甲醛降解菌及其用途的製作方法

2023-09-16 06:26:00

專利名稱：甲醛降解菌及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及甲醛降解菌及其用途，屬於生物技術領域。
背景技術：
甲醛作為一種重要的化工原料，廣泛應用於塑料、制膠、皮革、染料等行業，是相關工業排放廢水中的主要有害汙染物。甲醛具有極高的化學活性，易發生加成、還原、聚合反應，它易溶於水，同時也能溶解於多種有機溶劑，由於其顯著的細胞毒性、致癌和致畸性，尋求高效防治甲醛汙染策略對人類健康和環境保護有著重大意義。目前，處理甲醛廢水的方法主要分為物理化學處理法和生物處理法兩大類。物理化學處理法普遍存在成本高、操作複雜及二次汙染等問題，考慮到環境和經濟因素，生物處理法有著更為廣闊的前景。但是甲醛對微生物有強烈的抑制作用，高濃度的甲醛能在短時間內對活性汙泥體系造成不可回復的破壞，因此篩選高耐受高效菌株已經成為甲醛生物處理的關鍵。目前，國內外學者已經在許多菌屬發現了能夠降解甲醛的微生物。黃賽花等(2007)報導(黃賽花，陳能場.一株甲醒降解真菌Aspergillus app.H4的分離鑑定.生態環境，2007，16(4): 1175-1179.)篩選得到一株真菌，它能在144h內將1.241g/L甲醛降解至0.004g/L ；Doronina 等(Doronina NV, Ezhov VA, Trotsenko YuA.Aerobic biodegradationof formaldehyde, methanol and methylamine by immobilized Methylobacteriumextorquens cells.Appl.Biochem.Microbiol.1997, 33:138-141.)分離得到一株Pseudomonas alcaligenes,能在 72h 內完全降解 2g/L 甲醒；Mirdamadi 等(MirdamadiS，Rajabi A,Khalilzadeh P,Norozian N, Akbarzadeh A,Mohseni FA.1solation ofbacteria able to metabolize high concentrations of formaldehyde.World J.Microb.Biot.2005, 21:1299-1301.)報導 Methylobacterium extorquens PSS 和 ESS 能完全降解2.96g/L 甲醒,Pseudomonas pseudoalcaligenes OSS 能在 24h 完全降解 3.7g/L 甲醒。但是，迄今為止國內外報導的甲醛降解菌仍然存在耐受濃度低，降解速度慢等缺點，限制了其實際應用。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種耐受濃度較高的甲醛降解菌。本發明甲醛降解菌，其為採自四川彭山貝爾化工有限公司內長期受甲醛汙染的土壤中分離得到的新菌株。該菌株已於2012年10月25日在中國典型培養物保藏中心(地址:武漢市武昌珞珈山，武漢大學，郵編:430072)保藏，分類命名為耶氏副球菌(Paracoccusyeei) scuhtp-FD3，保藏號為 CCTCC N0.M 2012430。本發明甲醛降解菌為革蘭氏陰性菌，菌落為乳白色，呈圓形，表面光滑溼潤，邊緣整齊，中心凸起。本發明甲醛降解菌經16S rDNA序列測序，結果在NCBI資料庫中進行同源性比對，菌株與Paracoccus yeei G1212親緣關係最近，同源性達99%以上。菌株的16SrDNA序列如Seq ID NO l所示。
本發明甲醛降解菌具有高效降解甲醛的能力，該菌株對甲醛的耐受濃度可達12g/L，48h可將其降解87%，22h可完全降解8g/L甲醛。此菌株的甲醛耐受性和降解速率比已有文獻報導的甲醛降解菌明顯要高。本發明甲醛降解菌可以通過下述方法篩選得到:1、菌源採自四川彭山貝爾化工有限公司內長期受甲醛汙染的土壤，採集距表層3-6cm的土壤樣品11份；2、稱取1Og 土樣加入到20ml無菌蒸餾水中，充分打散，靜置後取5ml上清液接種於45ml含0.5g/L甲醛的MSM培養基中，於30°C、150rpm培養72h ；3、取培養液5ml轉接至新鮮MSM培養基中，甲醛濃度提高至lg/L，同樣條件下培養72h,然後取5mL培養液轉移至新鮮MSM培養基中，如此反覆5次，其中甲醛濃度分別為0.5、1、1.5、2、2.5g/L ;將含甲醛2.5g/L的馴化液按不同比例梯度稀釋，分別塗布於含甲醛Ig/L的MSM平板上，30°C培養3d。挑取邊緣清晰的菌落，經BPM培養基平板反覆劃線純化直到獲得單菌落，並分別進行甲醛降解實驗；4、確定各菌株降解能力後，以BPM培養基斜面保藏降解性能優良的菌株。5、菌株的鑑定1)、甲醛降解菌Scuhtp-FD3的菌落形態特徵及生理生化特徵:將已充分活化的菌株Scuhtp-FD3接種到牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基平板上，生長48h後觀察菌落為乳白色，呈圓形，表面光滑溼潤，邊緣整齊，中心凸起。經染色鏡檢，該菌為革蘭氏陰性菌，橢球狀，無鞭毛，不運動。好氧，呼吸代謝；接觸酶陽性，氧化酶陽性。2)、甲醒降解菌scuhtp_FD3的16s rDNA鑑定:16s rDNA序列的擴增米用正向引物(Seq ID N02) 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3』，反向引物(Seq ID N03)5』 -GGTTACCTTGTTACGACTT-3』，以細菌總DNA為模板，PCR反應程序如下:95°C變性5min，95°C 30s, 53°C 30s, 72°C 90s，共 35 個循環；72°C 10min，4°C保存。PCR 產物測序由上海英俊生物技術有限公司完成。將得到的16S rRNA序列登錄GenBank，進行Blast同源比對並構建進化樹。經比對發現，菌株scuhtp_FD3的16S rRNA基因與Paracoccus yeei的16SrRNA基因序列同源性最高，為99%。結合形態、生理生化指標和16S rRNA基因序列分析，初步鑑定菌株 scuhtp_FD3 為 Paracoccus yeei。本發明還提供了含有上述本發明甲醛降解菌的甲醛降解試劑。本發明還提供了上述的本發明甲醛降解菌用於降解甲醛的用途。本發明還提供了上述甲醛降解試劑用於降解甲醛的用途。進一步的，本發明甲醛降解菌降解甲醛的最適條件為30°C、pH7.0。因此，本發明甲醛降解菌和本發明甲醛降解試劑優選在30°C，pH7.0條件下降解甲醛。另外，本發明甲醛降解菌對鹽分的耐受能力較強，鹽度l_10wt%條件下12h對5g/L甲醛的降解率超過90%，，優於已報導的其它同功能菌株，適用於高鹽環境下的甲醛廢水降解。其中，上述的鹽分可以是含有甲醛的工業廢水中常含有的鹽分，比如:氯化鈉，各種重金屬鹽等。因此，本發明甲醛降解菌和本發明甲醛降解試劑優選在鹽濃度0-10wt%的液態環境中降解甲醛。本發明甲醛降解菌和本發明甲醛降解試劑對甲醛的耐受性高，甲醛降解速率快，本發明為含甲醛廢水的處理特別是高鹽甲醛廢水的處理提供了一種新的途徑，具有廣闊的應用前景。


圖1為培養溫度對菌株scuhtp_FD3降解甲醛的影響；圖2為初始pH值對菌株scuhtp_FD3降解甲醛的影響；圖3為搖床轉速對菌株scuhtp_FD3降解甲醒的影響；圖4為菌株scuhtp_FD3降解不同濃度甲醛的過程；圖5為鹽濃度對菌株scuhtp_FD3降解甲醛的影響；圖6為菌株scuhtp_FD3降解高鹽甲醛實際廢水的過程。
具體實施例方式本發明甲醛降解菌，其為採自四川彭山貝爾化工有限公司內長期受甲醛汙染的土壤中分離得到的新菌株。該菌株已於2012年10月25日在中國典型培養物保藏中心(地址:武漢市武昌珞珈山，武漢大學，郵編:430072)保藏，分類命名為耶氏副球菌(Paracoccusyeei) scuhtp-FD3，保藏號為 CCTCC N0.M 2012430。本發明甲醛降解菌為革蘭氏陰性菌，菌落為乳白色，呈圓形，表面光滑溼潤，邊緣整齊，中心凸起。本發明甲醛降解菌經16S rDNA序列測序，結果在NCBI資料庫中進行同源性比對，菌株與Paracoccus yeei G1212親緣關係最近，同源性達99%以上。菌株的16SrDNA序列如Seq ID NOl所示。本發明甲醛降解菌具有高效降解甲醛的能力，該菌株對甲醛的耐受濃度可達12g/L，48h可將其降解87%，22h可完全降解8g/L甲醛。此菌株的甲醛耐受性和降解速率比已有文獻報導的甲醛降解菌明顯要高。本發明甲醛降解菌可以通過下述方法篩選得到:1、菌源採自四川彭山貝爾化工有限公司內長期受甲醛汙染的土壤，採集距表層3-6cm的土壤樣品11份；2、稱取IOg 土樣加入到20ml無菌蒸餾水中，充分打散，靜置後取5ml上清液接種於45ml含0.5g/L甲醛的MSM培養基中，於30°C、150rpm培養72h ；3、取培養液5ml轉接至新鮮MSM培養基中，甲醛濃度提高至lg/L，同樣條件下培養72h,然後取5mL培養液轉移至新鮮MSM培養基中，如此反覆5次，其中甲醛濃度分別為0.5、
1、1.5、2、2.5g/L ;將含甲醛2.5g/L的馴化液按不同比例梯度稀釋，分別塗布於含甲醛Ig/L的MSM平板上，30°C培養3d。挑取邊緣清晰的菌落，經BPM培養基平板反覆劃線純化直到獲得單菌落，並分別進行甲醛降解實驗；4、確定各菌株降解能力後，以BPM培養基斜面保藏降解性能優良的菌株。5、菌株的鑑定I)、甲醛降解菌Scuhtp-FD3的菌落形態特徵及生理生化特徵:將已充分活化的菌株Scuhtp-FD3接種到牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基平板上，生長48h後觀察菌落為乳白色，呈圓形，表面光滑溼潤，邊緣整齊，中心凸起。經染色鏡檢，該菌為革蘭氏陰性菌，橢球狀，無鞭毛，不運動。好氧，呼吸代謝；接觸酶陽性，氧化酶陽性。2)、甲醒降解菌s cuhtp_FD3的16s rDNA鑑定:16s rDNA序列的擴增米用正向引物(Seq ID N02) 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3』，反向引物(Seq ID N03)5』 -GGTTACCTTGTTACGACTT-3』，以細菌總DNA為模板，PCR反應程序如下:95°C變性5min，95°C 30s, 53°C 30s, 72°C 90s，共 35 個循環；72°C 10min，4°C保存。PCR 產物測序由上海英俊生物技術有限公司完成。將得到的16S rRNA序列登錄GenBank，進行Blast同源比對並構建進化樹。經比對發現，菌株scuhtp_FD3的16S rRNA基因與Paracoccus yeei的16SrRNA基因序列同源性最高，為99%。結合形態、生理生化指標和16S rRNA基因序列分析，初步鑑定菌株 scuhtp_FD3 為 Paracoccus yeei。本發明還提供了含有上述本發明甲醛降解菌的甲醛降解試劑。本發明還提供了上述的本發明甲醛降解菌用於降解甲醛的用途。本發明還提供了上述甲醛降解試劑用於降解甲醛的用途。進一步的，本發明甲醛降解菌降解甲醛的最適條件為30°C、pH7.0。因此，本發明甲醛降解菌和本發明甲醛降解試劑優選在30°C，pH7.0條件下降解甲醛。另外，本發明甲醛降解菌對鹽分的耐受能力較強，鹽度l_10wt%條件下12h對5g/L甲醛的降解率超過90%，，優於已報導的其它同功能菌株，適用於高鹽環境下的甲醛廢水降解。其中，上述的鹽分可以是含有甲醛的工業廢水中常含有的鹽分，比如:氯化鈉，各種重金屬鹽等。因此，本發明甲 醛降解菌和本發明甲醛降解試劑優選在鹽濃度0-10wt%的液態環境中降解甲醛。下面結合實施例對本發明的具體實施方式
做進一步的描述，並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。實施例1甲醛降解菌scuhtp-FD3的分離篩選及鑑定1、培養基及試劑活化培養基(BPM):牛肉膏3g/L，蛋白腖10g/L, NaC15g/L，蒸餾水IOOOmL,ρΗ7.3-7.5。基礎鹽培養基(MSM)=NH3NO3lg/L, K2HPO4.3Η201.73g/L, KH2PO40.68g/L,MgSO4.7H200.2g/L, FeSO4.7H200.03g/L, MnSO4.H2O0.03g/L, CaCl2.6H200.02g/L, pH7.0。2、甲醛檢測方法甲醛檢測方法參照修訂後的GB/T 13197-1991 (水質甲醛的測定乙醯丙酮分光光度法[S].),吸取適量試樣於25mL具塞刻度試管中,用水稀釋至標線,加入2.5mL乙醯丙酮溶液搖勻，於60°C水浴15min，取出冷卻至室溫後，在波長414nm處以水為參比測量吸光度，減去空白管測得的吸光度，然後根據標準曲線計算試樣中甲醛含量。3、菌株的篩選及純化(1)菌種來源菌源採自四川彭山貝爾化工有限公司內長期受甲醛汙染的土壤，採集距表層3-6cm的土壤樣品11份。(2)菌株的分離純化稱取IOg 土樣加入到20ml無菌蒸懼水中，充分打散，靜置後取5ml上清液接種於45ml含0.5g/L甲醛的MSM培養基中，於30°C、150rpm培養72h。取培養液5ml轉接至新鮮MSM培養基中，甲醛濃度提高至lg/L，同樣條件下培養72h，然後取5mL培養液轉移至新鮮MSM培養基中，如此反覆5次，其中甲醛濃度分別為0.5、1、1.5、2、2.5g/L ;將含甲醛2.5g/L的馴化液按不同比例梯度稀釋，分別塗布於含甲醛lg/L的MSM平板上，30°C培養3d。挑取邊緣清晰的菌落，經BPM培養基平板反覆劃線純化直到獲得單菌落，並分別進行甲醛降解實驗。確定各菌株降解能力後，以BPM培養基斜面保藏降解性能優良的菌株。4、菌株的鑑定(I)甲醛降解菌scuhtp-FD3的菌落形態特徵及生理生化特徵將已充分活化的菌株Scuhtp-FD3接種到牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基平板上，生長48h後觀察菌落為乳白色，呈圓形，表面光滑溼潤，邊緣整齊，中心凸起。經染色鏡檢，該菌為革蘭氏陰性菌，橢球狀，無鞭毛，不運動。好氧，呼吸代謝；接觸酶陽性，氧化酶陽性。(2)甲醒降解菌 scuhtp_FD3 的 16s rDNA 鑑定16s rDNA序列的擴增採用正向引物5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3』，反向引物5』 -GGTTACCTTGTTACGACTT-3』，以細菌總DNA為模板，PCR反應程序如下:95°C變性5min，95°C 30s, 53°C 30s, 72°C 90s，共 35 個循環；72°C 10min，4°C保存。PCR 產物測序由上海英俊生物技術有限公司完成。將得到的16S rRNA序列登錄GenBank，進行Blast同源比對並構建進化樹。經比對發現，菌株scuhtp_FD3的16S rRNA基因與Paracoccus yeei的16SrRNA基因序列同源性最高，為99%。結合形態、生理生化指標和16S rRNA基因序列分析，初步鑑定菌株 scuhtp_FD3 為 Paracoccus yeei。試驗例I甲醒降解菌scuhtp_FD3的降解特性1、培養條件對菌株降解能力的影響種子菌液:將菌種接種於富集培養基(BPM)培養過夜，取培養液於4000rpm離心IOmin,以0.2M磷酸鹽緩衝液(pH7.0)洗滌2次，配置為細胞濃度1.0X 109cellS/mL的菌懸液，作為種子液，進行本實施例的實驗研究及後續實施例的實驗研究，如無特殊說明，接種量均為1%(ν/ν)。(I)培養溫度影響考察不同的培養溫度(20、25、30、35、40°C )對菌株scuhtp_FD3降解甲醛的影響。在錐形瓶中，將種子液接種到25mL含甲醛5g/L的基礎鹽培養基(MSM)中，搖瓶培養12h後測定甲醛殘留量，計算去除率，其結果如圖1所示。由圖1可知30°C為最適溫度，菌株scuhtp-FD3能在12h內將5g/L甲醛降解至97%。值得注意的是當溫度低至20°C時，菌株FD3對甲醛的降解率仍>90%，說明該菌具有一定的抗低溫能力。(2)初始pH的影響考察不同的初始pH值(5、6、7、8、9)對菌株scuhtp_FD3降解甲醛的影響。在錐形瓶中，將種子液接種到25mL含甲醛5g/L的基礎鹽培養基(MSM)中，搖瓶培養12h後測定甲醛殘留量，計算去除率，其結果如圖2所示。由圖2可知中性環境更適合菌株FD3降解甲醛，最適pH值為7，pH值小於4或大於10，該菌無法生長。(3)搖床轉速的影響考察不同的搖床轉速(90、120、150、180、210rpm)對菌株scuhtp_FD3降解甲醛的影響。在錐形瓶中，將種子液接種到25mL含甲醛5g/L的基礎鹽培養基(MSM)中，搖瓶培養12h後測定甲醛殘留量，計算去 除率，其結果如圖3所示。由圖3可知當轉速為90rpm時甲醛降解率明顯低於轉速為120、150和180rpm時的降解率，而轉速處於150_180rpm時降解率變化很小，可認為轉速到達150rpm時已能滿足菌株scuhtp_FD3降解甲醒的溶氧需求。
2、最適條件下菌株Scuhtp-FD3對各濃度甲醛的降解根據前述培養條件對甲醛降解影響的實驗得出，菌株Scuhtp-FD3降解甲醛的最適條件為溫度30°C，pH值7，搖床轉速150rpm，在此條件下考察該菌對不同濃度甲醛的降解。在錐形瓶中，將種子液接種到25mL含甲醛5g/L的基礎鹽培養基(MSM)中，在最適條件下搖瓶培養，連續測定培養液中甲醛殘留量，其結果如圖4所示。由圖4可知菌株scuhtp-FD3可在6h完全降解lg/L甲醛，隨著甲醛濃度提高，完全降解所需時間也不斷延長，完全降解5g/L和8g/L甲醛分別需時16和22h，所有濃度下均未觀察到延滯期出現。試驗例2甲醒降解菌scuhtp_FD3的耐鹽性考察不同的NaCl濃度(O、1、5、10、15%，質量百分含量)對菌株scuhtp_FD3降解甲醛的影響。在錐形瓶中，將種子液接種到25mL含甲醛5g/L的基礎鹽培養基(MSM)中，搖瓶培養12h後測定甲醛殘留量，計算去除率，其結果如圖5所示。由圖5可知當NaCl濃度低於5%時，菌株scuhtp-FD3降解甲醛幾乎沒有受到影響，12h內對5g/L甲醛的降解率均>95% ；當NaCl濃度為10%時，降解率有所下降，但仍維持在較高水平，降解率>80%，當鹽濃度繼續升高時，該菌的生長和甲醛降解均收到嚴重抑制。結果表明，菌株scuhtp-FD3為耐鹽菌，在液體培養基中的耐鹽度為0-10%。試驗例3甲醛降解菌Scuhtp-FD3對高鹽甲醛實際廢水的降解本試驗例所述廢水取自四川新津某化工廠，其COD值為14.33g/L，甲醛濃度
4.51g/L，NaCl濃度6.9%，pH值1.1-1.2。在試驗中，取廢水25mL置於錐形瓶中，調節pH至
7.0，以1%接種量加入scuhtp-FD3種子液，於30°C，150rpm搖瓶培養，連續測定培養液中甲醛殘留量，其結果如圖6所示。由圖6可知，Scuhtp-FD3在26h內完全降解4.51g/L甲醛，這充分說明其在高COD高鹽濃度 的實際廢水環境中仍能保持對甲醛的高效降解，而對照組甲醛幾乎無降解。
權利要求
1.醒降解菌，其特徵在於:命名為耶氏副球菌(Paracoccusyeei) scuhtp_FD3,保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC N0.M2012430。
2.有權利要求1所述的甲醛降解菌的甲醛降解試劑。
3.權利要求1所述的甲醛降解菌用於降解甲醛的用途。
4.權利要求2所述的甲醛降解試劑用於降解甲醛的用途。
5.根據權利要求3所述的用途，其特徵在於:在30°C,pH7.0條件下降解甲醛。
6.根據權利要求3或5所述的用途，其特徵在於:在鹽濃度0-10wt%的液態環境中降解甲醒。
7.根據權利要求4所述的用途，其特徵在於:在30°C,pH7.0條件下降解甲醛。
8.根據權利要求4或7所述的用途，其特徵在於:在鹽濃度0-10wt%的液態環境中降解甲醒。
全文摘要
本發明涉及甲醛降解菌及其用途，屬於生物技術領域。本發明所解決的技術問題是提供了一種耐受濃度較高的甲醛降解菌。本發明甲醛降解菌，命名為耶氏副球菌(Paracoccus yeei)scuhtp-FD3，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO.M 2012430。本發明甲醛降解菌和本發明甲醛降解試劑對甲醛的耐受性高，甲醛降解速率快，本發明為含甲醛廢水的處理特別是高鹽甲醛廢水的處理提供了一種新的途徑，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12R1/01GK103087952SQ20131001693
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月17日 優先權日2013年1月17日
發明者侯太平, 陶科, 劉崑, 趙浩宇, 耿宇聰 申請人:四川大學