一種新型冠狀病毒的製作方法
2023-09-15 19:40:20 3
專利名稱：一種新型冠狀病毒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型病毒，具體地說涉及一種引起嚴重急性呼吸系統症候群的新型冠狀病毒。
發明內容
本發明公開了一種新型冠狀病毒，該病毒屬於冠狀病毒科(Coronaviridae)，冠狀病毒屬(Coronavirus)，為SARS冠狀病毒。該病毒的四個毒株分別從廣州地區和北京地區非典型肺炎死亡病例肺組織標本，北京地區非典型肺炎患者鼻咽拭子標本以及北京地區非典型肺炎死亡病例肝與淋巴結混合組織標本中分離，分別命名為GZ01，BJ01，BJ02，BJ03株，已經於2003年6月5日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市海澱區中關村北一條13號，中國科學院微生物研究所)保藏，四株病毒的保藏登記號分別為CGMCC NO.0939，CGMCC NO.0936，CGMCC NO.0937，CGMCC NO.0938。
該病毒顆粒多呈球形或橢圓形，外周有冠狀排列的纖突，突起末端呈球狀，纖突之間有較寬的間隙，病毒直徑在80～120nm之間，纖突長20～40nm。見圖2a。此外，也見到短杆狀、腎形和不規則形的病毒顆粒，長120-220nm，寬50-90nm，纖突長20～40nm，單排或雙排，呈花瓣狀。該病毒顆粒主要分布在感染細胞細胞質的內質網池、高爾基體、空泡內和細胞外，有時在胞質中也見散在的病毒顆粒。成熟的病毒顆粒外周可見清晰的雙層膜結構。病毒顆粒呈空心和實心兩種狀態，而且同一形狀的病毒顆粒經常出現於同一病毒包涵體中，在有的包涵體和細胞外亦可見到有纖突的病毒顆粒。病毒包涵體多為球形或橢圓形，其形態、大小差異較大，包涵體內病毒排列緊密。可以看到病毒以胞飲或膜融合形式進入細胞內，病毒釋放出細胞外是出芽生殖。感染病毒的細胞線粒體腫脹，部分線粒體外膜和嵴溶解，內質網擴張，細胞核染色質凝聚，邊集。
本發明所述冠狀病毒的4株病毒基因組全序列在美國NIH GenBank的登錄號分別為AY278489，AY278488，AY278487和AY278490。
序列分析表明，本發明的病毒株與已知人及動物冠狀病毒的同源性均小於70％。系統發生樹圖表明所分離的病毒，無論是與人冠狀病毒還是與動物冠狀病毒的親緣關係均較遠。因此，所分離的病毒是一種新的、已發生變異的冠狀病毒。
本發明的發明人通過血清流行病學調查和中和試驗，證明本發明的病毒與目前流行的非典型肺炎關係密切，是引起這次流行的非典型肺炎的主要病原體。
發明人利用新冠狀病毒感染乳鼠，引起乳鼠不規律的發病和死亡，並從感染鼠肺標本中觀察到冠狀病毒顆粒，結合新冠狀病毒的分離鑑定、病原關係的血清學研究，充分證明引起此次非典型肺炎的病原體是新冠狀病毒。
本發明對病原體的分離鑑定有以下方法1、標本處理病人組織標本和血液標本取屍解肺組織標本研成勻漿，加入適量的病毒稀釋液，離心後取上清用於接種細胞培和動物；鼻咽拭子標本將抗生素加入標本中，4℃過夜後離心，上清液用於接種。
2、病原體分離培養乳鼠接種法在無菌條件下，用微量注射器乳鼠腦內接種或同時腹腔接種，觀測發病情況，若未發病，則取乳鼠腦、肺組織研磨成懸液，接種乳鼠，連續盲傳3代。
細胞培養法將處理好的標本接種細胞培養瓶，觀察細胞變化，若不出現CPE進行盲傳，連續盲傳3代。
3、電鏡形態觀察電鏡負染色檢查收集分離病原體感染的細胞培養液，固定，負染，透射電鏡觀察。超微結構檢查取感染的細胞，經過戊二醛固定，等滲緩衝液洗滌，鋨酸固定，梯度乙醇脫水，包埋，常規超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，透射電鏡觀察。
4、間接免疫螢光染色分離物感染細胞片的製備在玻片上將細胞接種分離物細胞培養液，吸附後培養。待細胞出現病變，培養使細胞貼壁。漂洗除去未貼壁細胞，涼幹後固定密封保存。間接免疫螢光抗體染色方法將病人血清標本稀釋滅活，再適當稀釋後滴加到細胞抗原片上，37℃作用後衝洗涼幹，再加羊抗人FITC標記螢光抗體，37℃溼盒中作用後衝洗涼幹，螢光顯微鏡觀察染色結果。
5、微量細胞培養中和試驗(固定病毒—稀釋血清抗體法)取冠狀病毒培養液液，測定TCID50，將非典型肺炎患者抗體陽性血清及正常人對照血清稀釋後滅活，混合病毒與血清，置37℃溫箱中作用後將病毒—血清混合物接種敏感細胞培養。計算半數保護量(PD50)。
6、RT-PCR擴增製備待檢標本中總RNA，進行反轉錄PCR擴增，瓊脂糖電泳觀察結果。
7、序列測定、同源性比較和進化樹分析將RT-PCR產物純化後測序，進行Blast同源性比較，根據Genbank登記的已知冠狀病毒基因序列，使用DNAstar軟體的MegAlign模塊，採用JotunHein法進行多株冠狀病毒相應序列比較並繪製系統發生樹。
本發明的病毒可以用於SARS的診斷試劑、抗SARS疫苗的製備等方面。本發明的申請人已經採用此病毒製備了冠狀病毒抗體檢測試劑盒(專利申請號為03124299.5)。
圖1b為肺組織標本接種3天的Vero-E6細胞。
圖2a為北京地區死亡病例屍解肺組織標本接種Vero-E6細胞培養液中的SARS冠狀病毒顆粒，負染色，透射電鏡。
圖2b為廣州地區標本感染乳鼠肺組織中的病毒顆粒，超薄切片。
圖2c為北京地區死亡病例屍解肺組織標本感染Vero細胞中的病毒顆粒。
圖2d為廣州地區死亡病例屍解肺組織標本感染Vero細胞中的病毒顆粒。
圖3為非典型肺炎患者血清與分離的病毒免疫螢光染色反應。
圖4為新分離冠狀病毒基於部分基因序列的系統進化分析圖。
2、血清標本非典型肺炎患者血清，來自廣州和北京地區醫院收治的確診病人；正常人血清，採自北京和廣州地區血站獻血員。
3、細胞Vero-E6、MDCK、Hep-2、Hela、BHK-21和LLC-MK-2等細胞系，均為市購的細胞株。
4、培養基RPIM 1640、DMEM，Gibco/BRL公司產品；小牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司產品；青黴素、鏈黴素為華北製藥廠產品。
5、實驗動物BALB/C和昆明種小白鼠乳鼠3-5日齡，均為本院實驗動物中心繁殖供應。
6、RT-PCR和擴增產物純化試劑、引物用於RNA製備的RNeasy MiniKit，購於QIAGEN公司；反轉錄酶SuperScript II，Taq DNA聚合酶購自Invitrogen公司；核酸凝膠回收試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit購自QIAGEN公司，引物由北京三博遠志生物技術公司合成。二、方法1、標本處理病人組織標本取屍解肺組織標本，在預冷的乳缽中研成勻漿，加入適量的病毒稀釋液(含500u/ml青黴素、500u/ml鏈黴素的1640培養基，pH7.0)，3000rpm離心20min，取上清用於接種細胞培和動物。血液標本病人血液凝塊在預冷的乳缽中研磨成勻漿，加入適量的病毒稀釋液，使之研磨成10-20％的懸液，2000rpm離心20min，上清液用於接種；鼻咽拭子標本按1000u/ml青黴素、1000μg/ml鏈黴素加入標本中，4℃過夜，3000rpm離心30min，上清液用於接種。
2、病原體分離培養乳鼠接種法選擇健康的3-5日齡乳鼠，在無菌條件下，用0.25mL的微量注射器腦內接種，每份樣品接種一窩(至少5隻)，每隻乳鼠腦內接種0.02mL，或同時腹腔接種0.03mL/只。每日觀測小鼠的發病情況，一般觀察7-14天。觀察期內若未出現乳鼠發病，將乳鼠解剖取腦、肺組織，研磨成10％的組織懸液，接種乳鼠，連續盲傳3代。
細胞培養法將處理好的標本接種於長成單層細胞的10mL細胞培養瓶中，每份標本接種兩瓶，37℃吸附1h，然後吸出標本液、加含有2％小牛血清的細胞維持液，置37℃CO2培養箱培養。每天觀察細胞變化，連續觀察10天。若不出現CPE進行盲傳，連續盲傳3代。
3、電鏡形態觀察電鏡負染色檢查收集分離病原體感染的Vero-E6細胞培養液，以6.1％、pH 7.2的戊二醛固定液與培養液按1∶1比例混合固定後，以3％磷鎢酸溶液負染色，透射電鏡觀察。超微結構檢查取感染乳鼠肺組織、肺組織標本和屍解肺組織標本感染的Vero-E6細胞，用3.1％、pH 7.2戊二醛固定，1/15mol·L，pH7.2磷酸鹽等滲緩衝液洗滌3次，1％鋨酸固定後，梯度乙醇脫水，Epon812包埋，常規超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，透射電鏡觀察。
4、間接免疫螢光染色分離物感染細胞片的製備將培養成單層的VERO-E6細胞用Hank’s液洗一次，然後接種分離物細胞培養懸液，1mL/瓶，放37℃孵箱中吸附1h，加入細胞維持液，放37℃繼續培養。待細胞剛剛出現病變時，取感染細胞滴片，將滴好的玻片放37℃CO2孵箱中繼續培養8h使細胞貼壁。取出玻片，放入0.005M pH7.2 PBS中漂洗，除去未貼壁的懸浮細胞，涼幹。放入冷丙酮內，-20℃固定30min，涼幹，-20℃密封保存備用。
間接免疫螢光抗體染色方法將病人血清標本1∶10稀釋後，56℃作用30min，然後再適當稀釋後分別滴加到細胞抗原片上，置37℃溼盒中作用30min(若檢測IgM抗體則作用90min)，衝洗，PBS振蕩洗3次，涼幹。然後加羊抗人FITC標記螢光抗體，置37℃溼盒中作用30min，衝洗同前，涼幹，在螢光顯微鏡下觀察染色結果。
5、微量細胞培養中和試驗(固定病毒—稀釋血清抗體法)取試驗用新分離冠狀病毒培養液液，測定出病毒液的TCID50滴度，備用。將非典型肺炎患者抗體陽性血清及正常人對照血清1∶5稀釋後於56℃、30min滅活。
根據測定的病毒懸液的TCID50滴度，用病毒稀釋液(DMEM+2％小牛血清)將病毒進行稀釋，稀釋成400 TCID50/100μL病毒懸液，備用。同時，用生理鹽水將滅活的患者血清及對照血清進行系列倍比稀釋，即取0.1mL血清加等體積的生理鹽水，依次系列稀釋。
首先，混合病毒與血清，分別取不同稀釋度的血清各0.15mL，將400TCID50/100μL病毒懸液分別加入稀釋的血清管中，0.15mL/管，使各管病毒濃度均為200 TCID50/100μL，充分混勻後置37℃溫箱中作用1h。
病毒—血清混合物接種敏感細胞，將病毒—血清混合物接種到微量培養板培養的VERO-E6細胞中，每個濃度接種4孔，50μL/孔，再補加細胞維持液100μL，放入37℃含5％CO2孵箱中培養。
同時設病毒對照將病毒稀釋成2000、200、20、2 TCID50/100μL，每個稀釋度接種4細胞培養孔，每孔加入病毒懸液50μl；陰性血清對照除用陰性血清代替試驗血清外，其它均同試驗組；正常細胞對照設4孔正常細胞對照，每孔加稀釋液50μL。
逐日觀察細胞病變，並記錄。培養到第3-4天換細胞維持液一次。觀察一周。
半數保護量(PD50)計算根據細胞病變情況，按Reed-Muench方法計算50％血清中和終點。先按下列公式計算出距離比例，距離比例＝(50％-＜50％的死亡率)/(＞50％的死亡率-＜50％的死亡率)，再將＜50％死亡率血清稀釋度的對數(Log)+距離比例乘稀釋係數的對數，即得出半數保護量(PD50)。
6、RT-PCR擴增待檢標本中總RNA的製備，按RNeasy Mini Kit試劑盒說明書，由非典型肺炎患者的屍解肺組織、感染小鼠肺組織及其肝脾等臟器混合物，以及鼻咽拭子接種的Vero E-6細胞及其培養上清中提取總RNA。
首先進行反轉錄，在管中加入5μL總RNA，1μL Superscript II反轉錄酶(200u)，1μL引物4Bm2(或CV2，3)，4μl 5×反應緩衝液，1μL RNA酶抑制劑和1μL 10mM dNTP以及2μL 0.1M DTT，最後用不含RNase的水補足體積至20μL。於42℃反應60min後，95℃滅活5min。然後進行PCR擴增，反應系統包括5μl 10×PCR反應緩衝液，1μL 10mM dNTP，2μL25mM MgCl2，1μL TaqDNA聚合酶(2.5u)，上下遊引物各1μL(10μM)，用水補足至50μL。用2Bp/4Bm、CV1/CV2和BLF+/BLF-引物對分別擴增40和35個循環。反應完畢，將產物經1％瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。
7、序列測定、同源性比較和進化樹分析將RT-PCR產物純化後，由軍事醫學科學院生物工程研究所中心儀器室測序；也可將純化的片段克隆至T-easy載體，篩選陽性克隆測序。所測序列進行Blast同源性比較，根據Genbank登記的目前已知冠狀病毒基因序列，使用DNAstar軟體的MegAlign模塊，採用Jotun Hein法進行多株冠狀病毒相應序列比較並繪製系統發生樹。三、結 果1、病原體分離培養細胞培養分離選擇了Vero-E6、MDCK、Hep-2、Hela和BHK-21等5株傳代細胞株接種病例標本，進行非典型肺炎病原體分離。利用Vero-E6、MDCK細胞分別從廣州地區和北京地區屍解的肺組織及北京地區採集的鼻咽拭子標本中分離出病原體，見表1。標本接種Vero-E6細胞培養後3天出現明顯的細胞病變(CPE)，見圖1a，圖1b，並且能夠穩定傳代，穩定傳7代的分離物已作為毒種保存。在MDCK細胞上也觀察到了明顯的CPE，但出現的時間較晚，需要5天。用另外3株細胞沒能分離出病原體。另外，我們還用Vero-E6分離的病原體接種LLC-MK-2細胞，在LLC-MK-2細胞上分離的病原體也能生長，但出現CPE的時間要到接種後7天。
表1、細胞培養分離病原體結果標本Vero-E6 MDCKHep-2 Hela BHK-211 + +- - -2 + +- - -3 + +- - -1號為廣州地區死者屍解肺組織；2號為北京地區死者屍解肺組織；3號為北京地區患者鼻咽拭子標本。
結果中本發明的發明人分離得四株冠狀病毒毒株GZ01株和BJ01株，分別分離自廣州地區和北京地區非典型肺炎死亡病例肺組織標本；BJ02株，分離自北京地區非典型肺炎患者鼻咽拭子標本；BJ03株，分離自北京地區「非典型肺炎」死亡病例肝與淋巴結混合組織標本。
利用乳鼠分離 利用乳鼠進行病原體分離，腦內接種後第一代有乳鼠發病、死亡，但發病不規律。取發病的鼠腦繼續傳代，目前乳鼠仍能不規律地發病。
2、病原體的電鏡形態學觀察電鏡負染色檢查廣州和北京地區屍解肺組織標本接種的Vero-E6細胞培養液中，負染均查見病毒顆粒，多呈圓形，外周有冠狀排列的纖突，病毒直徑在80-120nm之間，見圖2a。
超微結構檢查在廣州血液標本接種發病的乳鼠肺上皮細胞中查見病毒顆粒，病毒散在分布於細胞漿中，呈圓形，直徑多在90nm左右，見圖2b。感染病毒的細胞線粒體腫脹，部分線粒體外膜或嵴溶解。在廣州地區和北京地區的屍解肺組織標本感染的Vero-E6細胞中均查見大量的病毒顆粒，多呈圓形，直徑在80nm左右。病毒顆粒主要分布在胞漿的內質網池、胞漿空泡內和細胞外見圖2c、圖2d，多聚集成堆。感染病毒的細胞可見內質網擴張，線粒體腫脹、嵴溶解，細胞核染色質凝聚，邊集。
3、患者血液標本的血清學檢測為了證實分離的病原體與流行的非典型肺炎的關係，我們將分離的病毒感染Vero-E6細胞，製備成感染細胞抗原片，用以檢測病人血清中是否存在抗分離的病毒的抗體。從北京和廣州地區採集了26份臨床診斷為非典型肺炎的患者血清，間接免疫螢光染色證明23份患者血清標本中存在抗分離的病毒的抗體，見圖3。而30份正常人血清全部陰性。血清抗體陽性率為88.5％，顯示分離的病毒與這次流行的非典型肺炎關係密切。
4、RT-PCR擴增與序列分析從廣州和北京的兩例非典型肺炎病例的屍解肺組織標本中分離的病原體感染的細胞培養物中，用冠狀病毒屬的簡併引物(2Bp/4Bm)[Poutanen SM，LowDE，Henry B，Finkelstein S，Rose D，Green K，Tellier R，Draker R，Adachi D，AyersM，Chan AK，Skowronski DM，Salit I，Simor AE，Slutsky AS，Doyle PW，Krajden M，PetricM，Brunham RC，and McGeer AJ.Ident ification of severe acute respiratory syndromein Canada.N Engl J Med.Low-1~low-11(at www.nejm.org on March 31，2003)]，通過RT-PCR擴增可獲得一條單一的約250bp的DNA條帶，其大小與預期一致。對該擴增片段核苷酸序列的測定結果表明，其與人冠狀病毒OC43型同源性為67％，與禽傳染性支氣管冠狀病毒和鼠肺炎冠狀病毒的同源性分別為70％和69％。
用另外兩對冠狀病毒聚合酶基因保守區的引物[Stephensen CB，CaseBolt DB，and Gangopadhyay NN.Phylogenetic analysis of a highly conserved region of thepolymerase gene from 11 coronaviruses and development of a consensus polymerasechain reaction assay.Virus Res.1999，60181-189]，同樣從分離的病原體中擴增出與預期大小相同的DNA片段，長度分別為289bp和207bp。其中289bp片段與冠狀病毒科中人冠狀病毒的同源性為53.3％，而與牛冠狀病毒同源性為67.3％；207bp片段與人冠狀病毒同源性為53.6％，而與鼠肝炎病毒同源性為60％。對其序列測定的結果表明，廣州和北京非典型肺炎病例肺組織中分離的病原體的這段序列是相同的，提示兩地引起非典型肺炎流行的可能是相同的病毒株。
與此同時，採用上述引物直接從兩例非典型肺炎屍解肺組織進行RT-PCR擴增，可同樣擴增出預期大小及核苷酸序列完全相同的DNA片段。結果表明，我們分離的病原體確實來自屍解肺組織。從北京地區非典型肺炎患者鼻咽拭子接種的Vero E-6細胞分離的病原體中，採用上述引物，同樣均分別擴增出相應的、大小與序列都相同的DNA片段。
根據Genbank中目前已登記的冠狀病毒基因序列，採用Jotun Hein法繪製系統發生樹圖，表明所分離的病毒，無論是與人冠狀病毒還是與動物冠狀病毒的親緣關係均較遠，其同源性均不超過70％，見圖4。因此，所分離的病毒可能是一種新的、已發生變異的冠狀病毒。本發明所述冠狀病毒的4株病毒基因組全序列在美國NIH GenBank的登錄號分別為AY278489，AY278488，AY278487和AY278490。
5、分離的新冠狀病毒與流行的非典型肺炎的病原關係從廣州地區的兩家醫院和北京地區四家醫院共採集到臨床診斷為非典型肺炎的患者血清113份，其中廣州地區21份，北京地區92份。利用通過細胞培養分離出的4株新冠狀病毒製備成細胞-病毒抗原片，通過間接免疫螢光法檢測患者血清中的抗新分離的冠狀病毒的抗體，患者血清中結果見表2。
表2、IFA法對臨床非典型肺炎病人血清IgG抗體檢測結果醫院編號 檢測標本數陽性陰性陽性率(％)廣州-17 5 2 71.4廣州-214 11 3 78.6北京-139 39 0 100北京-214 10 4 71.4北京-39 7 2 77.8北京-430 27 3 90.0總數 11399 14 87.6從113份臨床確診的患者血清標本中檢測出99份含有抗新型冠狀病毒的抗體，血清抗體總陽性率為87.6％。各醫院標本的檢出陽性率有一定差異，高的達100％，低的也達71.4％。同時檢測了84份正常人血清，其中北京地區30份、廣州地區24份、其它地區30份，結果全部陰性。這些結果顯示出新分離的冠狀病毒與這次流行的非典型肺炎密切相關。
同時發現，不論自北京標本中分離的新冠狀病毒毒株(BJ01，BJ02，BJ03)還是廣州標本中分離的毒株(GZ01)，均可與這些血清產生良好的抗原-抗體反應。
患者血清中抗新分離冠狀病毒抗體的變化先後收集了10位非典型肺炎病人的雙份血清，其中北京地區和廣州地區的各5位。第一份血清在發病5-12天採集，第二份血清於第一份血清採集後1-3周採集。雙份血清抗體檢測結果見表3。
表3.病人雙份血清IFA檢測抗體變化情況患者 採血時間 抗體效價抗體升高序號 (發病天數) (倍數)18 1∶20251∶2560 1282121∶40281∶2560 643101∶320261∶2560 847 1∶20241∶320165101∶160241∶2560 1665 1∶320231∶1280 477 1∶320201∶2560 88121∶20251∶160896 1∶20111∶160810 6 1∶80141∶6408
在一定階段內，隨著患者發病時間的延長，雙份血清抗體都有明顯的升高，最高的升高達128倍，低的也升高4倍。血清抗體的升高證明這些患者近期受到過新冠狀病毒感染。
患者血清抗體對新分離冠狀病毒的中和作用選擇間接免疫螢光測定抗新分離的冠狀病毒抗體陽性的非典型肺炎患者血清，北京地區和廣州地區的各2份，以BJ01株病毒為代表，採取固定病毒-稀釋血清的方法對新分離的冠狀病毒進行中和試驗。結果證明，4份血清對新冠狀病毒BJ01株都有中和作用。根據方法中介紹的半數保護量計算公式計算，4份血清的半數保護量分別為北京地區1號血清1∶160；北京地區2號血清1∶452；廣州地區1號血清1∶768；廣州地區2號血清1∶783。這些結果顯示出北京地區和廣州地區的患者血清對BJ01株病毒都有較強的中和活性，表明引起這兩地非典型肺炎的病毒毒株的中和抗原位點上沒有太大的差異。
通過血清學方法，驗證某一病原體與相應傳染病的病原學關係，是確證一種新傳染病病原體的重要手段之一。本發明通過對臨床確診的非典型肺炎患者血清中抗新分離的冠狀病毒抗體的測定、雙份血清抗體變化的比較和患者血清對新冠狀病毒中和作用的觀察，證明了新分離的冠狀病毒是此次流行的非典型肺炎的病原體。
權利要求
1.一種新型冠狀病毒，分別為SARS冠狀病毒BJ01 CGMCC NO.0936，SARS冠狀病毒BJ02 CGMCC NO.0937，SARS冠狀病毒BJ03 CGMCCNO.0938，SARS冠狀病毒GZ01 CGMCC NO.0939。
2.權利要求1所述的病毒在製備SARS診斷試劑、疫苗中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種新型冠狀病毒，該病毒多呈圓形，外周有冠狀排列的纖突，直徑在80－120nm，分布於胞漿中。該病毒從嚴重急性呼吸系統症候群患者標本中分離獲得，接種敏感細胞可出現CPE，該病毒可與臨床診斷為非典型肺炎的患者血清起特異反應，是一種SARS冠狀病毒。
文檔編號G01N33/569GK1468955SQ0313796
公開日2004年1月21日 申請日期2003年6月12日 優先權日2003年6月12日
發明者祝慶餘, 秦鄂德, 王翠娥, 於曼, 司炳銀, 範寶昌, 常國輝, 彭文明, 楊保安, 姜濤, 李豫川, 鄧永強, 劉洪 , 甘永華 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所, 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物