小鼠脂聯素基因超表達載體的構建及用途的製作方法

2023-09-16 08:03:40 1

專利名稱：小鼠脂聯素基因超表達載體的構建及用途的製作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及一種小鼠脂聯素基因超表達載體的構建方法及用途。
背景技術：
脂聯素(Adiponectin)是一種主要由脂肪細胞分泌的脂肪細胞因子，亦稱 Acrp30、GBP28或AdipoQ，是與補體有關的30 kDa蛋白質。鼠的脂聯素由247個胺基酸組成，包括N-端分泌信號肽、氨基端非螺旋功能區、膠原樣結構域以及C-端球形結構域 (gAcrp),翻譯後修飾為8種不同的同源蛋白。經胰蛋白酶裂解後得到球形結構域，活性遠遠大於脂聯素，而且與Clq和TNF-α家族具有結構同源性。脂聯素通過3個球形結構域單體連接成三聚體，4 6個三聚體通過膠原結構域連接形成低聚體或者高級結構，有全長和球形兩種循環形式。脂聯素球形結構域比全長結構域能更有效地改善胰島素抵抗和增加脂肪酸氧化。在血漿中有相當高的濃度(5 30yg/ml)。研究發現Adiponectin (ADP) 與胰島素受體(Insulin receptor)有密切聯繫，有抗炎、抗動脈粥樣硬化的作用，在動物脂肪沉積和肌肉發育中是否起著關鍵的調控作用，已成為近年來脂肪源性因子的研究熱點之一。因此，開展脂聯素在動物脂肪代謝和肌肉發育中的功能研究具有重要的意義。基因超表達就是採用強啟動子和增強子等調控元件增強基因的表達量，能特異、 高效地表達特定基因，已經成為研究基因功能的一種有力工具。由於超表達載體PTarget/ ADP的構建，可以特異性地使脂聯素表達量增強，因此超表達載體pTarget/AdDP可以作為一種用於功能基因組的研究強有力的工具。

發明內容
本發明的目的是提供一種小鼠脂聯素(ADP)基因超表達載體的構建方法，通過以下步驟實現
(1)提取正常ICR雄性小鼠白色脂肪組織中的RNA，反轉錄為cDNA，得到小鼠ADPDNA 片段，序列如SEQ ID NO: 1所示；
(2)RT-PCR 擴增
以(1)得到的⑶NA為模板，以
Adiponectin-F (SEQ ID N0: 2) 5，-ATGCTACTGTTGCAAGCTCT-3』 Adiponectin-R (SEQ ID N0: 3) 5，-TCAGTTGGTATCATGGTAGA-3』 為上下遊引物，用pfu DNA聚合酶進行PCR反應。擴增條件為93°C 3 min預變性後， 940C 50 S,56 0C 45 S_2min、72 °C 30s共30個循環.最後1輪循環完成後再72°C延伸 10 min。反應完畢後，用瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增結果； (3)表達載體構建
將回收的目的DNA片段連至pTarget載體.轉化大腸桿菌-T0P10感受態細胞中，塗布含lOOmg/mL氨苄西林(Ampicillin)W LB平板上，過夜培養。挑取單菌落至含有同樣濃度Amp的液體培養液(LB)中.抽提質粒，用EcoRI酶切質粒，1 %瓊脂糖凝膠電泳鑑定。進一步對插入片段進行序列分析。插入片段的序列結果與NM_009605.4 GI: 87252710提供的cDNA序列一致。本發明的另一個目的是提供該小鼠脂聯素(ADP)基因超表達載體在製備治療肥胖及代謝性綜合症(糖尿病)藥物中的應用。或在建立動物模型進行ADP對糖和脂肪代謝的調節及肌纖維生長，發育的影響研究中的應用。作為本發明的小鼠ADP超表達載體的用途，通過以下步驟實現
(1)將含小鼠ADP超表達載體的大腸桿菌擴大培養後，利用去內毒素試劑盒提取高純轉染級質粒；
(2)將含小鼠ADP超表達載體的高純轉染級質粒進行小鼠體內流體效應法超表達實驗，流體效應法參數為質粒15ug，尾靜脈注射超表達載體體積0. Iml/體重(g)，時間為 10s。流體效應法通過大量液體迅速進入體內，產生瞬時高壓，導致肝靜脈竇內皮細胞膜產生大量小孔讓質粒進入細胞內；此方法簡單易行，效果明顯；
(3)小鼠尾靜脈注射超表達載體，1天後，分析pTarget/ADP超表達載體對脂肪代謝關鍵功能基因甘油三脂水解酶(ATGL)、激素敏感脂酶(HSL)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、酵母交配型沉默信息調節因子1 (SIRT1)、氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子-Ia (PGC-I a )、叉頭蛋白03a (F0X03a)基因表達的影響，1周後，同樣分析對脂肪和肌肉上述脂肪代謝關鍵功能基因甘油三脂水解酶(ATGL)、激素敏感脂酶(HSL)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、 酵母交配型沉默信息調節因子1 (SIRT1)、氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子-la (PGC-Ia )、叉頭蛋白03a (F0X03a)，以及肌肉中肌纖維分型肌球蛋白重鏈I型 (MyHCI)、肌球蛋白重鏈II a型(MyHCIIa)、肌球蛋白重鏈11 b (MyHCI Ib)、肌球蛋白重鏈 IIx(MyHCIIx)基因表達的影響，研究ADP的功能。本發明具有以下有益效果本發明是利用基因超表達技術，開拓了目前研究動物脂肪代謝調控和基因功能研究的新思路。此法所用的超表達載體方便易得，載體構建方法簡單、可行，同時構建的超表達載體能夠特異、高效地增強ADP基因的表達，是研究ADP功能的一種強有力的研究技術。本發明可用於研究小鼠ADP基因對脂肪代謝和肌纖維分型功能產生的影響，並為進一步研究ADP基因的功能及調控脂肪代謝和肌纖維分型的作用途徑打下基礎。


圖1是pTarget/ADP超表達載體構建圖譜。圖2是pTarget/ADP超表達載體構建後的酶切鑑定圖譜。圖3是pTarget/ADP載體在肝臟表達後ADP基因表達圖。圖4是pTarget/ADP載體在肝臟表達後蛋白水平檢測圖。圖5是pTarget/ADP載體在肝臟表達後小鼠血清ADP濃度的變化。圖6是pTarget/ADP載體在肝臟表達後1周的小鼠攝食量的變化。圖7是pTarget/ADP載體在肝臟表達後1周的小鼠體重增長變化。圖8是pTarget/ADP載體在肝臟表達後1周的小鼠白色脂肪變化。圖9是pTarget/ADP載體在肝臟表達1天後小鼠白色脂肪分解酶ATGL、HSL、LPLmRNA表達水平變化。圖10是pTarget/ADP載體在肝臟表達1周後小鼠白色脂肪分解酶ATGL、HSL、LPL mRNA表達水平變化。圖11是pTarget/ADP載體在肝臟表達1天後小鼠脂肪相關轉錄因子SIRTl、 PGC-I α以及F0X03a的變化。圖12是pTarget/ADP載體在肝臟表達1周後小鼠脂肪相關轉錄因子SIRT1、 PGC-I α以及F0X03a的變化。圖13是pTarget/ADP載體在肝臟表達1周後小鼠腓腸肌分解酶ATGL、HSL、LPL mRNA表達水平變化。圖14是pTarget/ADP載體在肝臟表達1周後小鼠趾長伸肌分解酶ATGL、HSL、LPL mRNA表達水平變化。圖15是pTarget/ADP載體在肝臟表達1周後小鼠腓腸肌脂肪相關轉錄因子 SIRTl、PGC-I α 以及 F0X03a 的變化。圖16是pTarget/ADP載體在肝臟表達1周後小鼠趾長伸肌脂肪相關轉錄因子 SIRTl、PGC-I α 以及 F0X03a 的變化。圖17是pTarget/ADP載體在肝臟表達後小鼠腓腸肌MyHC-I、MyHC-IIa、MyHC-IIb 、MyHC-IIx mRNA表達水平的變化。圖18是pTarget/ADP載體在肝臟表達後小鼠趾長伸肌MyHC-I、MyHC-IIa, MyHC-IIb、MyHC-IIx mRNA 表達水平的變化。
具體實施例方式本發明結合附圖和具體實施例作進一步詳細說明。實施例1 pTarget/ADP超表達載體的構建
為驗證ADP基因的功能，我們必須先要構建好超表達載體。圖1為我們構建好的超表達載體示意圖。我們提取正常ICR雄性小鼠白色脂肪組織中的RNA，反轉錄為CDNA，得到小鼠ADP DNA片段，並把它連接到pTarget表達載體上，如圖1。圖2 EcoR I酶切結果表明， 目的片段已經連接到表達載體上。圖中M— DNA marker, 1—pTarget/ADP EcoR I酶切， 2 — pTarget/ADP。圖3的連接片段測序結果表明，插入片段與NM_009605. 4 GI:87252710 提供的cDNA序列一致。實施例2:
pTarget/ADP在肝臟中表達後ADP mRNA和ADP蛋白水平變化為檢測pTarget/ADP載體是否在肝臟內過度表達，我們對通過流體效應法導入 pTarget/ADP載體的小鼠肝臟中ADP mRNA表達及蛋白水平利用RT-PCR和Western blotting進行檢測。進行實驗5-6周齡的ICR系雄性小鼠10隻，隨機分為2組，每組5隻， 分別為對照組和實驗組。採用流體效應法尾靜脈注射15ugpTarget/ADP，小鼠飼餵1天後解剖。取肝臟 50 mg 用 Trizol 試劑抽提總 RNA 並用 NanoDrop ND-1000 spectrophotometer 測定濃度，用2. 5 μ':總RNA做RT反應合成cDNA。以cDNA為模板通過PCR反應。PCR反應條件94度50秒變性，56度45秒退火，72度延長，30個循環。用1 %的瓊脂糖凝膠電泳。Adiponectin 的特異性引物正向5，-ATGCTACTGTTGCAAGCTCT-3，(SEQ ID NO: 2)；反向5，-TCAGTTGGTATCATGGTAGA-3，(SEQ ID NO: 3)。取肝臟 100 mg用裂解液(1% triton X-100, 0. 5% sodium deoxycholate, 0. 1% SDS, and 2 mM EDTA)收集細胞。用 13% 的 SDS-PAGE將蛋白分離，然後將蛋白轉到PVDF膜上，孵小鼠抗體，然後再孵連有臘根過氧化物酶的二抗。用試劑盒(Amersham, GE Healthcare, Tokyo, Japan)顯影。結果參見圖4 :RT-PCR結果表明試驗組的肝臟ADP mRNA表達水平明顯比對照組要高，大小為744bp。免疫蛋白印跡(Western Blotting)結果觀察到試驗組的肝臟大小為 3IkDa的ADP蛋白特異性條帶比對照組要強，大小為31kDa。這說明pTarget/ADP導入小鼠後，在肝臟內成功地轉錄和合成ADP蛋白。實施例3:
pTarget/ADP超表達載體在小鼠肝臟內表達後對血清中ADP的影響為檢測pTarget/ADP進入肝臟細胞後，已合成ADP蛋白是否可以分泌進入血液，對經空載體和pTarget/ADP用流體效應法導入的小鼠，分別於注射後第1天，第3天和第7天，採取對照組及試驗組小鼠的血清，用mouse ELISA試劑盒測定小鼠血清中ADP的濃度變化。結果參見圖5 注射質粒後第1天，試驗組小鼠血清中ADP的濃度明顯比對照組要高(P<0. 01 )，第3天，試驗組小鼠血清也比對照組要高，差異顯著(P<0. 05)，到了第7天，試驗組小鼠血清也比對照組要高，差異依然顯著(P<0. 05)，該結果表明pTarget/ADP導入肝臟後迅速大量合成ADP並分泌進入血液，使血液中ADP濃度達到高峰，但是肝臟內ADP的合成持續時間短，在一周內血液中ADP濃度恢復到正常水平。圖5中**表示P < 0.01，差異極其顯著；*表示P <0. 05,差異不顯著。實施例4 :PTarget/ADP載體導入小鼠後對小鼠攝食量及體重的影響
為檢測ADP對小鼠攝食量、體重的影響，經空載體和pTarget/ADP用流體效應法導入的小鼠進行為期7天攝食量和體重的觀察。結果參見圖6，7 流體效應法注射ADP超表達質粒後，和對照組相比，試驗組的小鼠攝食量除了在質粒導入體內後第1天和第6天有顯著性差異外，其它時間內都和對照組沒有差異。在質粒導入體內後第1，2，3天，體重明顯呈上升趨勢(P<0.01)。圖6中#表示P < 0.01，差異極其顯著；*表示P < 0.05，差異顯著。圖 7中**表示P < 0.01，差異極其顯著；**表示P < 0.05，差異顯著。實施例5 :PTarget/ADP載體導入小鼠後對小鼠脂肪的影響
經空載體和pTarget/ADP用流體效應法導入的小鼠飼餵一周，取小鼠白色脂肪組織稱重。結果參見圖8 注射質粒第7天，解剖小鼠，發現實驗組小鼠白色脂肪沒有顯著性差異(P>0. 05)。實施例6 :ADP對白色脂肪中脂肪沉積相關基因的影響
為檢測ADP對白色脂肪沉積相關基因的影響，進行實驗5-6周齡的ICR系雄性小鼠20 只，隨機分為2組，每組10隻，分別為對照組和實驗組。採用流體效應法尾靜脈注射15ug pTarget/ADP表達載體，小鼠飼餵1天後每組各解剖5隻，剩下的1周後解剖。用RT-PCR對脂肪樣品進行分析。所使用的特異性引物如下
ATGL Sense, 5，-AAC ACC AGC ATC CAG TTC AA-3， (SEQ ID NO: 4) Antsense, 5，-GGT TCA GTA GGC CAT TCC TC-3， (SEQ ID NO: 5)
6HSL Sense, 5，-TGA GAT GGT AAC TGT GAG CC-3， (SEQ ID NO: 6) Antsense, 5，-ACT GAG ATT GAG GTG CTG TC-3， (SEQ ID NO: 7) LPL Sense, 5，-CTG GGC TAT GAG ATC AAC AAG GT-3， (SEQ ID NO: 8) Antsense, 5，-AGG GCA TCT GAG AGC GAG TCT-3， (SEQ ID NO: 9) SIRTl Sense, 5，-CAG ACC CTC AAG CCA TGT TT-3， (SEQ ID NO: 10) Antisense, 5，-ACA CAG AGA CGG CTG GAA CT-3， (SEQ ID NO: 11) PGC-I α Sense, 5，-CCG AGA ATT CAT GGA CA AT-3，(SEQ ID NO: 12) Antisense, 5，-GTG TGA GGA GGG TCA TCG TT-3' (SEQ ID NO: 13) Foxo3a Sense, 5，-ATG GGA GCT TGG AAT GTG AC-3， (SEQ ID NO: 14) Antisense, 5，-CCA CAT TCA AAC CAA CAA CG-3， (SEQ ID NO: 15) 18s rRNA Sense, 5，-GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT-3' (SEQ ID NO: 16) Antisense, 5，-CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG-3' (SEQ ID NO: 17)。結果注射pTarget/ADP超表達質粒後第1天，試驗組白色脂肪
ATGL, LPL mRNA表達水平比對照組高，差異顯著(分別為54. 36%，146. 14%, P<0. 05) (見圖9) ;1周後，試驗組白色脂肪ATGL mRNA表達水平比對照組高，差異顯著(51. 79%， Ρ<0· 05), HSL, LPL mRNA表達水平比對照組高，差異極其顯著(39. 15%, 32. 49%，P<0. 01)(見圖 10)。注射pTarget/ADP超表達質粒後第1天，試驗組白色脂肪SIRTl、PGC_1 α，F0X03a mRNA表達水平比對照組高，差異極其顯著(分別為89. 21%，173. 1%, 122. 36%，Ρ<0· 01)(見圖11) ;1周後，試驗組白色脂肪SIRTl mRNA表達水平比對照組高，差異顯著(76. 77%， P<0. 05), PGC-I α mRNA表達水平比對照組高，差異極其顯著(171. 04%，Ρ<0. 01)(見圖12)。實施例8 =ADP對肌肉中脂肪沉積相關基因的影響
為檢測ADP對肌肉中脂肪沉積相關基因的影響，進行實驗(見實施例6)。結果表明 注射pTarget/ADP超表達質粒1周後，試驗組腓腸肌ATGL mRNA表達水平比對照組高， 差異極其顯著(64. 84%，P<0.01)(見圖13)，HSL、LPL mRNA表達水平比對照組高，差異顯著(分別為23. 62%, 83. 81，Ρ<0· 05)。1周後，試驗組趾長伸肌ATGL、HSL、LPL mRNA表達水平比對照組高，差異顯著(分別為20. 12%,67. 87%,44. 45%，Ρ<0· 05)(見圖14)。注射pTarget/ADP超表達質粒1周後，試驗組腓腸肌中F0X03a mRNA表達水平比對照組高，差異極其顯著(76. 25%，P<0. 01)，SIRTl、PGC-I α mRNA表達水平比對照組高，差異顯著(分別為29. 30%, 271. 32%，P<0. 05)(見圖15); 1周後，試驗組趾長伸肌PGC-I α mRNA 表達水平比對照組高，差異顯著(246. 26%，P<0. 01)，SIRTl、F0X03a mRNA表達水平比對照組高，差異顯著(27. 78%，38. 97%，P<0. 05)(見圖 16)。 實施例9 =ADP對肌纖維分型的影響
為檢測ADP對肌纖維分型的影響，進行實驗(見實施例6)。結果表明 試驗組腓腸肌MyHC-I , MyHC-IIa, MyHC-IIx mRNA表達水平表達水平比對照組高， 差異顯著(分別為 61. 35%、73. 25%、80. 49%，P<0. 05)(見圖 17)。趾長伸肌 MyHC-I、 MyHC-IIa, MyHC-IIx mRNA表達水平比對照組高，差異顯著(分別為104. 81%、44. 41%、 75. 53%, P<0. 05)(見圖 18)。 圖17中*表示P < 0. 05，差異顯著；圖18中*表示P < 0. 05，差異顯著。
PCR反應引物如下
MyHC-I Sense 5 『 -ATA GGG GAC CGT AGC AAG AAG-3 『 (SEQ ID NO: 18) Ant-sense 5 『 -TCC TCT CAG CCT TTA GCT GGA-3 『 (SEQ ID NO: 19) MyHC-II a: Sense 5 『 -CGA TGA TCT TGC CAG TAA TG-3 『 (SEQ ID NO: 20) Ant-sense 5 『 -ATA ACT GAG ATA CCA GCG-3 『 (SEQ ID NO: 21) MyHC-IIx =Sense 5 『 -GGA CCC ACG GTC GAA GTT G_3 『 (SEQ ID NO: 22) Ant-sense 5 『 -GGC TGC GGG CTA TTG GTT-3 『 (SEQ ID NO: 23) MyHC-IIb :Sense 5 『 -CAA TCA GGA ACC TTC GGA ACA C_3 『 (SEQ ID NO: 24) Ant-sense 5 『 -GTC CTG GCC TCT GAG AGC AT- 3 『 (SEQ ID NO: 25)。最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。
權利要求
1.一種小鼠脂聯素基因超表達載體的構建方法，其特徵在於，通過以下步驟實現(1)提取正常ICR雄性小鼠白色脂肪組織中的RNA，反轉錄為⑶NA，得到小鼠ADPDNA 片段，序列如SEQ ID NO: 1所示；(2)RT-PCR擴增以(1)得到的⑶NA為模板，上下遊引物為SEQ ID NO:2 5』-ATGCTACTGTTGCAAGCTCT-3』SEQ ID NO:3 5』-TCAGTTGGTATCATGGTAGA-3』用pfu DNA聚合酶進行PCR反應，擴增條件為93°C、3分鐘預變性後，94°C 50秒、 560C 45秒-2分鐘、72°C 30秒共30個循環，最後1輪循環完成後再72°C延伸10分鐘，反應完畢後，用瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增結果；(3)表達載體構建將回收的目的DNA片段連至pTarget載體.轉化大腸桿菌-T0P10 感受態細胞中，塗布含lOOmg/mL氨苄西林的LB平板上，過夜培養，挑取單菌落至含有同樣濃度Amp的液體培養液中.抽提質粒，用EcoRI酶切質粒，1 %瓊脂糖凝膠電泳鑑定。
2.一種小鼠脂聯素基因超表達載體在製備治療肥胖及代謝性綜合症藥物中的應用。
3.一種小鼠脂聯素基因超表達載體在建立動物模型進行脂聯素對糖和脂肪代謝的調節及肌纖維生長，發育的影響研究中的應用。
4.根據權利要求2或3所述的應用，其特徵在於，所述用途通過以下步驟實現(1)將含小鼠脂聯素超表達載體的大腸桿菌擴大培養後，利用去內毒素試劑盒提取高純轉染級質粒；(2)將含小鼠脂聯素超表達載體的高純轉染級質粒進行小鼠體內流體效應法超表達實驗，流體效應法參數為質粒15ug，尾靜脈注射超表達載體體積0. Iml/體重，時間為10 秒；(3)小鼠尾靜脈注射超表達載體，1天後，分析pTarget/ADP超表達載體對脂肪代謝關鍵功能基因ATGL、HSL、LPL、SIRTl、PGC-I α、F0X03a基因表達的影響，1周後，同樣分析對脂肪和肌肉上述脂肪代謝關鍵功能基因ATGL、HSL、LPL、SIRTl、PGC-I α、F0X03a，以及肌肉中肌纖維分型MyHCI、MyHCIIa、MyHCIIb、MyHCIIx基因表達的影響，研究ADP的功能。
全文摘要
本發明提供一種小鼠脂聯素基因超表達載體的構建方法，通過將RT-PCR技術克隆得到的小鼠脂聯素片段並連接到pTarget哺乳動物表達載體系統上，轉化大腸桿菌DH5α，構建得到pTarget/ADP超表達載體的重組質粒，構建好的pTarget/ADP超表達載體對ADP具有很好的增強基因表達量的效果。本發明開拓了目前研究動物脂肪代謝調控和基因功能研究的思路。所用的超表達載體方便易得，載體構建方法簡單、可行，能夠特異、高效地增強ADP基因的表達，可在製備治療肥胖及代謝性綜合症藥物中的應用。或在建立動物模型進行ADP對糖和脂肪代謝的調節及肌纖維生長，發育的影響研究中的應用。
文檔編號C12N15/85GK102206677SQ201110088270
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月9日 優先權日2011年4月9日
發明者向蘭, 戚建華, 汪以真, 黃豔娜 申請人:浙江大學