聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物及其製備方法和其製劑及應用的製作方法

2023-09-10 20:32:30

專利名稱：：聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物及其製備方法和其製劑及應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物及其製備方法和其製劑及應用，尤其涉及一種具有極低免疫原性和過敏性、能夠多次重複用藥，具有長效作用的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物及其製備方法和其製劑及應用。
背景技術：
：尿酸氧化酶(尿酸氧化還原酶，EC1.7.3.3，UrateOxidase,Uricase)參與生物體嘌呤代謝過程。嘌呤是機體內重要的生物活性分子，嘌呤核苷酸分解產生的產物黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下產生尿酸，尿酸可進一步分解為尿囊素、尿囊酸、C02和NH3。尿酸氧化酶將尿酸氧化為尿囊素。人類和一些靈長類動物體內缺乏有活性的尿酸氧化酶，因此尿酸是人類和這些動物嘌呤代謝的最終產物。尿酸溶解度較低，經尿酸氧化酶的作用後成為溶解度更高的尿囊素，使核酸代謝產物更容易排出體外。血漿尿酸飽和度37°C，pH7.4時為380420jimol/L(6.47.1mg/dL)，正常男性成人24小時尿尿酸總量小於600mg。由於尿酸產生增加或排除減少，血尿酸水平會升高。血液中尿酸濃度升高超過正常值時就是高尿酸血症，一般定義為血液中尿酸含量超過420nmol/L(7.0mg/dL)。產生高尿酸血症的原因包括體內嘌呤或尿酸較多，或是由食物攝取到的嘌呤太多，腎臟排洩的尿酸減少等三項。如果血液和尿液中尿酸濃度持續升高出現高尿酸血症，常導致疾病發生。隨著生活水平的不斷提高，高尿酸血症和痛風發病率明顯增高。流行病學的調査顯示，國外至上世紀90年代，英國痛風患者20年間增加了3倍，1990至1999年間美國痛風患者增加80%，加拿大30歲以上男性和50歲以上女性痛風發病率己達2%，80歲以上男性達9%。我國痛風發病率為0.3%，現有400多萬痛風患者，每年有200多萬急性發作，近100萬人痛風致殘。積極控制高尿酸血症和痛風危險因素是減少痛風發作的關鍵，也是降低心血管疾病危險的重要環節之一。目前痛風治療主要使用痛風炎症幹擾藥物和降尿酸化學藥，代表性藥物有秋水仙鹼、非甾體抗炎藥、腎上腺皮質激素、尿酸促排藥、抑制尿酸生成藥。秋水仙鹼具有緩解痛風炎症的特異性，通常是小劑量多次口服用藥，但該藥有嚴重的胃腸道反應。其它抗炎藥也都起到改善症狀的作用，但副作用都很大。丙磺舒、苯磺唑酮、痛風利仙是常用的促尿酸排洩藥物，別嘌呤醇抑制尿酸的形成，這些藥都需要服用較長時間來維持治療效果，它們的副作用發生率相同，而以別嘌呤醇最嚴重，常發生別嘌呤過敏綜合症達10%，這些患者死亡率達25%。新近開發的新型黃嘌呤氧化酶抑制劑Febuxostat作用強於別嘌呤醇，但需要常年用藥，在一項臨床試驗中，用藥4年，有三分之二的患者痛風石消失。國外已開發了重組尿酸氧化酶產品(Rasburicase)，由法國Sanofi-Synthelabo公司研製成功，歐盟及美國FDA先後於2001年和2002年批准重組尿酸氧化酶上市，在美國商品名是ElitekTM，在其他國家商品名為FasturtecTM。國外上市的重組尿酸氧化酶為凍乾粉針劑，有1.5mg/支和7.5mg/支兩個規格，用溶媒溶解後濃度1.5mg/ml。國外上市的重組尿酸氧化酶批准的臨床適應症為用於預防和治療兒童白血病、淋巴癌和惡性實體瘤治療中可能發生的腫瘤溶解症候群導致的高尿酸血症。該產品主要的副作用是發生免疫反應產生抗體和發生過敏反應，其次是半衰期短。對於痛風患者，無法長期用藥。聚乙二醇(Polyethleneglycol,PEG)是一種無毒、無免疫原性的水溶性高分子物質，可以通過共價鍵結合方式修飾蛋白質。蛋白質的聚乙二醇化修飾是克服蛋白質免疫原性的一種有效方法，聚乙二醇修飾蛋白質藥物不僅可以降低免疫原性和毒性、而且能明顯提高蛋白質藥物的穩定性，減少蛋白質分子通過腎臟的排洩，延長體內半衰期。PEG修飾後的蛋白質因體內半衰期延長，可減少用藥次數，增加治療的有效性。聚乙二醇修飾蛋白質技術已廣泛應用於生物醫藥領域，訖今PEG修飾蛋白質和其它化合物至少有四十餘種。FDA已批准的PEG化產品有聚乙二醇化腺苷脫氨酶、聚乙二醇化天冬醯胺酶、聚乙二醇化幹擾素、聚乙二醇化粒細胞集落刺激因子等。專利號為CN1264575C和CN1288243C採用第一代PEG修飾技術修飾尿酸氧化酶。由於第一代PEG是與尿酸氧化酶蛋白質分子中賴氨酸殘基中游離的氨基結合，因此所得到的修飾產物均一性差，該專利得到的修飾產物為每個蛋白分子結合多個PEG分子的混合物，難以分離純化。
發明內容為了解決上述的PEG修飾尿酸氧化酶修飾產物均一性差、難以分離純化的技術缺陷，本發明的一個目的是一種修飾產物均一性好，有利於工業化生產、且具有極低的免疫原性和全身過敏反應性，能多次重複使用聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物。本發明的另外一個目的是提供上述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物的製備方法，該方法適合工業化生產。本發明的另外一個目的是提供上述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物的醫藥製劑。本發明還有一個目的是提供上述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物在製藥中的用途。為了實現上述的第一個目的，本發明採用了以下的技術方案聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物，由聚乙二醇和尿酸氧化酶以共價鍵連接，其特徵在於所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物由尿酸氧化酶的N末端通過共價鍵連接聚乙二醇構成。作為優選，上述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物由一個聚乙二醇分子通過共價鍵連接一個尿酸氧化酶分子亞基構成。作為優選，上述的聚乙二醇是單甲氧基聚乙二醇。作為再優選，所述的單甲氧基聚乙二醇選自單甲氧基聚乙二醇琥珀酸基琥珀酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇醛中的一種或多種。作為最優選，所述的單甲氧基聚乙二醇為單甲氧基聚乙二醇醛。作為優選，上述的聚乙二醇分子量為5kDa70kDa。作為再優選，所述的聚乙二醇分子量為5kDa40kDa。作為最優選，所述的聚乙二醇分子量為20kDa40kDa。作為優選，所述的尿酸氧化酶是天然提取的或通過基因工程技術獲得的重組尿酸氧化酶。作為再優選，所述的尿酸氧化酶是從黃麴黴、球形節桿菌或假絲酵母中分離得的真菌或微生物尿酸氧化酶或序列來源於微生物的重組尿酸氧化酶及其突變體；或者，所述的尿酸氧化酶是從哺乳動物肝提取的尿酸氧化酶或序列來源於哺乳動物的重組尿酸氧化酶及其突變體；或者，所述的尿酸氧化酶是從果蠅等無脊椎動物分離到的尿酸氧化酶或序列來源於無脊椎動物的重組尿酸氧化酶及其突變體；或者，所述的尿酸氧化酶是從大豆等植物中分離到的尿酸氧化酶或序列來源於植物的重組尿酸氧化酶及其突變體。為了實現上述的第二個目的本發明釆用了以下的技術方案-上述的各技術方案中所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物的製備方法，包括以下工藝過程(1)配製修飾反應緩衝液，離子強度為10500mmol/L，pH值為47;(2)尿酸氧化酶與活化聚乙二醇在步驟(1)提供的條件反應824小時，反應溫度425。C;(3)經步驟(2)反應得到的修飾產物經陽離子交換層析，洗脫收集所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶洗脫峰，經濃縮後凝膠過濾進行分離純化，收集得到所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶。作為優選，上述的聚乙二醇與尿酸氧化酶發生共價結合反應的重量比例為0.520。作為再優選，所述的聚乙二醇與尿酸氧化酶發生共價結合反應的重量比例為210。作為優選，上述的聚乙二醇與尿酸氧化酶發生共價結合反應的緩衝液的pH值為38。作為再優選，所述的聚乙二醇與尿酸氧化酶發生共價結合反應的緩衝液的pH值為47。作為優選，上述的聚乙二醇與尿酸氧化酶發生共價結合反應的溫度為4'C37°C。作為再優選，所述的聚乙二醇與尿酸氧化酶發生共價結合反應的溫度為4。C25。C。作為優選，上述的聚乙二醇與尿酸氧化酶發生共價結合反應的時間為448小時。作為再優選，所述的聚乙二醇與尿酸氧化酶發生共價結合反應的時間為1624小時。作為優選，上述的聚乙二醇與尿酸氧化酶發生共價結合反應採用NaCNBH3作為催化劑。作為優選，上述的陽離子層析凝膠為SP-SepharoseFastFlow、CM-SepharoseFastFlow、SP-HighPerformance或Mono-S。為了實現上述的第三個目的本發明採用了以下的技術方案聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物製劑由上述各技術方案中所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物添加藥用輔料和穩定劑後製備成無菌注射液或凍乾粉針劑。為了實現上述的第四個目的本發明採用了以下的技術方案上述各技術方案中所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物用於製備治療和預防痛風、降低血尿酸水平、預防腫瘤溶解症候群或改善腎臟功能藥物中的應用。本發明採用對尿酸氧化酶的N末端選擇性高的修飾方法，即聚乙二醇活性酯和尿酸氧化酶的N末端通過共價鍵方式連接，使產物的均一性得到大大提高，容易純化，純化產物的活性能夠較好地保留。聚乙二醇化尿酸氧化酶具有極低的全身性過敏反應，在臨床中能多次重複用藥。圖1為不同分子量PEG修飾尿酸氧化酶產物的SDS-PAGE電泳分析，其中，1、2、3、4泳道PEG分子量40kDa，5、6、7、8泳道PEG分子量20kDa。圖2為不同溫度PEG修飾尿酸氧化酶產物的SDS-PAGE電泳分析結果，其中，泳道A修飾反應溫度4°C，泳道B為15°C，泳道C為25°C，泳道D為37°C。圖3為用藥後大鼠血尿酸水平變化的曲線圖。圖4為抗體對藥效影響的柱型圖。具體實施例方式實施例l聚乙二醇與尿酸氧化酶的修飾反應本發明中所述的尿酸氧化酶是從採用基因工程技術獲得的重組黃麴黴尿酸氧化酶，純度大於95%，且保持有較高的酶活性。將尿酸氧化酶(UOX)溶於pH6.0、lOOmM的磷酸鹽緩衝液中，按UOX:mPEG活性酯=1:5(w/w)的比例加入溶解後，加入NaCNBH3使其終濃度為10mM，室溫反應24小時。實施例2聚乙二醇化尿酸氧化酶藥物的分離純化將聚乙二醇與尿酸氧化酶的修飾反應得到的產物在AKTA-Primer蛋白質層析系統(AmershamPharmacia公司產品)上進行製備型陽離子交換層析。陽離子層析凝膠為SP-SepharoseFastFlow,柱床體積50ml。層析柱用20mMPB，pH8.0的緩衝液平衡至少5個柱床體積使流出液pH與緩衝液pH值相同，平衡後將pH調至8.0的修飾產物以較低的流速(1020ml/min)上樣。上樣結束後繼續用平衡緩衝液平衡至紫外吸收回到基線，再用00.5M的NaCl梯度洗脫，當NaCL濃度為0.20.3mol/L時出現的蛋白峰主要是一個聚乙二醇分子連接一個UOX分子的聚乙二醇化尿酸氧化酶，收集該洗脫峰，經過超濾(IOKD的MILLPORE膜塊)濃縮處理後經S-200凝膠過濾柱分離純化，柱床體積200ml，平衡緩衝液20mMPB，pH8.0，流速5ml/min，上樣後洗脫體積為100~150ml的第二個峰為目標蛋白峰，所得到的聚乙二醇化尿酸氧化酶藥物，經SDS-PAGE分析純度大於95%。實施例3聚乙二醇與尿酸氧化酶不同比例修飾反應將尿酸氧化酶溶於pH6.0、lOOmM的磷酸鹽緩衝液中，按UOX與mPEG活性酯的比例分別為l:4(W/W)、1:5、1:6.5、1:8的比例加入溶解後，加入NaCNBH3使其終濃度為lOmM，室溫反應1624小時，SDS-PAGE分析修飾產物的比例及酶比活性，結果見下表(未修飾的尿酸氧化酶酶比活性為17.6EAU/mg)。編號tableseeoriginaldocumentpage12實施例4不同分子量聚乙二醇修飾尿酸氧化酶將尿酸氧化酶溶於pH6.0、100mM的磷酸鹽緩衝液中，分別用分子量為20kDa和40kDa的活化PEG進行修飾，按UOX:mPEG活性酯=1:5(w/w)的比例加入溶解後，加入NaCNBH3使其終濃度為10mM,室溫反應16小時，SDS-PAGE分析修飾反應的產物，結果見圖l。實施例5不同溫度聚乙二醇修飾尿酸氧化酶將尿酸氧化酶溶於pH6.0、lOOmM的磷酸鹽緩衝液中，按UOX:mPEG活性酯=1:5(w/w)的比例加入溶解後，加入NaCNBH3使其終濃度為10mM，分別在4'C、15°C、25°C、37'C反應16小時，SDS-PAGE分析修飾反應的產物，結果見圖2。經掃描，不同溫度修飾產物的比例分別39.5°/。、62.3%、64.6%、49.3%。實施例6聚乙二醇化尿酸氧化酶藥物的體內藥效試驗大鼠按體重隨機分為4組，每組5隻，分別為空白對照組、模型組、尿酸氧化酶組和PEG尿酸氧化酶組。其中模型組和給藥組每天一次，連續灌胃給予造模劑(黃嘌呤和乙胺丁醇或腺嘌呤)進行造模。造模後用藥，用藥劑量為1.25mg/kg，尾靜脈注射給藥。每天取血測定血尿酸水平，結果見圖3。尿酸氧化酶藥效維持時間小於24小時，而PEG尿酸氧化酶一次給藥後藥效作用可維持144小時。實施例7聚乙二醇化尿酸氧化酶藥物的免疫原性試驗大鼠給予PEG尿酸氧化酶一個月，劑量1.25mg/kg。取血清後經ELISA試驗檢測到抗體。分別給予模型動物PEG尿酸氧化酶及PEG尿酸氧化酶和抗體，劑量為0.4mg/kg。給藥後取血清分析血尿酸水平，結果見圖4，PEG尿酸氧化酶給藥引起的抗體沒有影響其藥效的發揮，可使動物血尿酸水平明顯降低。權利要求1.聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物，由聚乙二醇和尿酸氧化酶以共價鍵連接，其特徵在於所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物由尿酸氧化酶的N末端通過共價鍵連接聚乙二醇構成。2.根據權利要求1所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物，其特徵在於所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物由一個聚乙二醇分子通過共價鍵連接一個尿酸氧化酶分子亞基構成。3.根據權利要求1或2所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物，其特徵在於所述的聚乙二醇是單甲氧基聚乙二醇。4.根據權利要求3所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物，其特徵在於單甲氧基聚乙二醇選自單甲氧基聚乙二醇琥珀酸基琥珀酸酯、單甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯、單甲氧基聚乙二醇醛中的一種或多種。5.根據權利要求4所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物，其特徵在於單甲氧基聚乙二醇為單甲氧基聚乙二醇醛。6.根據權利要求1或2所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物，其特徵在於所述的聚乙二醇分子量為5kDa70kDa。7.根據權利要求1或2所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物，其特徵在於所述的尿酸氧化酶是天然提取的或通過基因工程技術獲得的重組尿酸氧化酶。8.根據權利要求7所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物，其特徵在於尿酸氧化酶是從黃麴黴、球形節桿菌或假絲酵母中分離得的真菌或微生物尿酸氧化酶或序列來源於微生物的重組尿酸氧化酶及其突變體；或者，尿酸氧化酶是從哺乳動物肝提取的尿酸氧化酶或序列來源於哺乳動物的重組尿酸氧化酶及其突變體；或者，尿酸氧化酶是從果蠅等無脊椎動物分離到的尿酸氧化酶或序列來源於無脊椎動物的重組尿酸氧化酶及其突變體；或者，尿酸氧化酶是從大豆等植物中分離到的尿酸氧化酶或序列來源於植物的重組尿酸氧化酶及其突變體。9.根據權利要求1或2所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物的製備方法，其特徵在於包括以下工藝過程(1)配製修飾反應緩衝液，離子強度為10500mmol/L，pH值為47;(2)尿酸氧化酶與活化聚乙二醇在步驟(1)提供的條件反應824小時，反應溫度425°C;(3)經步驟(2)反應得到的修飾產物經陽離子離子交換層析，洗脫收集所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶洗脫峰，經濃縮後凝膠過濾進行分離純化，收集得到所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶。10.根據權利要求9所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物的製備方法，其特徵在於聚乙二醇與尿酸氧化酶發生共價結合反應的重量比例為0.520。11.根據權利要求9所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物的製備方法，其特徵在於聚乙二醇與尿酸氧化酶發生共價結合反應的緩衝液的pH值為38。12.根據權利要求9所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物的製備方法，其特徵在於聚乙二醇與尿酸氧化酶發生共價結合反應的溫度為4°C37°C。13.根據權利要求9所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物的製備方法，其特徵在於聚乙二醇與尿酸氧化酶發生共價結合反應的時間為448小時。14.根據權利要求9所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物的製備方法，其特徵在於聚乙二醇與尿酸氧化酶發生共價結合反應採用NaCNBHs作為催化劑。15.根據權利要求9所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物的製備方法，其特徵在於陽離子層析凝膠為SP-SepharoseFastFlow、CM-SepharoseFastFlow、SP-HighPerformance或Mono-S。16.根據權利要求1或2所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物製劑，其特徵在於:所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物添加藥用輔料和穩定劑後製備成無菌注射液或凍乾粉針劑。17.根據權利要求1或2所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物用於製備治療和預防痛風、降低血尿酸水平、預防腫瘤溶解症候群或改善腎臟功能藥物中的應用。全文摘要本發明涉及聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物及其製備方法和其製劑及應用，尤其涉及一種具有極低免疫原性和過敏性、能夠多次重複用藥，具有長效作用的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物及其製備方法和其製劑及應用。本發明採用對尿酸氧化酶的N末端選擇性高的修飾方法，即聚乙二醇活性酯和尿酸氧化酶的N末端通過共價鍵方式連接，使產物的均一性得到大大提高，容易純化，純化產物的活性能夠較好地保留，而且能顯著性地降低尿酸氧化酶原型蛋白的免疫原性，防止用藥過程中發生全身性過敏反應，並且能夠多次重複用藥，具有治療與預防痛風、降低血尿酸水平、預防腫瘤溶解症候群和改善腎臟功能等功效。文檔編號A61P19/06GK101302501SQ20071006850公開日2008年11月12日申請日期2007年5月10日優先權日2007年5月10日發明者劉全海,劉國安,劉珉宇,吳學軍,來慶勤,忠楊申請人:劉國安;楊忠