一種甘油磷脂醯乙醇胺的製備方法

2023-09-16 09:20:15 2

專利名稱：一種甘油磷脂醯乙醇胺的製備方法
技術領域：
一種甘油憐脂酸乙醇胺(L-alpha glycerylphosphorylethanolamine, L- a -GPE)的製備方法，涉及到食品化學、精細化學、有機化學和藥物化學領域。
背景技術：
甘油憐脂酸乙醇胺(L-alphaglycerylphosphorylethanolamine, L- a -GPE)為體內天然存在的水溶性磷脂代謝產物，它的原子結構示意圖I所示。它主要存在於豬和兔的肝臟、以及牛的大腦當中，是生物體內腦磷脂、卵磷脂和磷脂醯絲氨酸等磷脂成分生物合成的前體。L- a -GPE具有重要的醫藥應用價值，它能治療人體的各種神經和心理功能缺陷方面的疾病，如心理活動緩慢、記憶力隨著年紀增長下降，以及情緒不穩和心裡感情比較脆弱等方面的疾病。

目前，在國內和國際上製備L-a-GPE的方法，主要包括生物組織器官溶劑萃取(G.B. Ansell et al, J. Neurochem. 1956,1, 32)、烯醒憐脂的催化水解(R. Pietruszko andG. M. Gray, Biophys. Acta. 1962，56，232)、化學合成(US4918062)、蛋黃磷脂和大豆磷脂醇解(EP 0 217 765)等生產方法，以及溶劑萃取(G.B. Ansell et al, J. Neurochem. 1956，1，32)、沉澱法(EP :0 217 765)、薄層色譜(G.B. Ansell et al, J. Neurochem. 1953,55,768)和樹脂柱色譜(J. N. Hawthorne et al, Biochem. J. 1959, 71,195)等純化方法。這些方法在產品的純度、旋光度純度、回收率和環境汙染等方面都存在不同程度的問題。如生物組織器官溶劑萃取方法受限於原材料的供應，因此很難實現大規模的工業化生產；烯醛磷脂的催化水解和沉澱法都存在重金屬離子殘留，同時在環境汙染方面存在一定的問題；蛋黃磷脂和大豆粉末磷脂的醇解製備L-a -GPE，不僅在得率方面、純度方面，在環境汙染方面同樣面臨著挑戰；薄層色譜和樹脂柱色譜方法能實現了很好的分離，但是在製備的產量、產品的得率、以及產品的旋光度方面遇到了一定的瓶頸。脂肪酶水解法生產L-a-GPE非常有吸引力，主要是因為酶法催化具備催化效率高、反應時間短、生產成本低等方面的優勢；同時樹脂和矽膠柱色譜結合法純化L- a -GPE,具有分離效率高、成本低等優點。因此，我們建立了脂肪酶生產和矽膠柱色譜純化製備L- a -GPE的方法，並且為其他天然產物的製備和純化提供了一種新的思路和方法。本發明提供一種L- a -GPE的製備方法，解決了生產L_ a -GPE過程中面臨的轉化率低、旋光純度低、環境汙染等方面的問題，同時也解決了分離純化方面的分離效率低、回收率低以及操作複雜等方面的問題。通過對酶解反應條件和矽膠柱色譜純化條件的優化研究，最終產品純度達到99.8%，回收率66. 5%，比旋光度為-3. 26°。本發明的反應條件溫和，純化過程簡單，是一種方便、經濟、環保、可實現商業化規模製備L-a -GPE的方法。

發明內容
本發明提供了一種脂肪酶水解大豆粉末磷脂生產和矽膠柱色譜純化製備L-a-GPE的方法，該方法利用脂肪酶對大豆粉末磷脂進行水解，粉末磷脂中的磷脂醯乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)上的兩個脂肪酸醯基被水解後生成L-a -GPE,然後用陽離子和陰離子樹脂柱色譜分別對陽離子和陰離子進行去除，再用矽膠色譜柱對L- a -GPE進行純化，去除L- a -GPC和雜質,最後用活性炭對L- a -GPE水溶液進行脫色,去除色素和部分雜質，真空濃縮，得到無色的L-a -GPE。技術方案以粉末磷脂為原料，脂肪酶在水相體系中水解大豆粉末磷脂得到L- a -GPE，樹脂和矽膠柱色譜進行純化，活性炭進行脫色，真空濃縮，得到L- a -GPE0主要步驟包括(I)酶解反應將粉末磷脂加到蒸餾水中，形成磷脂水溶液的乳化體系，添加金屬鹽，混勻後加入脂肪酶，在溫和條件下反應，反應結束後，真空抽濾，得到澄清酶反應液。(2)樹脂吸附酶反應液，用陽離子樹脂去除Ca2+，陰離子樹脂去除Cl—。 (3)矽膠純化工業矽膠活化，稱量矽膠、裝柱，反應液上柱，醇溶液洗脫，自動收集器收集，HPLC-ELSD進行監控，最後得到純度比較高的L-a -GPE。(4)脫色用活性炭去除L-a -GPE溶液中的色素物質和少量雜質，使最終產品保持無色、透明狀態。本方法中脂肪酶水解法生產L- a -GPE的步驟，大豆粉末磷脂中加入去離子水，固液比I : I I : 30g/mL，0 75°C水浴，均質後加入金屬鹽、脂肪酶，反應0 36h，得到L- a -GPE溶液，抽濾，得到清夜。本方法中矽膠純化的步驟，矽膠稱量、攪拌勻漿、裝柱、上樣、過柱、收集、檢測。矽膠稱量，幹矽膠的密度大約0. 4g/mL ;上樣，以矽膠重量計，I 50 (g/g，L- a -GPE :矽膠)；收集餾分的體積，以上樣量計，I 10(g/mL,L-a-GPE :餾分體積)；用HPLC-ELSD檢測，檢測L-a -GPE和雜質，將同一類餾分合併。本發明利用脂肪酶水解大豆粉末磷脂生產和矽膠柱色譜法純化製備L- a -GPE的方法，屬於開創性的研究。


圖IL-a -GPE的結構示意圖其中、表示H，攀表示C， 表示P，參表示0，馨表示No圖2HPLC-ELSD 色譜圖其中圖2a表示酶反應初始原料的液相色譜圖，圖2b表示酶水解反應360min的液相色譜圖，圖2c表示樹脂和矽膠柱色譜純化後的液相色譜圖從圖2c可以看到只有L-a -GPE成分的峰，其純度99. 8%。圖3矽膠柱色譜的洗脫曲線從圖3可以看出矽膠柱色譜法能很好的將L- a -GPE和雜質分離開。圖4L- a -GPE 的 LC-TOF-MS 質譜圖。從圖3中可以看出，[M]和[2M_l]at m/z 216和431，主要碎裂峰為216，198，195，173，149，124，118，99，89，62，這些碎片與L- a -GPE標樣碎裂的離子碎片是一致的。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明作進一步說明。應該理解的是，本發明實施例所述的製備方法僅僅是用於說明本發明，而不是對本發明的限制，在本發明的構思前提下對本發明製備方法的簡單改進都屬於本發明要求保護的範圍。實施例I所用的原料為食品大豆粉末磷脂(其中PC含量約為24% )。脂肪酶水解反應50g粉末磷脂，IOOOmL去離子水，加入三孔燒瓶中，在35°C水浴加熱，300r/min機械攪拌,均質30min,添加CaCl22g,均質,添加華根黴脂肪酶5mL,反應360min,將酶反應液離心、抽濾,得到純淨的酶解反應液。實施例2所用的酶解反應液為實施例I所得的產物。
樹脂柱色譜去除酶反應液中的離子酶解反應液過001X7強陽離子交換樹脂柱(交換容量1800mmol/L)去除Ca2+，過D311大孔型丙烯酸系弱鹼陰離子交換樹脂柱(2200mmol/L)去除Cl_，60°C，真空濃縮，離子交換樹脂再生。實施例3所用的酶解反應液為實施例2去除離子後所得的產物。矽膠柱色譜純化L- a -GPE :稱量L_ a -GPE 2. 97g，溶於50mL乙醇，稱量矽膠148.5g，溶於乙醇，攪拌勻漿、過夜、裝柱、壓實、上樣、用一定比例的乙醇水溶液(I 9，V v)進行洗脫，流速2mL/min，每30mL餾分收集，HPLC-ELSD檢測每份餾分，同類餾分進行合併，通過矽膠柱將L-a -GPE、L-a -GPC及其它副產物分開，矽膠回收，烘箱中，120°C、時間180min，進行矽膠再生；實施例4所用的L- a -GPE溶液為實施例3矽膠柱色譜純化後所得產物。L- a -GPE酶反應液脫色L_ a -GPE的餾分，先減壓濃縮到500mL，然後60°C活性炭脫色、抽濾，真空濃縮，得到無色、透明的2. 33g產品，總得率66.5%，蒸出的溶劑進行乙醇回收。HPLC-ELSD分析，化學純度99. 6%;旋光儀分析，光學純度ee 99%,[a]2D°=-3.26° (H2O含量 15. 7% )。
權利要求
1.一種甘油磷脂醯乙醇胺(L-a-GPE)的製備方法，其特徵在於，包括如下工藝步驟 (1)脂肪酶水解大豆粉末磷脂製備L-a-GPE :磷脂中加入去離子水，固液比I : I I 3(^/1^，0 751水浴，均質後加入金屬鹽、脂肪酶，反應0 3611，得到1-[1-6 ￡溶液，抽濾，得到清夜。
(2)樹脂柱色譜去除陽離子和陰離子陽離子交換樹脂去除Ca2+，陰離子交換樹脂去除Cl_,流速0. 5 4mL/min,柱下收集液中不能檢測到離子,吸附飽和後再生，再生次數I 10次，45 75°C旋蒸，然後溶於醇。
(3)矽膠柱色譜法純化L-a-GPE:稱量矽膠，溶於醇，攪拌勻漿、過夜、裝柱、壓實、上樣,0% 100%醇水溶液(V : V,醇水)進行洗脫,流速0. 5 4mL/min,每10 60mL懼分進行收集，HPLC-ELSD檢測，合併L-a -GPE，矽膠再生。再生條件烘箱中，100 150°C，時間2 8h，再生次數I 10。(4)L- a -GPE脫色50 90°C，活性炭脫色，微孔濾膜抽濾，得到澄清的L- a -GPE溶液，45 75 °C，減壓濃縮，得到產品，醇進行回收。
2.根據權利要求(I)所述的脂肪酶水解法製備L-a-GPE的原料，其特徵在於所用原料為粉末磷脂(0-100%磷脂醯乙醇胺)。
3.根據權利要求(I)所述的脂肪酶水解法製備L-a-GPE的脂肪酶，其特徵在於所述反應中添加的脂肪酶為Lipozyme. TM IM、華根黴脂肪酶、Lipozyme. RMIM、Novizym 435。
4.根據權利要求(I)所述的脂肪酶水解法生產L-a-GPE時添加的金屬鹽，其特徵在於所述的酶水解時添加的金屬鹽為MnCl2、CaCl2, ZnCl20
5.根據權利要求(2)所述的樹脂柱色譜去除陽離子和陰離子的樹脂，其特徵在於所述的樹脂為強酸性、弱酸性、大孔吸附陽離子樹脂的Na型和H型，強鹼性、弱鹼性、大孔吸附性陰離子樹脂的Cl型和OH型。
6.根據權利要求(3)所述的矽膠柱色譜法純化L-a-GPE中的洗脫劑，其特徵在於所述的洗脫劑為甲醇、乙醇、異丙醇。
7.根據權利要求(4)所述的L-a-GPE脫色中的脫色劑，其特徵在於所述的脫色劑為活性炭、凹凸棒土等中的一種或多種。
全文摘要
本發明公開了一種甘油磷脂醯乙醇胺(L-alpha glycerylphosphorylethanolamine，L-α-GPE)的製備方法，屬於脂質開發應用技術領域。包括如下步驟以大豆粉末磷脂為原料，在水相中，用脂肪酶水解磷脂醯乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)生產L-α-GPE；陽離子和陰離子交換樹脂柱色譜分別去除陽離子和陰離子，矽膠柱色譜純化，活性炭脫色，真空濃縮，得到無色透明的L-α-GPE。HPLC-ELSD分析，化學純度99.6％，回收率66.5％；旋光儀分析，光學純度ee99％，(H2O含量15.7％)。
文檔編號C07F9/10GK102732577SQ201110436240
公開日2012年10月17日 申請日期2011年12月23日 優先權日2011年12月23日
發明者劉元法, 周麗, 孟宗, 宋志華, 張康逸, 王興國 申請人:江南大學