一種香菇L9015菌種的SSR標記指紋圖譜及其構建方法與應用與流程
2023-09-15 19:39:50 3
本發明屬於香菇菌種的檢測領域，特別涉及一種香菇L9015菌種的SSR標記指紋圖譜及其構建方法與應用。
背景技術：
我國香菇產量已從1983年的1.95萬噸迅速發展到2015年的766萬噸，佔全球香菇總產量的70％以上，改寫了世界食用菌產量的排行榜，並不斷縮小與排行第一的雙孢蘑菇產量差距，有專家預測，由於中國香菇產業的迅猛發展，在近10年內其將成為世界產量最高的食用菌。中國香菇以其驚人的發展速度，優質的品質及低廉的成本為世界菇業人士矚目，中國香菇已風靡世界。
優質菌種在香菇單產和質量中的貢獻率舉足輕重，這決定了香菇菌種在香菇產業中的重要地位。1999年我國籤署了《國際植物新品種保護法》，這不僅要求我們尊重其它國家的品種智慧財產權，同時也要加強保護我們國家自己的品種智慧財產權，為了建立食用菌新品種登記制度來真正保護我國的品種產權，必須首先建立成熟的品種鑑定技術，為新品種登記奠定基礎。尤其日本2004年4月1日開始實行《種苗法修正案》，對我國食用菌尤其是香菇的出口構成了極大的威脅。就國內而言，香菇栽培菌種「同種異名，異種同名」的現象，不僅給菇農帶來了極大的損失，影響了他們的栽培積極性，也極大地影響了中國香菇的快速發展；而且，隨著大規模的工廠化栽培方式的出現，對香菇栽培菌株質量的要求越來越高，需要發展更為簡便、快速、準確的菌株鑑定技術，以保證每批次的用種都準確無誤。
面對這種局勢，就需要進一步加快菌種鑑定技術的研究，在香菇的研究中引進更為有效的菌種鑑定體系。
技術實現要素：
本發明所要解決的技術問題是提供一種香菇L9015菌種的SSR標記指紋圖譜及其構建方法與應用，該指紋圖譜與常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準確性高，重複性好的優點。
本發明的一種香菇L9015菌種的SSR標記指紋圖譜，該指紋圖譜由8對SSR標記組成。SSR標記是基於香菇全基因組測序後開發的簡單重複序列片段(SSR)的擴增引物，經過對不同香菇品種進行PCR擴增後獲得的多態性標記。SSR標記具有擴增帶型好，重複性高的特點。本發明對大量的SSR引物進行了篩選，獲得了8對多態性高的引物，用這8對引物組合獲得的圖譜帶型，檢測目前我國主要栽培的40個香菇品種大多都具有專一性。這8對SSR標記的詳細信息如表1。
表1 SSR標記詳細信息列表
本發明的一種香菇L9015菌種的SSR標記指紋圖譜的構建方法，包括：
(1)菌絲培養：將香菇菌種轉接到馬鈴薯葡萄糖培養基PDB中，23-25℃下避光搖瓶培養，3-4d後收集菌絲；
(2)基因組DNA的提取：用CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法提取上述菌絲的基因組DNA，紫外分光光度法檢測總基因組DNA濃度和純度，調整樣品DNA的濃度一致；
(3)SSR分子標記的檢測：對上述提取的DNA進行8對SSR標記的PCR擴增；
(4)電泳檢測：將上述PCR擴增得到的產物與加樣緩衝液混勻，變性，點樣於變性聚丙烯醯胺凝膠上電泳，銀染，顯色，拍照，分析結果。
所述步驟(2)中的CTAB法提取菌絲的基因組DNA具體工藝包括：
(1)將-20℃冷凍乾燥的香菇菌絲研磨成粉末，加入65℃預熱的2×CTAB抽提液，於65℃保溫45-60min，輕搖混勻；
(2)12000rpm、4℃離心20min，取上清液；
(3)在上述上清液中加入體積比為25∶24∶1的酚、氯仿和異戊醇的混合液，混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入離心管中；
(4)在上述離心管中加入體積比為24∶1的氯仿和異戊醇混合液，混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入另一離心管中；
(5)在上述離心管中加入2/3體積(相對於步驟(4)中的上清液)的-20℃預冷的異丙醇，搖動5min，8000rpm、4℃離心10min，去上清；
(6)將得到的沉澱用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸鉀洗滌2-3次，每次8000rpm，室溫離心5min；
(7)加入預冷的95vol％乙醇，上下顛倒，8000rpm室溫離心10min，棄乙醇，真空抽乾或自然晾乾；
(8)加入100μL 1×TE(Tris/EDTA)緩衝液，使沉澱溶解；
(9)加入1μL 10mg/mL的RNaseA於37℃水浴1h，去除RNA；
(10)將得到的DNA提取物於-20℃貯藏備用。
所述步驟(3)中的PCR擴增體系為：總體積20μL，包括：10×PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl2 2μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10μmol/L SSR標記正向引物和反向引物總體積各1.5μL，濃度20-30ng/μL提取的模板DNA 2μL，ddH2O 10.4μL；
PCR反應條件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30個循環；72℃5min。
所述步驟(4)中的加樣緩衝液用量為2μL；PCR擴增得到的產物點樣量為3μL。
所述步驟(4)中的變性的具體工藝為：於95℃變性5min，結束後置於冰水混合物中冷卻3min。
所述步驟(4)中的電泳的工藝參數為：變性聚丙烯醯胺凝膠的體積百分比濃度為6％，電泳緩衝液為1×TBE，電壓1000v，電流200mA，功率200W，電泳45min。
所述步驟(4)中的銀染的具體工藝為：電泳完成後卸下並拆開玻璃板，膠板卸下後，用去離子水水洗5-8s，瀝乾水分後，在銀染液中避光銀染8min，銀染後，用去離子水水洗5-8s，瀝乾水分，放入顯影液中，至顯影后取出水洗後即可讀數。銀染液、顯影液均可用3-4次。該銀染顯影方法是常規方法的簡化，在高通量試驗中較為高效實用。
所述銀染液的組成為1.5g AgNO3和1500ml H2O；顯影液的組成為16g NaOH、1000ml H2O和8ml甲醛。
本發明的一種香菇L9015菌種的SSR標記指紋圖譜的應用，是利用香菇基因組簡單重複序列片段開發的8對SSR引物，對擴增L9015菌株的總DNA進行PCR擴增，L9015菌種的擴增條帶在收集的40份我國香菇主要栽培品種中具有專一性。表2為本發明使用的8對SSR引物在40份香菇品種中擴增出的所有等位片段的數量及編號(按照擴增片段從大到小編號，通過對照50bp ladder DNA marker確定各SSR引物擴增的各等位片段的相對分子量)。菌種L9015使用這8對SSR引物的擴增片段在總等位片段中的編號組合為：(1)(4)(1+3+6)(1+4)(3)(4)(1+4)(1)，表3為菌種L9015擴增片段組合的位置與大小。符合上述等位片段組合的菌種，即是香菇L9015菌種。
表2 SSR引物擴增的所有等位片段信息匯總表
表3菌種L9015擴增的等位片段編號表
有益效果
本發明與常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準確性高，重複性好的優點。檢測所需時間只需要3-4d，而常規的拮抗試驗所需時間至少需要兩周時間，出菇試驗則需要至少3個月的時間；該方法在所收集的我國40個香菇主栽菌種中具有L9015菌種的專一性，具有良好的應用前景。
附圖說明
圖1為香菇L9015菌種的SSR標記指紋圖譜，其中M是50bp DNA ladder，數字代表的是所用的8對SSR引物，箭頭所指的是香菇L9015菌種的穩定且特異的SSR等位片段組合。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
實施例1
(1)菌絲培養：將香菇菌種轉接到裝有100ml馬鈴薯葡萄糖培養基PDB的三角瓶中，23-25℃下避光搖瓶培養，3-5d後收集菌絲；
(2)基因組DNA的提取：用CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法提取上述菌絲的基因組DNA，紫外分光光度法檢測總基因組DNA濃度和純度，調整樣品DNA的濃度一致；
CTAB法提取菌絲的基因組DNA工藝包括：
a將-20℃冷凍乾燥的香菇菌絲研磨成粉末，加入65℃預熱的2×CTAB抽提液，於65℃保溫45-60min，間或輕搖混勻；
b12000rpm、4℃離心20min，取上清液；
c在上述上清液中加入體積比為25∶24∶1的酚、氯仿和異戊醇的混合液，輕輕混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入離心管中；
d在上述離心管中加入體積比為2∶1的氯仿和異戊醇混合液，輕輕混勻10min，12000rpm、4℃離心10min，取上清液移入另一離心管中；
e在上述離心管中加入2/3體積(相對於步驟(4)中的上清液)的-20℃預冷的異丙醇，輕輕搖動5min，8000rpm、4℃離心10min，去上清；
f將得到的沉澱用75vol％乙醇和10mmol/L醋酸鉀洗滌2-3次，每次8000rpm，室溫離心5min；
g加入預冷的95vol％乙醇，輕輕上下顛倒，8000rpm室溫離心10min，棄乙醇，真空抽乾或自然晾乾；
h加入100μL 1×TE(Tris/EDTA)緩衝液，輕輕敲打使沉澱溶解；
i加入1μL 10mg/mL的RNaseA於37℃水浴1h，去除RNA；
j將得到的DNA提取物於-20℃冰箱貯藏備用；
(3)SSR分子標記的檢測：對上述提取的DNA進行基因SSR標記的PCR擴增；
PCR擴增體系為：總體積20μL，包括：10×PCR buffer 2μL，25mmol/L MgCl2 2μL，10mmol/L dNTP 0.4μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10μmol/L SSR標記正向引物和反向引物總體積各1.5μL，濃度20-30ng/μL提取的模板DNA 2μL，ddH2O 10.4μL；
PCR反應條件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30個循環；72℃5min。
(4)電泳檢測：將上述PCR擴增得到的產物與2μL加樣緩衝液混勻，於95℃變性5min，結束後置於冰水混合物中冷卻3min，點樣3μL於變性聚丙烯醯胺凝膠上電泳，變性聚丙烯醯胺凝膠的體積百分比濃度為6％，電泳緩衝液為1×TBE，電壓1000v，電流200mA，功率200W，電泳45min，銀染，顯色，拍照，分析結果。
銀染的具體工藝為：電泳完成後卸下並拆開玻璃板，膠板卸下後，用去離子水水洗5-8s，瀝乾水分後，在銀染液(1.5g AgNO3和1500ml H2O)中避光銀染8min，銀染後，用去離子水水洗5-8s，瀝乾水分，放入顯影液(16g NaOH、1000ml H2O和8ml甲醛)中，至顯影后取出水洗後即可讀數。銀染液、顯影液均可用3-4次。該銀染顯影方法是常規方法的簡化，在高通量試驗中較為高效實用。
採用8對SSR引物對香菇菌株進行PCR擴增，通過對照50bp ladder DNA marker可確定各SSR引物擴增的等位片段的數量和相對分子量，找到帶型符合編號組合為：(1)(4)(1+3+6)(1+4)(3)(4)(1+4)(1)的菌種，即可確定該菌種為香菇L9015菌種，如圖1中箭頭標註所示。為保證鑑定的準確性，需進行三次重複實驗。
SEQUENCE LISTING
上海市農業科學院
一種香菇L9015菌種的SSR標記指紋圖譜及其構建方法與應用
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PatentIn version 3.3
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