterococcus)、鏈球菌 (Streptococcus)、乳桿菌（Lactobacillus)、雙歧桿菌（Bifidobacterium)、葡萄球菌 (Staphylococcus)、芽抱桿菌（Bacillus)、李斯特氏菌（Listeria)、梭菌（Clostridium)、 分枝桿菌（Mycobacteria)、諾卡氏菌（Nocardia)、棒桿菌（Corynebacteria)、微球菌 (Micrococcus)和異常球菌（Deinococcus)。
[0044] 酵母有下述屬的酵母：假絲酵母（Candida)、隱球酵母（Cryptococcus)、糖酵母 (Saccharomyces)和絲抱酵母（Trichosporon)。
[0045] 黴菌有下述屬的黴菌：麴黴（Aspergillus)、青黴（Penicillium)、枝孢菌 (Cladosporium)〇
[0046] 本發明還涉及培養微生物的裝置，包括：
[0047] 〇不透水的底層；
[0048] 〇設置在底層上的營養層，包括脫水培養基；
[0049] 〇分離層，其是營養層中包含的成分可透過的，能夠將細菌保留在其表面上，並且 覆蓋全部或部分營養層；
[0050] 〇保護性頂層。
[0051] 優選地，如已經提及的，營養層和分離層是彼此機械獨立的。
[0052] 就本發明而言，營養層包含含有脫水培養基的支持物。所述支持物可以基於各種 具有非常強保水能力的吸附化合物，如人造絲、棉、天然的或化學修飾的纖維素纖維如羧甲 基纖維素、吸收性或超吸收性化學聚合物如聚丙烯酸鹽、丙烯酸/丙烯醯胺共聚物。這種支 持物可以用液體形式的培養基浸漬然後脫水，即具有與微生物生長不相容的Aw (水活性）。 或者，其用粉末形式的培養基或其組分覆蓋或者乾式浸漬。或者，對液體浸漬經脫水後，可 根據上述手段通過加入粉末進行補充。
[0053] 培養基是指包含微生物存活和/或生長所需的所有成分的介質。在實踐中，本領 域技術人員會根據本領域技術人員熟知的並且在其能力內的標準根據靶微生物選擇培養 基。·
[0054] 本發明的營養層可以含有任選的添加劑，例如：腖、一或多種生長因子、碳水化合 物、一或多種選擇劑、緩衝液、染料、一或多種膠凝劑、水凝膠、粘性劑等。
[0055] 優選地，培養基含有很少或者不含冷膠凝劑，例如瓊脂、瓊脂糖、泊洛沙姆、瓜爾 膠、黃原膠等。通常，營養層可以另外含有底物，使得可以基於可檢測信號直接或間接檢測 靶微生物的酶學或代謝活性。對於直接檢測，這個底物可以與用作螢光或生色標記的部分 結合。對於間接檢測，本發明的營養層可以另外包含PH指示劑，其對由於底物消耗誘導的 PH變化敏感並揭示靶微生物的生長。所述pH指示劑可以是生色團或者螢光團。生色團的 例子有中性紅、苯胺藍、溴甲酚藍。螢光團包括例如4-甲基傘形酮、羥基香豆素衍生物或 者試滷靈衍生物。因此，優選用於進行本發明方法的PC-PLC螢光底物對應4-甲基-傘形 酮-膽鹼磷酸（4MU-CP)。
[0056] 根據本發明優選的實施方案，在用脫水培養基幹式浸漬營養層之後，後者經歷壓 延操作。通過所產生的壓力和加熱的溫度，壓延使得脫水培養基保留在營養層中並穩定保 持一段時間，保證營養素保留在營養層中。還可以獲得營養層的非常平滑和平坦的表面。 這對於當分離層置於營養層之上時保證營養層和分離層之間良好結合是特別有利的。除 了加速營養層相對於未壓延營養層的再水化之外，壓延使得組成營養層的纖維壓縮。這種 壓縮與營養層內存在的脫水培養基組合，使其毛細能力大大增加，導致其幾乎瞬間再水化 並且產生置於其上的分離層的吸入現象。分離層然後相對於營養層變平（同時與其機械獨 立），由此保證兩層之間沒有空隙，因此保證在分離層完整表面上的最佳微生物生長和/或 存活。因此，在分離層和營養層之間無需藉助於結合手段（例如粘合層）。這表現了顯著優 勢，因為所述結合手段減慢了營養素從再水化的營養層向分離層上存在的微生物的傳遞， 由此降低這些微生物的生長和/或存活機會。
[0057] 如上所述，分離營養層和分離層，由此使得兩層單獨出售和/或儲存的可能性，代 表了真正的工業的額外收穫。這種技術效果然後使得營養層和分離層被彼此獨立考慮，包 括從商業和/或物流（儲存）立場出發。這表現了對於用戶的顯著優勢，用戶能夠隨意組 合具有不同性質的營養層和分離層，適合於待檢測的微生物。
[0058] 分離層是指這樣的層，其主要成分是通過其性質、大小及其立體安排將微生物保 持在其表面上同時能透過位於分離層之下的營養層中包含的成分的材料。
[0059] 分離層可以基於一或多種材料或這些材料的衍生物，如膠乳、聚四氟乙烯、聚偏氟 乙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚醯胺、聚碸、聚醚碸、纖維素、纖維素混合物和硝基纖維素。有 利地，分離層是多孔的，優選其是可透過營養層中包含的成分的多孔膜，能夠將微生物保留 在其表面上，並且覆蓋營養層的全部或部分。 申請人:發現目前市售的用於水（及一般地液 體）微孔過濾的膜通常具有用作分離層所需的性質。它們使得可以獲得對操作過程中的撕 裂非常好的抗性，受控的孔隙度，非常平滑的特徵，厚度小並且大多數時間是高度親水的。 它們的顏色通常是白色，使得可以優化區分在其表面上的染色的菌落。 申請人:令人驚奇地 發現，將這些過濾膜不用於"傳統"過濾液體的功能（就像用於水或一般地用於液體的過 濾）而是作為平滑和強力的支持物用於在其表面上分離測試樣品，特別適合實施本發明。 考慮到過濾膜的過濾能力和親水性，它們被利用以允許和優化營養層中存在的液體營養素 向分離層的傳遞（在其再水化之後），同時防止接種在分離層表面上的細菌、酵母和黴菌向 相反方向迀移。
[0060] 為本申請目的，上述過濾膜被稱為"過濾膜"或"微孔過濾膜"或"濾膜"，這些表達 是同義的。這些過濾膜包括在多孔膜範疇內。
[0061] 在本發明的一個實施方案中，分離層是活性的。因此其可以含有是細菌受體的特 異性位點，如抗體或抗體片段、噬菌體或噬菌體片段、適體或任何特異性配體，其可以共價 固定或者通過類似的生化元件間接固定，至少其中之一是共價固定的，例如使用鏈黴抗生 物素蛋白和生物素的系統。
[0062] 或者，分離層是活性的，含有抑制或破壞細菌的化合物，如噬菌體、抗細菌肽、抗生 素，其可以固定在或者可以不固定在分離層之中或之上。所述化合物可以共價固定或者通 過相關生化元件間接固定。另外，在本發明另一個實施方案中，分離層是活性的，含有刺激 或加速微生物生長的成分。作為一個實例，粘性物質如聚乙二醇被設置在分離層上。
[0063] 分離可以在分離層的部分或全部上進行，限定用於分離的有用表面。
[0064] 分離層包括允許來自營養培養基的成分及選擇試劑或反應試劑傳遞的表面。
[0065] 有利地，分離層包含直徑在0. 01和0. 8 μ m之間、優選在0. 2 μ m和0. 6 μ m之間的 孔，以將細菌、酵母和黴菌保留在其表面上。根據特定實施方案，分離層包含直徑在0. 25 μ m 和0. 6 μπι之間、例如在0. 3 μπι和0. 6 μπι之間或者在0. 4 μπι和0. 6 μπι之間的孔。
[0066] 或者，其可以是不具有可測量的孔的層，如透析膜，可透水和化合物的纖維素膜並 且由其保留具有超過閾值的分子大小的化合物的能力定義。有利地，所述膜允許保留分子 量大於500000道爾頓（或者在5000和500000道爾頓之間）的化學分子。
[0067] 有利地，分離層包括限定區，使得其可以幫助分離微生物。所述限定區也可以降低 生長時間，因此更快獲得結果。
[0068] 在一個實施方案中，分離層具有疏水和/或親水單元，用於為細菌的生長進行空 間劃界。親水單元的大小在10和500 μ m之間，優選在300和500 μ m之間，即直徑大於眼 睛的分辨力。屆時便是經典微生物學及目測觀察的問題。
[0069] 在另一個實施方案中，分離層含有納米結構單元，不適合微生物生長，劃界允許微 生物生長的限定區。
[0070] 疏水單元以表面圖案形式設置，所述圖案是規則或不規則網格，規則或不規則六 邊形組裝或者兩種圖案的混合物，或者任選其他形式。
[0071] 製備這種疏水單元的想要的材料包括蠟、疏水墨水、環氧樹脂、矽油、矽蠟、聚苯乙 烯樹脂、氧化鋁、聚氟乙烯等。
[0072] 分離層覆蓋營養層的全部或部分。分離層位於營養層之上，部分覆蓋所述營養層 以允許培養基被液體再水化。在一個優選實施方案中，營養層可以由分離層完全覆蓋。
[0073] 所述裝置可以含有至少一個與營養層接觸的再水化工具，如附著於所述裝置或者 包括在所述裝置中的貯存器和/或通道，以允許使得營養層底部或側部、優選其底部再水 化。
[0074] 用於分離的有用表面可以由不允許微生物生長的區圍繞。其可以是由不可滲透的 材料製成的區或疏水區。有利地，可以構造所述區指導手工使用。
[0075] "分離工具"應理解是指通過在培養基上移動而沉積樣品以允許微生物與培養基 接觸的工具。隨著樣品和/或分離工具之間發生摩擦樣品耗盡，要分離的細胞被沉積，由此 生長後，可以獲得分離的菌落。
[0076] 分離工具具有與所述培養基接觸的一或多個表面。這種工具可以通常手工使用， 例如環、鉑金環、移液器、研磨棍、包含末端球的棍、拭子等。其也可以是珠。
[0077] 有利地，本發明方法可以通過自動化系統執行。特別合適的系統是如在專利申請 W0-A-2005071055中保護的並由 申請人:上市的PREVI? Isola系統。
[0078] 根據本發明，培養基用預定體積的液體再水化。
[0079] 合適體積的液體在培養基中傳送。實踐中，本領域技術人員能根據液體粘度、營 養層直徑選擇合適的液體體積，以再水化培養基並且使微生物生長。再水化步驟在步驟b) 和/或c)和/或d)之前或與其同時進行，優選在步驟b)和/或c)之前或與其同時進行。 在一個特定實施方案中，液體用移液器手動添加或者自動添加。在另一個實施方案中，液體 包含在至少一個集成在裝置中的貯存器中和/或通道中，以允許營養層再水化。液體然後 通過簡單壓迫貯存器在營養層中擴散。經過底部和/或側部優選經過底部再水化的優勢是 其使得均勻水化整個營養層。這個實施方案顯著防止營養層的營養素被液體帶走到裝置底 部。
[0080] 根據本發明一個實施方案，用於使培養基復原的液體是水性溶液。根據一個特定 實施方案，所述液體含有具有脂質包膜的微粒，優選地所述液體含有紅細胞。
[0081] 液體也可以是緩衝液或者含有培養基補充物如抗生素或底物的溶液。
[0082] 根據本發明，所述裝置在營養層和分離層的任一側包含：
[0083] 不透水的底層，
[0084] 保護性頂層。
[0085] 所述頂層可以是半透明或透明的，由此菌落透過此層可見。優選地，保護性頂層通 過隔離工具與菌落隔離。隔離工具可以是側壁或使得頂層不與菌落接觸的任何其它工具。
[0086] 有利地，所述頂層能夠擱在分離層不允許微生物生長的部分如外圍區或疏水單元 上。
[0087] 所述頂層的一側可以通過任意手段例如粘合劑或機械手段附著於裝置的其它層 上。
[0088] 其還使得可以在溫育期間防止汙染。其是細菌不透性的並且限制水蒸氣損失。事 實上，所述裝置在允許微生物生長的預定溫度溫育預定時間，不依賴於環境溼度條件。因 此，選擇頂層的性質以允許微生物生長的氣體交換，同時允許局部水化。底層是不透水的。 優選地，底層是剛性的，使得能用手更好抓住裝置。其從諸如聚酯、聚丙烯、聚苯乙烯的化合 物製成。優選地，其從纖維素製成。其可以是紙板或紙，組合不透水的膜。其可以含有熱成 型通道，用於合適的營養層再水化。
[0089] 有利地，裝置的各層是由可循環材料製備。
[0090] 根據本發明的特定實施方案，底層和/或營養層和/或分離層是半透明或透明的。
[0091] 根據本發明的特定實施方案，所述裝置也包含識別碼如條形碼或RFID標籤。
[0092] 本發明的裝置可以是常規形狀，即圓形。不過，其可以是不同形狀，特別是方形或 者矩形。根據另一種變體，各層可以是不同形狀。因此，例如，頂層、底層和營養層可以是方 形，分離層和/或用於分離的表面可以是圓形。各層可以是不同顏色，幫助辨別疑似的細 菌。
[0093] 本發明還涉及本發明裝置的應用。
[0094] 參照附圖閱讀說明書會更好地理解本發明、其功能、其應用及其優勢，其中：
[0095] -圖IA和IB是本發明裝置示意圖。裝置10包含不透水底層14、營養層12 (設置 在底層上，包含脫水培養基）、分離層20 (可透過營養層中包含的成分、能將細菌保留在其 表面上並且覆蓋全部或部分營養層）、保護性頂層15。這個裝置還包含親水/疏水區13、貯 存器19和通道18,允許營養層底部或側部再水化。
[0096] 所述裝置可以具有單獨的裝置16,使得頂層15不與菌落接觸。
[0097] -圖2A是本發明裝置的照片，其具有25cm2有用分離面積；
[0098] -圖2B示出所述裝置中心部分的放大的圖片。所述裝置用濃度為IO8CFUAiI的大 腸桿菌（Esherichia coli)樣品接種。
[0099] -圖3作為一個實例，示出在UriSelect?4培養基存在下用肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae)菌株接種的培養皿的內容物，分離層包括Macherey Nagel硝酸 纖維素過濾膜。
[0100]-圖4作為一個實例，示出在UriSelectTM4培養基存在下用肺炎克雷伯氏菌菌株 接種的培養皿的內容物，分離層包括Sartorius硝酸過濾膜。
[0101] -圖5作為一個實例，示出在UriSelect?4培養基存在下用肺炎克雷伯氏菌菌株 接種的培養皿的內容物，分離層包括醋酸纖維素過濾膜。
[0102] -圖6作為一個實例，示出在UriSelectTM4培養基存在下用肺炎克雷伯氏菌菌株 接種的培養皿的內容物，分離層包括聚酯過濾膜。
[0103] -圖7作為一個實例，示出在UriSeleCtTM4培養基存在下用大腸桿菌菌株接種的 培養皿的內容物，分離層包括Macherey Nagel硝酸纖維素過濾膜。
[0104] -圖8作為一個實例，示出在UriSeleCtTM4培養基存在下用大腸桿菌菌株接種的 培養皿的內容物，分離層包括聚酯過濾膜。
[0105] -圖9作為一個實例，示出在UriSeleCtTM4培養基存在下用大腸桿菌菌株接種的 培養皿的內容物，分離層包括醋酸纖維素過濾膜。
[0106] -圖10作為一個實例，示出在UriSeleCtTM4培養基存在下用大腸桿菌菌株接種的 培養皿的內容物，分離層包括聚酯過濾膜。
[0107] -圖11作為一個實例，示出在大腸桿菌菌株樣品存在下，在UriSeleCtTM4瓊脂培養 基存在下及在浸漬在營養層上的脫水UriSel ect?4培養基存在下的4個培養皿的內容物， 所述營養層包含Glatfelter型無紡支持物，Airlaid 150g/m2。
[0108] -圖12作為一個實例，示出在陰溝腸桿菌菌株樣品存在下，在UriSeleCtTM4瓊脂 培養基存在下及在浸漬在營養層中的脫水UriSelect TM4培養基存在下的4個培養皿的內容 物，所述營養層包含Glatfelter型無紡支持物，Airlaid 150g/m2。
[0109] -圖13作為一個實例，示出圖16的細節，顯示出兩個培養皿的內容物。
[0110] -圖14作為一個實例，示出在Clostridium freundii菌株樣品存在下及在分離層 如醋酸纖維素過濾膜存在下，在營養層中浸漬的UriSelect TM4培養基存在下的4個培養皿 的內容物，所述營養層包含Glatfelter型無紡支持物，Airlaid 150g/m2。
[0111] -圖15作為一個實例，示出在奠腸球菌（Enterococcus faecalis)樣品存在下，包 含營養層的培養皿的內容物，所述營養層含有用Chrom ID CPS ID3型瓊脂培養基浸漬的無 紡支持物。
[0112] -圖16示出包含營養層的培養皿的內容物，所述營養層含有用Chrom ID CPS3型 脫水並且不含瓊脂的培養基浸漬的Airlaid MH 100137型無紡支持物。
[0113] -圖17作為一個實例，示出在分離層如聚醋過濾膜和陰溝腸桿菌（Enterococcus cloacae)樣品存在下，在Chrom ID CPS ID3瓊脂培養基型培養基及包含無紡支持物的營養 層存在下培養皿的內容物，所述無紡支持物用ChromID CPS3型脫水並且不含瓊脂的培養基 浸漬。
[0114] -圖18示出在分離層如聚酯膜存在下，營養層的細節，所述營養層包含用不含瓊 脂的Chrom ID CPS ID3型培養基浸漬的Airlaid MH 100137型無紡支持物。
[0115] -圖19示出圖18的支持物的另一個實例。 實施例
[0116] 實施例1 :在Petrifilm再水化培養基h從重汙染溶液獲得分離的菌落
[0117] 從校準為IO8CFUAiI理論細菌負荷的溶液，1000 μ 1加載不同濃度大腸桿菌的溶液 沉積在Petrifilm?底層膜的中心，所述溶液通過連續10倍稀釋而獲得。Petrifilm?的頂 層膜下降到樣品上。塑料擴散器凹面向下放置在Petrifilm?測定的中心。通過在塑料擴 散器中心輕輕加壓使樣品均勻分布。接種物由此在凝膠形成之前分布在整個生長區。
[0118] 表 1 :
[0119]
【權利要求】
1. 從可能被至少一種微生物汙染的樣品中分離所述至少一種微生物的方法，所述方法 包括下述步驟： (a) 提供用於分離微生物的裝置，所述裝置包含： 〇不透水的底層， 〇設置在所述底層上的營養層，包含脫水的培養基， 〇分離層，其是營養層中所包含的成分可透過的，能夠將細菌保留在其表面上，並且覆 蓋全部或部分營養層， 〇保護性頂層； (b) 將限定體積的樣品沉積在所述分離層上； (c) 通過用分離工具耗盡或者塗布所述樣品而分離所述微生物； (d) 將所述裝置在允許所述微生物生長的預定溫度溫育預定時間， 所述方法還包括至少一個在步驟b)和/或c)和/或d)之前或同時用預定體積液體 再水化培養基的步驟，優選在步驟b)和/或c)之前或同時。
2. 權利要求1的方法，其中所述分離層具有親水性和/或疏水性單元。
3. 權利要求1或2的方法，其中所述裝置還包含識別碼，如條形碼或RFID標籤。
4. 權利要求1-3之一的方法，其中用於再水化培養基的液體是水性溶液和/或含有具 有脂質包膜的微粒的液體。
5. 權利要求1-4之一的方法，其中至少所述營養層和所述分離層在所述裝置內是彼此 機械獨立的。
6. 權利要求1-5之一的方法，其中所述營養層包含含有脫水培養基的支持物，所述營 養層通過用脫水培養基浸漬，優選乾式浸漬，所述支持物，然後壓延而獲得；所述支持物是 例如無紡支持物。
7. 用於微生物培養的裝置，包含： 〇不透水的底層； 〇設置在所述底層上的營養層，包含脫水培養基； 〇分離層，其是營養層中包含的成分可透過的，能夠將細菌保留在其表面上，並且覆蓋 全部或部分營養層； 〇保護性頂層， 其中至少所述營養層和所述分離層是彼此機械獨立的。
8. 權利要求7的裝置，所述裝置包含至少一個與所述裝置集成的貯存器和/或通道，以 允許營養層再水化。
9. 權利要求7或8的裝置，其中所述分離層是多孔膜，優選用於液體微孔過濾的膜。
10. 權利要求7-9之一的裝置，其中所述分離層含有親水性和/或疏水性單元。
11. 權利要求7-10之一的裝置，其中所述營養層包含含有脫水培養基的支持物，所述 營養層通過用脫水培養基浸漬，優選乾式浸漬，所述支持物，然後壓延而獲得；所述支持物 是例如無紡支持物。
12. 權利要求7-11之一的裝置用於分離至少一種微生物的用途。
13. 獲得權利要求7-11之一的裝置的方法，所述方法包括下述步驟： -將所述預定體積的液體倒在所述不透水層上， -在所述營養層上設置所述分離層，將其整體放置在已事先接受所述預定體積液體的 不透水層上，以使所述脫水培養基瞬間均勻再水化，及 -然後將保護性頂層放在上面。
14.可由權利要求13的方法獲得的裝置。
【文檔編號】C12M1/26GK104487563SQ201380038691
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2013年7月22日 優先權日:2012年7月20日
【發明者】J-P·弗朗德魯瓦, B·利蒙, C·羅藏, M-P·蒙泰 申請人:生物梅裡埃公司