生物人工肝用細胞源的培養液的製作方法

2023-09-18 22:40:20 2

生物人工肝用細胞源的培養液的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種生物人工肝用細胞源的培養液，包括由低糖型DMEM培養液和胎牛血清按照體積比8～12:1的比例組成的混合液，所述混合液中還含有60～140U/L的胰島素、3～9μg/L的肝細胞生長因子、0.5～2g/L的異甘草酸鎂、3～10mg/L的牛磺熊去氧膽酸、50～100U/mL的青鏈雙抗。本發明的生物人工肝用細胞源的培養液通過改進現有的DMEM培養基，添加保護肝細胞的胰島素、肝細胞生長因子、異甘草酸鎂、牛磺熊去氧膽酸，達到促進肝細胞或類肝細胞的生長，並有利於細胞向更好發揮肝功能的方向發展，特別能有效提高細胞在高膽紅素血症環境時的成活率和存活時間，提高療效。適用於各類肝細胞和類肝細胞的培養，特別適合L-02細胞的培養。
【專利說明】生物人工肝用細胞源的培養液
【技術領域】
[0001]本發明涉及肝細胞及類肝細胞培養【技術領域】，具體地指一種生物人工肝用細胞源的培養液。
【背景技術】
[0002]我國是世界上肝病最嚴重的國家，每年肝衰竭新發病人數超過100萬，每年約50萬肝功衰竭患者因得不到有效治療而死亡。治癒機會只有一種，即肝移植，但由於肝臟來源困難，等待時間長，或根本沒有機會得到供肝，因此絕大多數病人根本沒有生存機會。因此，急需人工肝系統維持病人生命，等待肝移植機會，或病人自身肝恢復的機會。
[0003]但由於傳統的人工肝(即物理人工肝)成本極高，大多數病人都無法承擔，療效非常有限，不能明顯減少肝功能衰竭的死亡率，故臨床應用受到限制。近年來，將活性肝細胞或類肝細胞加入到人工肝系統內以改進療效，已成為世界研發熱點，這種以肝細胞充填反應器為基礎的人工肝稱為生物人工肝(bio-artificial liver，BAL)，大量研究證明其療效明顯優於物理人工肝，能明顯減少肝功能衰竭病死率，明顯延長生存期，為急性肝功能衰竭病患的自身肝臟恢復和慢性肝功能衰竭病患等待肝移植創造了條件。
[0004]現有生物人工肝採用的細胞有多種，包括豬肝細胞、永生化人肝細胞、人肝癌細胞系、C3A細胞、L-02永生化肝細胞等細胞源，這些細胞多採用DMEM培養液來培養，DMEM是一種含各種胺基酸和葡萄糖的培養基，是在MEM培養基的基礎上研製的。分為高糖型(糖分在1000~4500mg/L)和低糖型(糖分低於1000mg/L)。高糖型有利於細胞停泊於一個位置生長，適於生長較快、 附著較困難腫瘤細胞等。現有技術中還存在DMEM培養液的改進型，針對不同的細胞，添加肝細胞生長因子、胰島素等。
[0005]由於生物人工肝在臨床實際應用中，肝功能衰竭患者血液中的膽紅素很高，生物人工肝系統中的肝細胞或類肝細胞有可能無法耐受高膽紅素帶來的毒性而凋亡，從而降低治療效果，最終降低患者的生存率。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在於克服現有肝細胞培養液無法對抗高膽紅素毒性，易使人工肝系統中的肝細胞或類肝細胞凋亡的缺陷，提供一種能夠抗膽紅素毒性的生物人工肝用細胞源的培養液。
[0007]為實現上述目的，本發明所設計的生物人工肝用細胞源的培養液，包括由低糖型DMEM培養液和胎牛血清按照體積比8~12:1的比例組成的混合液，所述混合液中還含有60~140U/L的胰島素、3~9μ g/L的肝細胞生長因子、0.5~2g/L的異甘草酸鎂、3~10mg/L的牛磺熊去氧膽酸、50~100U/mL的青鏈雙抗。
[0008]優選地，所述混合液由低糖型DMEM培養液和胎牛血清按照體積比10:1的比例組成。
[0009]優選地，所述混合液中含有80~120U/L的胰島素、4~6 μ g/L的肝細胞生長因子、0.8~1.2g/L的異甘草酸鎂、5~8mg/L的牛磺熊去氧膽酸、60~90U/mL的青鏈雙抗。
[0010]更優選地，所述混合液中含有100U/L的胰島素、5 μ g/L的肝細胞生長因子、lg/L的異甘草酸鎂、6mg/L的牛磺熊去氧膽酸、80U/mL的青鏈雙抗。
[0011]優選地，所述混合液中還含有8.5~9.5mg/L的L-丙氨酸、13.2mg/L的L-天冬醯胺、11.5mg/L的L-脯氨酸、14.7mg/L的L-穀氨酸。。
[0012]更優選地，所述混合液中還含有8.9mg/L的L-丙氨酸、13.2mg/L的L-天冬醯胺、
11.5mg/L的L-脯氨酸、14.7mg/L的L-穀氨酸。
[0013]本發明培養液中添加的部分組分功能如下:
[0014]胰島素作用:改善細胞糖利用，促進生長。
[0015]肝細胞生長因子作用:刺激肝細胞生長、防治肝細胞凋亡。
[0016]異甘草酸鎂作用:具有抗炎、抗氧化、抗肝臟毒物、穩定細胞膜、抗肝纖維化、調節免疫、抑制Ca2+內流、防止細胞凋亡以及增加內源性類固醇產生等多種功效。
[0017]牛磺熊去氧膽酸(TUDCA)的作用:利膽、細胞保護、拮抗疏水性膽汁酸的細胞毒性、抗凋亡、抗氧化和免疫調節功能等。
[0018]通過上述四種添加物質的協同作用，是培養的肝細胞達到抗凋亡、抗氧化、抗細胞毒性的效果。
[0019]本發明的有益效果:生物人工肝用細胞源的培養液通過改進現有的DMEM培養基，添加保護肝細胞的胰島素、肝細胞生長因子、異甘草酸鎂、牛磺熊去氧膽酸，達到促進肝細胞生長，並有利於細胞向更好發揮肝功能方向發展，有效提高肝細胞或類肝細胞在高膽紅素血症應用時的成活率和存活時間，有利於提高療效。適用於各類肝細胞及類肝細胞的培養，特別適合L-02細胞的培養。
【具體實施方式】
[0020]以下結合具體實施例對本發明作進一步的詳細描述。
[0021]本實施例中採用兩種DMEM低糖型培養液，配方如下:
[0022]l)DMEM(A)培養液(以下添加物為粉末型)成分表
[0023]
【權利要求】
1.一種生物人工肝用細胞源的培養液，其特徵在於:包括由低糖型DMEM培養液和胎牛血清按照體積比8~12:1的比例組成的混合液，所述混合液中還含有60~140U/L的胰島素、3~9 μ g/L的肝細胞生長因子、0.5~2g/L的異甘草酸鎂、3~10mg/L的牛磺熊去氧膽酸、50~100U/mL的青鏈雙抗。
2.根據權利要求1所述生物人工肝用細胞源的培養液，其特徵在於:所述混合液由低糖型DMEM培養液和胎牛血清按照體積比10:1的比例組成。
3.根據權利要求1或2所述生物人工肝用細胞源的培養液，其特徵在於:所述混合液中含有80~120U/L的胰島素、4~6 μ g/L的肝細胞生長因子、0.8~1.2g/L的異甘草酸鎂、5~8mg/L的牛磺熊去氧膽酸、60~90U/mL的青鏈雙抗。
4.根據權利要求1或2所述生物人工肝用細胞源的培養液，其特徵在於:所述混合液中含有100U/L的胰島素、5 μ g/L的肝細胞生長因子、lg/L的異甘草酸鎂、6mg/L的牛磺熊去氧膽酸、80U/mL的青鏈雙抗。
5.根據權利要求1或2所述生物人工肝用細胞源的培養液，其特徵在於:所述混合液中還含有8.5~9.5mg/L的L-丙氨酸、13~14mg/L的L-天冬醯胺、11~12mg/L的L-脯氨酸、14~15mg/L的L-穀氨酸。
6.根據權利要求3所述生物人工肝用細胞源的培養液，其特徵在於:所述混合液中還含有8.5~9.5mg/L的L-丙氨酸、13~14mg/L的L-天冬醯胺、11~12mg/L的L-脯氨酸、14~15mg/L的L-谷 氨酸。
7.根據權利要求4所述生物人工肝用細胞源的培養液，其特徵在於:所述混合液中還含有8.5~9.5mg/L的L-丙氨酸、13~14mg/L的L-天冬醯胺、11~12mg/L的L-脯氨酸、14~15mg/L的L-穀氨酸。
8.根據權利要求4所述生物人工肝用細胞源的培養液，其特徵在於:所述混合液中還含有8.9mg/L的L-丙氨酸、13.2mg/L的L-天冬醯胺、11.5mg/L的L-脯氨酸、14.7mg/L的L-穀氨酸。
【文檔編號】C12N5/071GK103952370SQ201410178735
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月29日 優先權日:2014年4月29日
【發明者】周平, 劉路 申請人:周平, 劉路