一種豬鏈球菌2型表面蛋白、其製備方法及用途的製作方法

2023-09-10 22:42:30

專利名稱：一種豬鏈球菌2型表面蛋白、其製備方法及用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種細菌表面蛋白，具體地說涉及一種豬鏈球菌2型的表面 蛋白，還涉及該蛋白質的製備方法以及用途。
背景技術：
豬鏈球菌(5^e; tococcw^^)，屬於蘭氏分類法的R群，有35個血清型， 以豬鏈球菌2型流行最廣，致病性最強。自丹麥在1968年最早報導人感染豬鏈 球菌病後，20世紀70年代以來，歐美部分國家和香港地區均報導過豬鏈球菌 病例，主要以腦膜炎為主，中毒性休克症候群(TSS)少見，未見暴發流行。 我國於1998年和2005年兩次在江蘇和四〗11暴發人感染豬鏈球菌2型疫情，不同 於國外人感染病例以腦膜炎為主的特點，臨床表現為休克型和腦膜炎型。多 數病例死於中毒性休克症候群(TSS)，病理改變主要表現為全身多器官受損, 敗血症伴瀰漫性血管內凝血(DIC)。人豬鏈球菌病已成為嚴重威脅我國人民 健康的一種新的人畜共患病，如何有效地預防和控制豬鏈球菌感染己成為科 學家們面臨的重要研究難題。
由於對毒力因子和保護性抗原了解甚少，同一血清型的菌株在不同的地 區毒力也不盡相同，高致病性豬鏈球菌感染缺乏有效的診斷耙標對該類病 原的分離鑑定主要依靠傳統的分離培養和生化鑑定，然後用豬鏈球菌高免血 清進行凝集試驗分型。但家畜廣泛攜帶鏈球菌，許多菌株毒力低，因此僅僅 靠生化反應檢測豬鏈球菌是遠遠不夠的，必須建立針對特異毒力因子的檢測手段，以區分弱毒株和強毒株。以上情況都阻礙了有效的豬鏈球菌病疫苗的 研製及對感染的及時診斷與控制。
縱觀國外豬鏈球菌病疫苗的研製情況，主要經歷了全菌免疫和抗原蛋白
免疫兩個階段。上世紀90年代，有研究者以福馬林滅活的豬鏈球菌進行靜 脈注射能刺激被免疫豬產生調理化的抗體[HoltME， EnrightMR， Alexander TJ. (1990) Immunisation of pigs with killed cultures of S^ptococciw柳\ type 2. ^L^m48:23-7]。也有研究者通過篩選無毒力的豬鏈球菌突變體，如溫度 敏感性突變體、鏈黴素依賴性突變體等來獲得具有保護性的全菌疫苗[Kebede M, Chengappa MM, Stuart JG ( 1990 ) Isolation and characterization of temperature-sensitive mutants of 5Vrepfococci^ ■sm/s: efficacy trial of the mutant vaccine in mice. Pfef M,cra6w/. 22:249-57. Foster N， Staats JJ， Chengappa MM.
(1994 ) Isolation, characterization and protection studies in mice of a streptomycin-dependent mutant of /S^e/^ococcws sm/s type 1/2. 及as Com附ww. 18:155-63.]，但是滅活的全菌免疫常會引起免疫症候群等副作用。後續有研究 者利用豬鏈球菌相關毒力因子溶菌酶釋放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)結 合油包水型乳劑(WO)和氫氧化鋁佐劑(AH)作為疫苗，對其保護性和毒副作用 作了評價，發現用MRP+EF/WO免疫的豬與用全菌/WO免疫的豬具有同等有 効
臨床表徵[WisselinkHJ， VechtU， Stockhofe-Zurwieden N， Smith HE. (2001) Protection of pigs against challenge with virulent浙eptococcws sw/s serotype 2 strains by a muramidase-released protein and extracellular factor vaccine. Vet Rec. 148:473-7.]。也有人用純化的溶血素(SLY)作為疫苗免疫小鼠，發現能對小 鼠產生完全保護作用，免受毒力株的傷害[Jacobs AA， Loeffen PL， van den Berg
效的抗-MRP和抗-EF滴度，而且在免疫後的存活豬中，沒有觀察到明顯的AJ， Storm PK. (1994) Identification, purification, and characterization of a thiol-activated hemolysin (suilysin) of 浙e/ tococcw stw's. Infect Immun.
62:1742-8.]。但豬鏈球菌的毒力因子較常時間以來就呈現出時空上的相對多樣 性，雖然MRP、 EF與毒力高度相關，但與歐洲致病株不同的是多數加拿大 致病株不表達MRP和EF，且MRP和EF的2-型豬鏈球菌缺失突變體與野生 型一樣同樣具備毒力[Gottshalk M, Lebrun A， Wisselink HJ， Dubreuil JD, Smith HE, Vecht U. (1998) Production of virulence-related proteins by Canadian strains
capsular type 2. Can J Vet Res 62:75-79.]。我國流行株和非 流行株都表達MRP，且動物實驗顯示流行株培養分泌的上清並不引起病變， 單靠現了解的MRP、 EF、 SLY等毒力因子不足以解釋我國2-型豬鏈球菌的致 病機理，使用MRP作為人免疫疫苗產生抗體中和MRP可能難以達到理想的 效果。而在國內，豬鏈球菌疫苗的研製還處於起步狀態，即滅活的全菌疫苗[王 卓，舒秀偉，王文成.豬鏈球菌病二價滅活疫苗候選株培養條件的優化及其安 全性試驗.(2004)中國藥獸雜誌.38: 34-36.]。因此有必要根據我國實際情況， 研製適合我國的2-型豬鏈球菌的新型疫苗，發掘新的具有免疫原性的毒力因 子是尋找新型疫苗的重要途徑。
一般來說，表面暴露蛋白和細胞壁附著蛋白常被作為疫苗的候選靶標和 血清學診斷試劑。近10年來，也有研究者試圖尋找有免疫原性的豬鏈球菌表 面細胞壁蛋白作為疫苗的候選分子，1996年Haataja S等分離並鑑定出一種半 乳糖抑制型黏附素，在23種血清型的豬鏈球菌中，用免疫印跡的方法均能檢 測到這種黏附素的存在，發現具有很強的免疫原性和調理功能，適合作為疫 苗候選分子[HaatajaS， TikkanenK， HytonenJ， Finne J.( 1996)The Gal alpha 1-4Gal-bindingadhesinof 浙e/ tococcMssw&，a gram-positivemeningitis-associated bacterium. Adv Exp Med Biol. 408:25-34.] 。 2005年 Okwumabua O等人通過對2-型豬鏈球菌的全基因組進行篩選，發現一種分子 量為38kDa蛋白，具有很好的免疫原性和保護性,認為這種蛋白是較好的疫苗 候選分子並且適合用作診斷試劑的開發，這種蛋白的生物學功能以及與致病 機理的關係正在進一步研究中[OkwumabuaO， Chinnapapakkagari S, (2005) Identification of the gene encoding a 38-kilodalton immunogenic and protective antigen of 5yre/ tococcws Clin Diagn Lab Immunol. 12:484-90]。

發明內容
為了尋找具有免疫原性的毒力因子，研發豬鏈球菌新型疫苗，本發明提 供了一種豬鏈球菌2型新型表面蛋白，還公開了該表面蛋白的製備方法及其 用途。本發明所公開的豬鏈球菌2型表面蛋白具有序列表中序列1所示的氨 基酸序列，編碼該表面蛋白的基因具有序列表中序列2所示的核苷酸序列， 編碼該蛋白的基因在豬鏈球菌2型菌株中廣泛存在。該蛋白命名為 SSU98—1675， genebank編號為gi|146321522。
本發明還公開了表達上述豬鏈球菌2型表面細胞壁蛋白的重組表達質 粒，其含有序列表中序列2的核苷酸序列。上述表達質粒可以為大腸桿菌表 達質粒，具體質粒可以是pET32a等。
本發明還公開了含有上述表達豬鏈球菌2型表面細胞壁蛋白的重組表達 質粒的菌株，該菌株為大腸桿菌，可以為BL21菌株。
本發明還公開了上述表面蛋白的製備方法，該方法包括如下步驟
首先克隆該表面蛋白基因可通過PCR方法進行，首先設計合成引物， 在引物兩端可添加酶切位點和保護性鹼基，然後按照PCR方法，用豬鏈球菌製備的模板，在一定條件下進行擴增，將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，並 回收產物並進行酶切，確定表面蛋白基因。然後是表達該表面蛋白基因的重 組質粒製備將製備的表面蛋白基因與大腸桿菌表達載體相連接，表達載體 可以為原核表達載體，可採用商業的原核表達載體，如大腸桿菌表達載體 pET32a，製備表達載體，並轉化大腸桿菌，製備重組菌，利用菌落PCR和限 制性內切酶進行重組菌的篩選和鑑定；對重組菌進行IPTG誘導表達；超聲 波破碎重組菌，收集上清，以GE鎳親和層析柱進行純化。
本發明還公開了上述表面蛋白的用途。本發明的表面蛋白是通過免疫蛋 白質組鑑定的2型豬鏈球菌新的免疫原性抗原分子，目前根據豬鏈球菌基因 組注釋的結果，僅有該基因開放閱讀框架的預測，尚未有該蛋白在豬鏈球菌 中表達的報導，也未有該基因功能的線索。
本發明通過實驗證明，該蛋白可用作診斷靶標，在豬鏈球菌感染的動物 和人血清中針對該蛋白的抗體明顯上升，因而可用於開發豬鏈球菌感染的診 斷試劑。本發明還公開了表面蛋白在製備豬鏈球菌2型疫苗中的應用。通過 該蛋白製備的免疫血清調理的全血殺傷實驗發現該蛋白具有一定的保護性， 是新的高效保護性抗原，可用於製備疫苗，作為重點疫苗候選和診斷分子。
本發明首次將該表面蛋白鑑定為豬鏈球菌2型新的免疫原性抗原分子， 並通過基因工程方法製備了該表面蛋白並製備了相應抗體。並公開了該表面 蛋白可以用於製備豬鏈球菌的診斷試劑和疫苗，在有效預防和控制豬鏈球菌 感染方面具有良好的應用價值和廣闊的巿場前景。


圖1為豬鏈球菌2型表面蛋白SSU98—1675的純化蛋白電泳圖，其中3為低分子量蛋白標準，從上至下依次為97.4 kDa， 66.2 kDa,43.0 kDa， 31.0kDa， 20.0kDa; 1為上樣前蛋白誘導物原液，2為上樣後蛋白誘導物穿透液，4-5為 50mmol/L濃度咪唑的洗脫液(不含目的蛋白)，6-8為150mmol/L濃度咪唑 的洗脫液(含目的蛋白)。
圖2針對SSU98一1675特異抗體的比較。病人和健康人的抗體水平比較 (A)，豬感染前後的抗體水平比較(B) 。ELISA實驗用於評價針對SSU98一1675 特異的抗體反應，硫氧還蛋白(Trx)用作陰性對照。.
具體實施例方式
實施例一 豬鏈球菌2型表面蛋白SSU98一1675的表達純化及抗體製備 1.材料和方法 1.1菌株和質粒
豬鏈球菌2型98HAH12株[Chen C， Tang J， Dong W， Wang C， Feng Y， et al (2007) A Glimpse of Streptococcal Toxic Shock Syndrome from Comparative Genomics of S.suis 2 Chinese Isolates, PLoS ONE 2(3): e315];大腸桿菌DH5a， BL21，均為國際標準株；表達載體pET32a(+)為Novagen公司產品。 1.2酶和試劑
EcoRI和XhoI等限制性內切酶以及Taq酶、dNTPs 、 DL15000^^St示準等 PCR所用試劑均為寶生物工程(大連)有限公司產品；DNA回收試劑盒為天 為公司產品；鎳親和層析柱為GE公司產品；質粒提取盒為V-gene公司產品； 弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑為Sigma公司產品；Amp為中諾藥業產品。 1.3 PCR引物設計及SSU98—1675核酸序列，蛋白序列根據所要擴增的片段，設計一對引物，引物兩端分別添加EcoRI和XhoI 酶切位點和保護性鹼基，引物P1和P2可擴增豬鏈球菌2型SSU98—1675基因 開放閱讀框(ORF)全長片斷。引物序列分別為
上遊引物P1: 5 '-gcggatccaatagcaagattttttcgttgag-3，見序列表中序列3;
下遊引物P2: 5 、gcctcgagctcactttctgttatctttttc-3，見序列表中序列4。
核酸序列>SSU98J675見序列表中序列2，胺基酸序列〉SSU98—1675 見序列表中序列l。
1.4 PCR擴增
按下列順序和條件依次加入各反應物並進行PCR擴增。豬鏈球菌2型模 板DNA2pL， 10Xbuffer5uL， 2,5 mmol/L dNTPs 3 P L，弓l物Pl禾口P2(5u mol/L)各luL，ddH20 37uL，LA-7^酶(5U/uL)luL 。擴增的條件為:94 。C7min; 94。Clmin， 55。Clmin， 72。C2min， 30個循環;72 。C7min。
1.5 PCR產物的回收和酶切
PCR產物在1°/。瓊脂糖凝膠電泳，後以DNA回收試劑盒回收目的片段， 並以BamHI和XhoI 37t酶切3h。 1.6重組質粒的構建和鑑定
在含有100ug/mLAmp的LB肉湯中接種攜帶pET32a空質粒的DH5 a 大腸桿菌單菌落，37'C搖振培養12 16h後，P/。轉接入100ug/mLAmp的 新鮮LB肉湯37"C搖振培養6h，以質粒抽提試劑盒抽提質粒。BamHI和XhoI 雙酶切後，以DNA回收試劑盒回收酶切產物。將PCR雙酶切回收產物與空質 粒雙酶切回收產物進行連接，並轉化感受態的DH5a宿主菌。感受態細菌的 製備、轉化均按常規方法進行，利用菌落PCR和限制性內切酶酶切進行重組 菌的篩選和鑑定。1.7重組質粒的測序和序列分析
重組質粒的序列測定採用Sanger雙脫氧末端終止法，由北京三博遠志生 物技術有限公司完成，以驗證其閱讀框架，並以BLAST軟體進行同源性分析。 1.8重組質粒在大腸桿菌中的表達和純化
將重組質粒按常規方法轉化感受態的大腸桿菌BL21，利用Amp抗性篩 選重組菌，挑單菌落接種LB肉湯中(含100ug/mLAmp)， 3(TC劇烈搖振培養 2 4h，當菌液濃度OD6oo達0.5 0.6時，加IPTG至終濃度lmmol/L， 30'C繼 續劇烈搖振培養2 4h。 6000r/min離心10min ，沉澱以蒸餾水重懸，加等體 積的2X電泳上樣緩衝液煮沸10min， SDS-PAGE檢測。含空pET32a(+)的大腸 桿菌BL21亦同樣經IPTG誘導處理後，SDS-PAGE檢測表達情況。以超聲波破 碎誘導的重組菌，收集上清，以GE鎳親和層析柱進行親和層析，具體步驟按 使用說明書進行。 1.9重組蛋白動物免疫試驗
將收集的蛋白以PH7.2 10mmol/L的PBS稀釋至0.1mg/ml，加入等量的弗氏 完全佐劑，皮下免疫Wistar大鼠(購自軍事醫學科學院試驗動物中心)，0.5m1/ 只；以後3 — 5周，分別以0.2， 0.4， 0.8， 1.6mg/ml加弗氏不完全佐劑加強免疫， 第7周斷尾取血ELISA法測抗體效價。同時設立全菌免疫對照組和空白對照組 (pET32a空質粒轉化BL21，誘導表達Trx蛋白，以此蛋白免疫大鼠為空白對 照)。以硫酸銨沉澱法製備抗血清。 2.結果 2.1 PCR結果
PCR產物經電泳後，出現一條約2178bp的條帶，大小與預期一致。 2.2重組質粒的鑑定SSU98—1675基因片段經回收，以BamHI和Xho I酶切位點定向克隆至 pET-32a中，獲得重組質粒，命名為SSU98一1675-pET-32a。重組質粒轉化感受 態的DH5a宿主菌，經Amp抗性篩選得到重組菌。提取重組質粒，經EcoR I和XhoI雙酶切，可切出約2178bp左右的片斷，說明SSU98—1675片段己成
功克隆。
2.3重組質粒的表達
重組BL21轉化菌經IPTG誘導後，菌體SDS-PAGE顯示有一條97kD的 蛋白帶，而含誘導前的菌在該處無特異條帶。經鎳柱純化獲得純化的 SSU98J675蛋白。見圖l。 2.4測序結果和序列分析
克隆的序列長度經測序為2178bp，如序列表中序列2所示，翻譯後為725 個胺基酸殘基，見序列表中序列l。
實施例二豬鏈球菌2型表面蛋白SSU98一1675的免疫原性 及抗體介導的調理吞噬試驗 1.材料方法材料同實施例一。
1.1重組豬鏈球菌2型表面蛋白SSU98J675和多抗的製備見實施例一。 1.2 SSU98一1675抗體介導的調理吞噬
血平板刮取豬鏈球菌2型單菌落，接入THB培養基，37°C， C02孵箱培養 8h後轉接新鮮THB培養基培養8h至對數生長期。取lml菌液(約l X 108CFU/ml) 13，000rpm， lmin集菌，PBS洗菌並重懸，調整至l6CFU/ml，塗血平板，記 為初始菌量。取50[xl (&106CFU/ml)菌液加入10(Hil抗體，37。Cl5min後冰上 15min;加入350jxl健康人全血37。C ， 3h;加入55pl 1 % saponin,冰上20min;反覆吹打後稀釋塗血平板，16h後血平板記數單克隆。 1.3感染豬與人中SSU98一1675蛋白特異抗體測定
採用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定病人和感染動物中針對該蛋白的 特異抗體，採用健康人的血清和感染前的動物血清作為對照。採用5pg/ml的 重組蛋白包被酶聯板，包被緩衝液為0.05 M NaHC03 (PH 9.6) , 4°C包被過 夜，然後採用3% BSA 37 。C封閉3 h。病人和健康人血清樣品1:500稀釋， 感染前後豬血清均1:200稀釋，反應信號通過辣根過氧化物酶(HRP)標記 的二抗進行檢測。 2.結果
2.1重組蛋白抗體介導的調理吞噬作用
經GE鎳親和層析柱層析獲得純化的重組蛋白SSU98—1675,分別加弗氏完 全和不完全佐劑免疫後，製備抗血清，進行間接殺菌試驗。殺菌率計算
(CFUrTrx—CFUr98—1675) /CFUrTrx。 Trx為從含pET32a (+)空載體的大腸杆 菌BL21鎳柱純化的硫氧還蛋白。
抗體介導的調理吞噬試驗分別用SSU98一1675重組蛋白；MRP重組蛋白 免疫大鼠後的大鼠血清調理健康人血，進行人全血對豬鏈球菌2型活菌的殺傷 試驗。SSU98J675重組蛋白的抗血清調理人全血對豬鏈球菌2型的殺傷率為 50%左右，但略低於MRP蛋白的抗血清，MRP蛋白的抗血清調理人全血對豬 鏈球菌2型的殺傷率為90%。
2.2感染的人和豬血清中SSU98J675特異抗體檢測
本發明檢測了 6名豬鏈球菌2型感染的病人和5名健康人血清中 SSU98—1675特異抗體的存在狀況，結果發現與健康人相比，病人SSU98—1675 特異抗體水平明顯升高，見圖.2A。我們檢測了豬鏈球菌2型感染豬前後血清中SSU98一1675特異抗體的存在狀況，結果發現與感染前相比，感染後血清 中SSU98_1675特異抗體水平顯著升高，見圖2B。上述實驗結果表明 SSU98—1675可作為診斷耙標用於豬鏈球菌2型感染的血清學診斷。




<210〉 <211〉 <212〉
豬鏈2型表面蛋白1675.SEQ 序歹U 表
中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所 一種豬鏈球菌2型表面蛋白、其製備方法及用途
4
Patentln version 3. 2 1
725 PRT
1
Met Asn Ser Lys lie Phe Ser Leu Arg Lys Ser Lys Met Gly Leu Val 15 10 15
Ser Val Ala lie Ala Phe Leu Trp lie Gly Thr Gly Met Asn Met Glu 20 25 30
Thr Ala Met Ala Glu Glu Thr Asp Ala Thr Ala Uu Glu Thr Gin Leu 35 40 45
Glu Ser Thr Glu Ser Ser Leu Thr Asn Thr Val Ser Glu Asn Ala Glu 50 55 60
Ala Glu Glu Val Ala Asp Glu Val Pro Ser Glu Glu Lys Lys Ser Glu 65 70 75 80
Glu Met Glu Asp Met Glu Glu Glu Leu Ser Phe lie Glu Asn His Leu 85 90 95
Glu Val Ala Pro lie Gin Ala Gly Asp Gin Thr lie Ser Gly Asn Thr 100 105 110
Thr Pro Gly Gly Tyr Val Ala lie Thr lie Asp Gly Glu Ala lie Thr 115 120 125
Ser lie Glu Asn lie Leu Glu Ala Asp Asp Lys Gly Asp Phe Ser Tyr 130 135 140
Arg Leu Ser Pro Leu Ala His Ser Gin Thr Val Glu lie Ser Ala 145 150 155 160
Leu Pro Lys Gin Phe Trp Thr Leu Glu Ala Asp Ser Glu Glu Arg Lys 165 170 175
Val Val Val Arg Thr Asn Arg His Pro Glu Ala Tyr Glu lie Pro Ala 180 185 190
Lys Arg Leu Glu Lys Thr Ser Asn Gly Met His Gin Val Phe lie Glu豬鏈2型表面蛋白1675.SEQ
195
200 205
Pro Val Phe Glu His Thr Ser Lys Val lie Gly His Thr Ser Val Lys
210
215 220
Gly Ser Val Tyr Leu Ser lie Asn Gly Ser Phe Val Ser Asp Lys Thr
225 230
235 240
Leu lie Asp Pro Lys Asp Gly Arg Phe Glu Val Thr Phe Ser Glu Ser
245
250 255
Leu Ala Gly Ser Lys Phe Lys Ala Asp Asp Arg Leu Val Leu Ser Phe
260
265 270
Val Ser Glu Asp Gly Gin Pro Val lie Thr Asn Thr lie Val Lys Pro
275
280 285
Leu Val Lys Glu Lys Val Ser Ser Gin Met Thr Val Lys Pro Leu Ser
290
295 300
Ser Ala Thr Ser Val Leu Glu Gly Thr Thr Phe Pro Leu Gly Arg Val
305 310
315 320
His Leu Tyr Asn Ala Asp Thr Ser Glu Phe lie Met Glu Ala lie Ala
325
330 335
Asp Glu Thr Gly His Tyr Lys lie Ala Leu Pro Ala Leu Gin Ser Glu
340
345 350
Asp Lys Tyr Tyr Arg Leu Thr His Asn Gin Gin Glu Asp Leu Val Ser
355
360 365
Val His Leu Asp Thr Val Asp Gly Ser Ser lie Leu Leu Asp Lys Ser
370
375 380
Val Met Ala Ser Leu Ala Thr Tyr Leu Gin Asp Ala Asp Met Asp Glu 385 390 395 400
Ala Thr Asp Glu Asp Pro lie lie Val Pro Lys Leu His Asn Lys Lys 405 410 415
Asp Tyr lie Val Gly Arg Thr lie His Leu Asn Ala Tyr Val Arg Met 420 425 430
Val Ser Ser lie Lys Gly Lys Gin Tyr Pro Pro Val Gin Val Asp Glu 435 440 445
Leu Gly Phe Phe Gly Phe Gin lie Gin Asp Leu Gin Uu Pro Phe Glu
450
455 460
Lys Gly Glu Arg lie Arg Phe Glu lie lie Asp Pro Val Thr Asn Asn465
470
豬鏈2型表面蛋白1675.SEQ 475 480
lie lie Ala Ser Lys Glu Glu Val Val Gly Gin Tyr Leu Glu Asp Glu
485
490 495
Asp Val Met Asp Leu Pro Phe Gin Val Glu Lys Val Thr Thr Asp His 500 505 510
Gly Tyr lie Ser Gly Lys Thr Ala Pro Asp Val Met lie Glu Leu Val 515 520 525
Ser Thr Gin Asn Gly Glu Glu lie lie Gly Lys Thr Ser Thr Asp Ser 530 535 540
Thr Gly Arg Phe Glu Phe Asp Leu Gly Ser Arg Val Leu Lys Asn Gly 545 550 555 560
Glu Thr Leu Ser Phe Arg Ala Phe Asp Lys Glu Gly Glu Gin Val Ala
565
570 575
Trp Glu Val Val Thr Val Gin Lys Gly Asn Gly His Arg lie Asn Lys 580 585 590
Pro Asp Lys I>ys Asp Glu Lys Glu Glu Gin Pro Ser Lys Glu lie Thr 595 600 605
Lys Asn lie Glu Gin Ser Asn Thr Leu Glu Gin Thr Thr Leu Pro Pro 610 615 620
Val Arg Gin Thr Leu Thr Asp Lys Lys Val Glu Gin Asn Ala Glu Pro
625
630
635 640
Ser Lys Glu Glu Thr Val Ser lie Phe Asp Asp Ser Lys Lys Asp Met
645
650 655
Pro Thr Lys Gin Glu Lys Met Ala Arg Thr Val Arg Asp Lys Gly Thr 660 665 670
Lys Gly Asn Val Ser Val His Asp Ser Gly Glu Asn Thr Gin Val Gin 675 680 685
Ser Leu Pro Lys Thr Gly Glu Lys Thr Ser Leu Val Ala Asn lie Met 690 695 700
Leu Ser lie lie Leu Phe Leu Phe Ala Leu Phe lie Gly Lys Lys Lys 705 710 715 720
lie Thr Glu Ser Glu 725
<210〉 2豬鏈2型表面蛋白1675.SEQ
2178 腿 <213〉
2
atg犯tagcaagattttttcagta卿tgggtttagtttcggtggcaatt60
gcttttctatggattggtacagggatgaatatggaaaccgcaatggctgagg柳ctgeic120
gctacagctcttgaaactcaattagaaagcacggaatcatcgcttaccaatacagtttcg180
gaaaatgctg卿ctgaggaagtggctgatgaggtaccgagtgaagaaaaaaeL3tcgg犯240
g卿tggaggagaactttcatttattgaaaaccatctagaggttgctccg300
attcaagctggagatcaaaccatctcagggaataccactcctggtggatatgtagcgatt360
acgatagatgggg卿c犯ttacttctatttg3t犯ggga420
gatttttcttatcggttgagtaaaccacttgctcacagccaaactgtggaaattagtgct■
ttgccgaaacagttttggactctagaggcagattctgaagagcgtaaggtagtagtgagg540
actaatcgacatccagaggcttatgaaattcc8gcaa犯agattagaaaaaacatctaat600
gg犯tgcatcaagtgttcatcgaaccagtttttgaacatacgagcaaagttattggtcat660
acctctgtcaaaggttcagtctatctatcaataaatggtagttttgtctctgataagaca720
ctaattgatcctaaagatggacggtttgaggttactttttccgagagtttagcaggttca780
cagatgatagattggttttgtcttttgtatc卿agatggtcagccggtg840
attactaatactattgtaaaaccattggtaa犯gaaaaagtatcttcacaaatgacagta900
aaacctttatcaagtgcgacttcagttttggaaggaactacatttcctttaggtcgtgtg960
catctatacaatgctgatacttcagagtttatcatggaagctattgctgatgagacaggt1020
cactataagattgctttgcctgccctacaatccgaggataagtactacagattgactcac1080
aatcaacaagaggacttggtatctgtccatcttgatacagttgatggttcaagtatatta1140
ttggataaatctgttatggcatctttagcaacttatttacaagatgcagatatggatgaa1200
gcgac卿tgaagatcctatcattgtacctaaactgcatattatattgtc1260
ggtcgaacgatacatcttaatgcctacgttcgcatggtttcgtcaatcaaaggaaaacag1320
tatcctccagttcaagtggacgaattaggattttttggtttccaaattcaag3tttac肪1380
ttgccttttgaaaaaggtgagagaattcgctttggiaatcattgacccggttacaaataat1440
atcatcgctagt卿ga卿agttgtagggcaatatttgg幼gatgaagacgtgatggat1500
ttaccatttcagtcactacagatcatggttacatcagtggcaaaacagct1560
ccagatgtaatga/ttgaactagtatcaactcagaatggcgaggagateiEittggtaaaact1620
tcaactgattcaacaggtcgattcgaatttgatttgggtagtcgtgttttaaaaaatgga1680
gaaaccttatcgtttagagcgtttgataaag卿gtg肌caggtagcttgggaagtcgta1740
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gagcaacctagc幼agaaatt ac c aaaaatatcgaacaatc aaac ac ac ttgageaaact1860
actttgccacctgtacgccaaacgctgacttagagcaaaatgeagageca1920豬鏈2型表面蛋白1675.SEQ
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〈210〉 3 <211〉 31 <212〉 腿 〈213〉
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〈210〉 4 〈211〉 30 <212〉 腿 <213〉
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權利要求
1.一種豬鏈球菌2型表面蛋白，其特徵在於具有序列表中序列1的胺基酸序列。
2. 根據權利要求l的豬鏈球菌2型表面蛋白，其編碼基因具有序列表中 序列2的核苷酸序列。
3. —種表達豬鏈球菌2型表面蛋白的重組表達質粒，其特徵在於含有序列表中序列2的核苷酸序列。
4. 根據權利要求3所述的重組表達質粒，其中表達質粒為大腸桿菌表達 質粒pET32a。
5. —種表達豬鏈球菌2型表面蛋白的菌株，其特徵在於含有權利要求3 所述重組表達質粒。
6. 根據權利要求5所述菌株，其中表達菌株為大腸桿菌BL21。
7. 權利要求1或2所述豬鏈球菌2型表面蛋白的製備方法，包括如下步驟(1) 克隆該表面蛋白基因；(2) 將基因與大腸桿菌表達質粒相連接，轉化大腸桿菌；(3) 誘導表達；(4) 對表達產物進行分離純化。
8. 根據權利要求7所述方法，其中大腸桿菌表達質粒為pET32a，大腸杆 菌為co//BL21。
9. 權利要求1或2所述的豬鏈球菌2型表面蛋白在製備豬鏈球菌2型感 染診斷試劑中的應用。
10. 權利要求1或2所述的豬鏈球菌2型表面蛋白在製備豬鏈球菌2型疫 苗中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種豬鏈球菌2型表面蛋白，還公開了該蛋白質的製備方法及用途。本發明的豬鏈球菌2型表面蛋白在genebank中的編號為gi|146321522，其製備方法包括克隆該表面蛋白基因；將基因與大腸桿菌表達質粒相連接，轉化大腸桿菌；誘導表達；對表達產物進行分離純化等步驟。本發明的表面蛋白可用作診斷靶標，在豬鏈球菌感染的動物和人可檢測到該蛋白特異的抗體，同時又是重要的保護性抗原，可用於製備疫苗。
文檔編號C07K14/315GK101613399SQ200810115510
公開日2009年12月30日 申請日期2008年6月25日 優先權日2008年6月25日
發明者姜永強, 研 尉, 煒 張, 李文君, 華 江, 耿紅冉, 媛 袁, 鄭玉玲 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所