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一株產黑麴黴葡萄糖氧化酶的畢赤酵母工程菌及其應用的製作方法

2023-09-15 18:52:40 3

一株產黑麴黴葡萄糖氧化酶的畢赤酵母工程菌及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種產葡萄糖氧化酶酵母工程菌及構建方法與應用,屬於基因工程【技術領域】。本發明採用重組DNA技術將黑麴黴accc30161的葡萄糖氧化酶(GOD)基因克隆連接到含3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子的畢赤酵母分泌型表達載體pGAPZαA,並轉化Pichia?pastoris?SMD1168,經篩選鑑定得到一株可以產較高活性葡萄糖氧化酶的重組畢赤酵母SMD1168-GOD。該菌株在3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子的調控下表達的葡萄糖氧化酶在酶活達107U/mL,為葡萄糖氧化酶的大規模生產及應用奠定了良好的基礎。
【專利說明】一株產黑麴黴葡萄糖氧化酶的畢赤酵母工程菌及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程【技術領域】,特別是涉及巴斯德畢赤酵母的新的菌株 SMD1168-G0D以及該菌株的應用。

【背景技術】
[0002] 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,G0D)是一種需氧脫氫酶,廣泛應用於蛋白脫糖、 葡萄糖定量分析、醫用檢測、食品工業及生物傳感器等多種領域。目前G0D主要從黑麴黴和 青黴中製備純化,但產量低、純化工藝繁雜,因此用基因工程方法構建更優良的G0D生產菌 株一直受到高度重視。
[0003] 巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統是目前應用最廣泛的外源基因真核 表達系統之一,其蛋白表達量高,且被表達的蛋白中雜蛋白少。畢赤酵母還具有能夠嚴格調 控外源蛋白的表達,對表達產物進行加工、摺疊和翻譯後修飾,及可將外源蛋白分泌至胞外 等優點。
[0004] 宿主菌的選擇顯著影響外源基因的表達。SMD1168是蛋白酶缺陷性菌株,特別適用 於分泌性表達載體,其Pep4基因突變,缺失蛋白水解酶活性,而Pep4編碼的蛋白酶A可激 活一系列蛋白酶,因此用SMD1168表達外源蛋白,可有效降低表達產物降解,提高表達量。 研究顯示使用蛋白酶缺陷菌株表達5-HT5A、乳糖酶等外源蛋白時,蛋白產量得到成倍增加。


【發明內容】

[0005] 本研究利用從黑麴黴aCCC30161克隆的G0D基因構建了含3-磷酸甘油醛脫氫酶 基因啟動子(glyceraldehyde-3-phosphate dehygrogenase gene promoter,pGAP)的分泌 型表達載體,並用其轉化了畢赤酵母蛋白酶缺陷性菌株SMD1168,實現葡萄糖氧化酶的高效 分泌表達。
[0006] 本發明的畢赤酵母SMD1168-G0D,是一種全新的菌株,該菌株能夠高效表達葡萄糖 氧化酶。

【具體實施方式】
[0007] 1材料與方法
[0008] 1. 1 材料
[0009] 1. 1. 1菌株和質粒
[0010] 黑麴黴aCCC30161由山東師範大學生命科學院生物技術系戴美學教授提供;畢赤 酵母SMD1168及質粒pGAPZaA購自Invitrogen公司;大腸桿菌DH5a購於北京全式金生 物技術有限公司。
[0011] 1.1.2 試劑
[0012] 限制性內切酶Not I、Κρη I和EcoR I為TaKaRa公司產品;T4DNA連接酶和限制 性內切酶Avr II為Fermentas公司產品;2XEasy Taq PCR SuperMix購自北京全式金生物 技術有限公司;引物合成和基因序列測定由深圳華大基因公司完成;GOD標準品購自Sigma 公司;兔抗黑麴黴GOD -抗為Abeam公司廣品;HRP標記的山羊抗兔_抗購自北點中杉金橋 生物技術有限公司;PVDF膜及ECL發光液購自美國Millipore公司;Omega SP Fungal DNA kit試劑盒、質粒小量提取試劑盒及瓊脂糖凝膠回收試劑盒為Omega公司產品;BCA蛋白含 量檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司。
[0013] 1.1.3引物設計
[0014] 根據Genebank中的多個黑麴黴G0D序列,利用Primer Premier5. 0軟體設計引物 P1和P2 (表1),以從黑麴黴accc30161基因組中擴增出含G0D基因的約2. Okb DNA片段。 該DNA片段經擴增並測序後,根據測序結果及質粒pGAPZ α A上的多克隆位點,設計引物P3 和P4 (表1),擴增具有酶切位點的G0D基因。
[0015] 1.2實驗方法
[0016] 1. 2. 1黑麴黴基因組提取
[0017] 將黑麴黴aCCC30161在馬鈴薯葡萄糖培養基(馬鈴薯200g/L,葡萄糖20g/L)中 26°C振蕩培養2天,離心後用無菌雙蒸水洗滌菌體3次,將菌體在液氮中研磨至粉狀,用 Omega SP Fungal DNAkit試劑盒提取基因組DNA。
[0018] 1.2. 2黑麴黴G0D基因擴增與測序
[0019] 以黑麴黴基因組DNA為模板,以P1、P2為上下遊引物進行PCR擴增。反應體系包 含:2XEasy Taq PCR SuperMix25yL,黑麴黴基因組DNA2yL,上下遊引物各2yL,無菌雙 蒸水19yL。反應條件為:94°C預變性3min,然後94°C變性30s、50°C退火30s、72°C延伸 2min,反應30個循環,最後72°C延伸10min。反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑑定並測序。
[0020] 1.2.3重組質粒的構建
[0021] 以黑麴黴基因組DNA為模版,用引物P3和P4進行PCR擴增,反應體系及條件 同1.2.2。?0?產物回收並用邱111和此七1雙酶切後與經同樣雙酶切的?64?2 〇六質粒 以3 : l(w/w)混合,並用T4DNA連接酶22°C過夜連接。用連接產物轉化感受態大腸桿菌 DH5a,然後在含25μ8/ιΛ Zeocin的低鹽LB平板(蛋白腖10g/L、酵母膏5g/L、氯化鈉 4g/ L及瓊脂粉15g/L)上篩選陽性菌落。用含25 μ g/mL Zeocin的低鹽液體LB培養基培養陽 性菌並提取質粒,用PCR擴增和EcoR I酶切分析篩選出G0D基因以正確方向插入pGAPZ a A 的重組子pGAPZaA-GOD,並對其進行測序。其中PCR擴增所用方法同1.2.2,所用引物為 pGAP 和 3' A0X1 (表 1)。
[0022] 表1本研究所用引物序列
[0023]

【權利要求】
1. 一種重組畢赤酵母SMD1168-G0D,利用基因工程方法構建重組質粒,並將其電擊轉 化畢赤酵母,構建高質高產的黑麴黴葡萄糖氧化酶巴斯德畢赤酵母SMD1168-G0D。
2. 根據權利要求1所述的畢赤酵母SMD1168-G0D,其特徵是將黑麴黴accc30161葡 萄糖氧化酶基因擴增後插入pGAPZa A質粒,構建了畢赤酵母葡萄糖氧化酶表達載體 pGAPZ a A-GOD。pGAPZ a A-GOD經菌落聚合酶鏈式反應擴增、重組質粒瓊脂糖凝膠電泳、限制 性酶切分析及測序等方法驗證後,被用於轉化畢赤酵母SMD1168-G0D。
3. 根據權利要求1所述的畢赤酵母,其特徵是葡萄糖氧化酶蛋白表達量高,且被表達 的蛋白中雜蛋白少,並可將蛋白分泌至細胞外,有利於純化回收。
【文檔編號】C12R1/685GK104099261SQ201310116832
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月7日 優先權日:2013年4月7日
【發明者】畢文祥, 邱佔軍, 孔峰 申請人:畢文祥, 邱佔軍, 孔峰

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