穩定表達β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸轉移酶I(ST3GALI)的MDCK細胞系的建立的製作方法

2023-09-16 12:39:45 1

專利名稱：：穩定表達β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸轉移酶I(ST3GALI)的MDCK細胞系的建立的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
，具體地本發明涉及工程細胞系克隆MDCK-ST3GALI及其構建方法，更具體地涉及一株工程細胞系克隆MDCK-ST3GALI，其保藏號為CGMCCNo.2620，以及所述細胞系在提高禽流感病毒分離株的生長滴度及噬斑形成能力，對於禽流感病毒受體結合特性變異株監測、抗禽流感病毒藥物的篩選、中和抗體的測定乃至大規模生產細胞培養疫苗生產中的應用。
背景技術：
：流感病毒表面的血凝素(HA)與細胞表面唾液酸寡糖受體結合侵染宿主細胞，禽流感病毒傾向識別a-2,3連接型受體(NeuAca-2,3-Gal)，人流感病毒傾向識別a-2,6連接型受體(NeuAca-2,6-Gal)。流感病毒不同毒株間在受體識別傾向性及親和能力上存在顯著差異，進而影響其對宿主細胞的感染、增殖和擴散能力。病毒分離是流感診斷最常用和最可靠的方法之一。目前多用雞胚來分離流感病毒，其次是MDCK等細胞。當前獲得批准生產的是雞胚來源的滅活疫苗。哺乳動物細胞生產的疫苗在動物模型顯示出比較好的保護作用。MDCK細胞被認為是培養甲M和乙型流感病毒最合適的細胞系，兩家機構也已經接受用MDCK和Vero細胞生產疫苗。流感病毒由於抗原轉換或抗原漂移常導致新的變異抗原的出現，因此疫苗株需要經常更換。當前獲得批准生產的是雞胚來源的滅活疫苗，儘管採取了有效的純化工藝，但是仍然存在著許多不足。不僅成本昂貴，而且雞胚的殘留物可能引起過敏反應，更主要的問題是近來發現通過雞胚所分離到的流感病毒，其抗原性與原始標本的有所不同，即雞胚來源的病毒在雞胚連續傳代後常常引起HA的變異，這種變異也可能發生在病毒其它節段，結果使雞胚來源的疫苗不能與人群中的流行毒株完全匹配。另外，不是所有的病毒都適合疫苗生產，一些病毒在雞胚的細胞中產量很低。因此，當前要解決的問題是獲得高產的母株，然後與流行毒株的HA和NA重配，使疫苗株既保持高產的特性，又具有流行毒株抗原性的特點。MDCK來源的病毒經過連續傳代後，保持了抗原的穩定性，通過MDCK細胞分離出的，其抗原性與原始標本的相似。此外近年來出現的流感病毒"O"相毒株不凝集雞紅細胞，故在流感病毒鑑定中常用豚鼠或人紅細胞來代替。然而，該兩種細胞無細胞核，沉積慢，一般在紅細胞凝集及凝集抑制測定中需60分鐘才能觀察結果，同時在"U"型孔板中，很難沉積成像眼淚樣的點即當中常有小空洞。但MDCK等一些細胞對"O"相毒株的敏感性大大超出雞胚的敏感性。因此，MDCK等一些細胞已成為流感病毒分離不可缺少的一種宿主系統。但MDCK細胞由於受體豐度較低，對病毒的敏感性會隨其代數增加而下降，故MDCK細胞在實驗室傳20代以上時，一般需測試一下其對流感病毒的敏感性。MDCK分離的病毒在很多國家尚未批准用於疫苗生產，因此在病毒分離時同時採用雞胚和MDCK細胞兩套系統。部分毒株雖具備在MDCK等哺乳動物細胞的複製增殖能力，但由於受體豐度較低，造成病毒滴度低，形成蝕斑能力弱，給進一步深入研究乃至疫苗和抗病毒藥物研製造成極大困難。提高MDCK工程細胞系表面受體豐度，有可能改進禽流感病毒分離株的生長滴度及蝕斑形成能力。e-半乳糖苷a-2,3-唾液酸轉移酶I(ST3GALI)催化唾液酸與半乳糖a-2，3連接形式組成受體。本研究首次建立了提高禽流感病毒2,3連接型受體豐度的MDCK細胞系一MDCK-ST3GALI。通過穩定表達ST3GALI，可以增強ST3GALI催化唾液酸與半乳糖以a-2，3形式連接的效力，從而提高MDCK細胞表面a-2,3連接型受體豐度。該穩定表達細胞系細胞表面a-2，3連接型受體豐度顯著高於MDCK細胞，與MDCK相比，部分禽流感病毒分離株在MDCK-ST3GALI上形成蝕斑更大，生長滴度更高。穩定表達ST3GALI的MDCK細胞系建成後，預期更適於禽流感病毒的生長，無論是病毒滴度還是蝕斑形成能力都要更高，也反向證明了禽流感病毒對ct-2,3連接型受體的傾向性，不僅為研究a-2,3連接型受體提供了便捷的工具，對於我們監測禽流感病毒變異株的出現、對禽流感病毒進行受體結合特性的實時監測、及時發現受體結合特性轉換的毒株也有廣泛的應用價值。同時，在我們抗病毒藥物篩選、疫苗株篩選及用於細胞培養疫苗的生產方面都顯示出良好的應用前景。
發明內容在本發明的一個方面，提供表達ST3GALI的MDCK-ST3GALI細胞系。在一個實施方案中，所述MDCK-ST3GALI細胞系是保藏號為CGMCCNo.2620的細胞系。在一個實施方案中，所述MDCK細胞系含有編碼ST3GALI的基因。在一個實施方案中，所述編碼ST3GALI的基因序列如SEQIDNO:l所顯示。在一個實施方案中，所述ST3GALI的胺基酸序列如SEQIDNO:2所顯示。在一個實施方案中，所述編碼ST3GALI的基因序列來自雞。在本發明的另一個方面，提供構建MDCK-ST3GALI細胞系的方法，所述方法包括將ST3GALI的開放閱讀框cDNA序列克隆至MDCK細胞系中。在一個實施方案中，所述ST3GALI的胺基酸序列如SEQIDNO:2所顯示。在一個實施方案中，所述ST3GALI的基因序列如SEQIDNO:l所顯示。在一個優選實施方案中，將ST3GALI的開放閱讀框cDNA序列與真核表達載體連接，將所述真核表達載體轉染到MDCK細胞系中。在一個實施方案中，所述真核表達載體是pIRES2-eGFP。在本發明的另一個方面，提供一種提高禽流感病毒生長滴度以及噬斑形成能力的方法，該方法包括，將病毒毒株接毒於本發明構建的MDCK-ST3GALI細胞系中。在一個實施方案中，所述病毒是禽流感病毒毒株。在一個實施方案中，所述病毒是禽流感病毒毒株H5N1亞型或H9N2亞型。在一個實施方案中，病毒在所述細胞系上的培養條件為37°C，5%C02。在本發明的另一個方面，提供將本發明構建的MDCK-ST3GALI細胞系用於提高禽流感病毒生長滴度以及噬斑形成能力的應用。在本發明的另一個方面，提供將本發明構建的MDCK-ST3GALI細胞系用於研究禽流感病毒2,3連接受體傾向性的應用。在本發明的另一個方面，提供將本發明的構建的MDCK-ST3GALI細胞系對於禽流感病毒受體結合特性變異株監測的應用。在本發明的另一個方面，提供將本發明的構建的MDCK-ST3GALI細胞系用於抗禽病毒藥物的篩選的應用。在本發明的另一個方面，提供將本發明的構建的MDCK-ST3GALI細胞系用於中和抗體的測定的應用。在本發明的另一個方面，提供將本發明的構建的MDCK-ST3GALI細胞系用於大規模生產細胞培養疫苗的應用。更具體地，在本發明的一個實施方案中，將雞ST3GALI的起始密碼子前加入利於真核表達的Kozak序列，將所述基因序列連入真核表達載體pIRES2-eGFP，構建成真核表達質粒pIRES2-eGFP-ST3GALI，將其轉染MDCK細胞，構建成穩定表達ST3GALI的MDCK細胞系，本發明的一株陽性馬-達二氏犬腎細胞系(Madin-Darbycaninekidneycell)MDCK-ST3GALI細胞克隆於2008年7月31日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC,中國，北京市)，保藏號為CGMCCNo.2620。所述細胞系中2，3連接型受體含量顯著高於MDCK細胞(至少兩倍以上)，無論是禽流感病毒毒株H5N1亞型還是H9N2亞型在MDCK-ST3GALI細胞系上測定的滴度高於或等於在MDCK細胞上測定的結果，並且這兩株不同亞型的毒株較之在原代MDCK細胞上形成的蝕斑個體更大，邊緣清晰，且數量也較多。附圖簡述圖1:PCR擴增目的基因ST3GALIM:DL2000marker1:擴增出約1000bp的條帶，與擴增的目的基因ST3GALI大小相符圖2:質粒pIRES2-eGFP-ST3GALI酶切鑑定M:DL2000marker1:質粒pIRES2-eGFP-ST3GALI經SacI/BamHI雙切切出約lOOObp的條帶，即連入的目的基因大小，與預期結果相符圖3:pIRES2-eGFP質粒圖譜圖4:G418耐受細胞生長曲線橫坐標時間(天數)縱坐標細胞存活率(％)選擇在10—14天把細胞全部殺死的濃度作為G418的篩選濃度，即800嗎/ml圖5:MDCK與MDCK-ST3GALI細胞形態觀察上倒置顯微鏡下觀察細胞，MDCK與MDCK-ST3GALI並無明顯形態差異下螢光顯微鏡下觀察細胞，MDCK-ST3GALI可見清晰的綠色螢光，證明eGFP的表達，間接證明目的基因ST3GALI的表達；而MDCK細胞並無綠色螢光圖6:MDCK與MDCK-ST3GALI細胞株RT-PCR鑑定結果M:DL2000markerC:MDCK細胞對照1-5:五株篩選出的細胞克隆，可見有兩株篩選出的細胞克隆(4,5)擴增出了約1000bp的條帶，與目的基因ST3GALI大小相符圖7:流式細胞儀檢測MDCK-ST3GALI細胞綠色螢光蛋白的表達量左MDCK細胞對照右MDCK-ST3GALI細胞，對照MDCK細胞螢光強度集中在10°一10'道數區，而被測細胞主要集中在103道數區，70%以上的細胞被檢出有綠色螢光蛋白的表達，間接說明目的基因ST3GALI的表圖8:流式細胞儀檢測MDCK-ST3GALI細胞和MDCK細胞對不同連接型特異性凝集素的反應性。MAA與2，3連接型反應；SNA與2,6連接型反應。A:MDCK細胞對照B:MDCK-ST3GALI細胞對照C:MDCK細胞與MAA結合D:MDCK-ST3GALI細胞與MAA結合E:MDCK細胞與SNA結合F:MDCK-ST3GALI細胞與SNA結合MDCK-SG3GALI細胞中50。/。以上的被測細胞螢光強度道數區由對照MDCK細胞的10'—102變為12—103(C，D)，說明ST3GALI基因在MDCK細胞中的穩定表達顯著提高了MDCK細胞表面a-2，3連接型受體的豐度。而2,6連接型受體含量在兩種細胞中並沒有顯示出明顯差異(E，F)。圖9:不同禽流感病毒毒株TCID5o測定結果不同毒株在MDCK-ST3GALI細胞上測定的滴度高於在MDCK細胞上測定的結果。1:DKFJ/01/02(H5N1)2:DKGX/53/02(H5Nl)3:A/Chicken/Shandong/6/96(H9N2)4SD/PR8-HAA198T/T200K(H9N2)5:A/Chicken/G醒gxi/10/99(H9N2)6:SD/PR8-HAQ234L/D256N(H9N2)7:SD/PR8-HAT213A/D218N/V224L(H9N2)圖10:不同禽流感病毒毒株的蝕斑形成實驗採用結晶紫染色，形成的蝕斑呈白色，背景呈紫色。DKFJ/01/02(H5N1)及A/Chicken/Guangxi/10/99(H9N2)這兩株不同亞型的毒株在MDCK-ST3GALI上均生長良好，較之在原代MDCK細胞上形成的蝕斑個體更大，邊緣清晰，數量更多。A:DKFJ/01/02(H5N1)在MDCK-ST3GALI細胞上形成的蝕斑B:DKFJ/01/02(H5N1)在MDCK細胞上形成的蝕斑C:A/Chicken/Guangxi/10/99(H9N2)在MDCK-ST3GALI細胞上形成的蝕斑D:A/Chicken/Guangxi/10/99(H9N2)在MDCK細胞上形成的蝕斑E:病毒10000倍(104)稀釋在MDCK-ST3GALI細胞上形成的蝕斑F:病毒10000倍(104)稀釋在MDCK細胞上形成的蝕斑G:病毒100000(105)稀釋在MDCK-ST3GALI細胞上形成的蝕斑H:病毒100000倍(105)稀釋在MDCK細胞上形成的蝕斑圖11:雞ST3GALI基因核苷酸序列和編碼胺基酸序列實施例下文將參考實施例和附圖詳細描述本發明，所述實施例僅是意圖舉例說明本發明，而不是意圖限制本發明的範圍。本發明的範圍由後附的權利要求具體限定。實施例1真核表達質粒pIRES2-eGFP-ST3GALI的構建材料與方法試劑與儀器Trizol、反轉錄酶M-MLV購自Invitrogen公司；pMD18-T載體、oligodT、各種限制性內切酶和Taq酶均購自TaKaRa公司；質粒pIRES2-eGFP購自BDBiosciencesClontech;T4DNA連接酶購自MBI公司；膠回收試劑盒購自上海華舜公司，質粒中量提取試劑盒購自Qiagen公司；CEQ8000自動測序儀為Beckman公司產品。雞beta-galactosidealpha-2，3-sialyltransferase1(ST3GALI)基因的克隆雞beta-galactosidealpha-2,3-sialyltransforase1(ST3GALI)基因(AccessionNO.NM_205217)全長為1029bp的開放閱讀框架(ORF)為生物公司合成，用oligo6軟體設計引物pf:tagagctojcc乂cc(3ccATGGTGACCGTGCGCAAGpr:aactcgagT丁AGCGGCCC丁TGAAGAAC在起始密碼子ATG前加入了利於真核表達的Kozak序列(斜體表示)，同時在ORF兩端引入了便於進入步克隆的兩個酶切位點SacI和XhoI(下劃線表示)。目的片段連在pMD18-T載體上，稱為pMD18-T-ST3GALI，以該質粒為模板進行PCR。反應參數見下表。PCR產物經膠回收試劑盒回收後迸一步用Sacl/Xhol雙切切下目的片段與經SacI/SalI雙切處理的真核表達載體pIRES2-eGFP連接(XhoI與SalI為同尾酶)，獲得真核表達質粒pIRES2-eGFP-ST3GALI。鑑定正確後按照Qiagen質粒中提試劑盒操作說明製備轉染用質粒pIRES2-eGFP-ST3GALI，鑑定正確、測定濃度後可用於轉染。反應液組成體積Ol)Plasmid1pf32pr32PCRBufferdNTPMix(2.5mMeach)4rTaq0.5Sterilewater35.5循環參數TemperatureTimeCycles95°C5min195。C30sec、55°C30secJ>-3072。C90secJ72。ClOmin1結果本實驗通過PCR在目的基因ORF兩端人為引入了利於真核表達的Kozak序列及便於下一步克隆的兩個酶切位點SacI和XhoI(PCR結果見圖1)，利用這兩個酶切位點將目的基因連入真核表達載體pIRES2-eGFP(載體圖譜見圖3)，獲得真核表達質粒pIRES2-eGFP-ST3GALI。使用SacI/BamHI雙酶切鑑定結果顯示目的基因正確的連在了真核表達載體pIRES2-eGFP上(酶切鑑定結果見圖2)。該表達載體含有巨細胞病毒(CMV)啟動子序列及SV40加尾信號和終止序列，不僅能夠在細胞內穩定表達外源基因ST3GALI，載體還帶有新黴素抗性基因neo及綠色螢光蛋白基因eGFP，便於用G418抗性及綠色螢光蛋白標記雙重篩選。測定pIRES2-eGFP-ST3GALI質粒濃度為11.5嗎/Yi1，OD260/280為1.82，表明我們製備的轉染質粒質量合格，可以用於下一步轉染實施例2MDCK-ST3GALI細胞系的構建材料與方法試劑與儀器G418、DMEM培養基、轉染試劑Lipofectamine2000Regeant購自Invitrogen公司；胎牛血清購自GIBCO公司；MDCK細胞用含5%胎牛血清的DMEM培養液(購自gibco公司)培養。倒置顯微鏡為Olympus產品，螢光倒置顯微鏡為ZEISS公司產品。DIGGlyanDifferentiationKit為Roche確定篩選培養基中合適的G418濃度MDCK細胞接種24孔細胞培養板待長至80^滿時加入G418使其濃度分別為200、400、600、800、1000、1200昭/ml，置於37。C、5%C02J§養箱中培養，每日觀察細胞生長狀況，記錄細胞死亡情況。培養兩周後繪製細胞生長曲線確定G418的篩選濃度。脂質體Lipofectamine2000轉染貼壁細胞及抗性細胞克隆的篩選接種約l一3xl05MDCK細胞至6孔板，培養至細胞密度約為80%90%時可用於轉染。將Lipofectamine2000Regeant及質粒pIRES2-eGFP-ST3GALI溶液平衡至室溫，在離心管內準備下列混合液溶液A，稀釋1嗎質粒DNA溶於lOOpl無血清的培養液中；溶液B，稀釋10^1Lipofectamine2000至100|al無血清的培養液中。室溫孵育5min後混合上述溶液，再室溫孵育30min,使之形成DNA-脂質體複合物，同時用不含抗生素及血清的培養液洗滌細胞2次。將DNA-脂質體複合物覆蓋於細胞表面，補加不含抗生素及血清的培養液至總體積為2ml，37°C、5%C02培養箱培養6小時後移除培養物，更換為新鮮的含5%胎牛血清的DMEM培養液繼續培養。24小時後胰酶消化細胞，按1:10的比例傳代至96孔板中，用含有800pg/mLG418的5%胎牛血清DMEM培養液為壓力篩選培養液繼續培養，每孔200W，每3天換液，持續G418篩選2周後，可見有抗性細胞生長。為防止交叉汙染，對照MDCK細胞不進行pIRES2-eGFP空質粒轉染，使細胞在含有G418的培養液中培養至死亡。選擇生長狀態良好的抗性細胞集落,繼續用含有800嗎/mlG418的壓力篩選培養液稀釋至細胞密度為0.5個/100pl，鋪於96孔板中，每孔200W。持續G418篩選2周後選擇表達水平最高的克隆再次按有限稀釋法進行單細胞克隆篩選以確保篩選出單個抗性細胞集落。篩選出的細胞胰酶消化後依次於96L、24孔和6孔細胞培養板擴大培養並按常規方法凍存細胞。RT-PCR鑑定篩選出的細胞株與正常MDCK細胞分別鋪於6孔板，每株細胞鋪一個孔，調整細胞密度使每株細胞密度相當，待長滿後胰酶消化收集細胞。按Trizol法從細胞中提取總RNA，步驟如下按10cm2/ml的比例加入lmlTrizol液室溫放置5min使其充分裂解，轉至離心管，以0.2ml氯仿/mlTrizo1加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15sec。不要使用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。4°C12，000g離心15min。小心取上層水相於一新的離心管，按0.5ml異丙醇/mlTrizol加入異丙醇，室溫放置10min，4°C12，000g離心10min。棄上清，按每lmlTrizol液加入至少lml75。/o乙醇的比例加入75%乙醇，溫和振蕩離心管懸浮沉澱，4°C7500g離心5min。室溫或真空乾燥5-10min，用無RNA酶的水溶解RNA，55"C-60"C水浴10min可促進RNA溶解，但不能讓RNA沉澱完全乾燥，那樣會極大地降低其可溶性。部分溶解的RNA樣品其A26。/28。比值<1.6。RNA還能被100%甲醯胺(除去離子)再溶解並保存在-7(TC。以上實驗所有槍頭、離心管、水、75^乙醇均用DEPC處理並高壓，全程戴手套進行實驗。提出的總RNA按如下體系反轉錄成cDNA，步驟如下首先加入提取的總RNA溶液20pl、OligodT3pl、dNTPmix4(J，輕振混勻後65°C水浴8min。之後取出反應管迅速置於冰上再依次加入下列試劑RNA酶抑制齊U(RNaseOUT)1pl、DTT3jil、5xBuffer8^、M-MLV1(il，總反應體系為40ul，37。C水浴2—3小時後即反轉錄成cDNA。同樣以上實驗所有槍頭、離心管也均用DEPC處理並高壓，全程戴手套進行實驗。以反轉錄成的cDNA為模板，以pf和pr為引物參照實施例1的反應參數進行PCR擴增。結果篩選培養基中G418濃度的選擇我們選擇能在10—14天把細胞全部殺死的濃度作為G418的篩選濃度。根據細胞生長曲線(圖4)，G418濃度在70080(Vg/ml之間時，細胞於10—14天全部死亡。因此選擇800pg/ml為實驗中MDCK細胞的壓力篩選培養基中G418的濃度。'RT-PCR鑑定結果由RT-PCR結果(圖6)可見，有兩株篩選出的細胞株擴增出1000bp的條帶，且條帶單一、清晰，與目的基因大小一致。而對照組正常MDCK細胞未見有擴增條帶。說明我們的目的基因已整合進MDCK細胞中。將這兩株細胞按常規方法擴增凍存，選用其中一株進行後續實驗，命名為MDCK-ST3GALI。目的細胞的篩選正常MDCK細胞近似稜形，貼壁生長。轉染質粒後，使用G418濃度為800嗎/ml的5%胎牛血清的DMEM培養液進行篩選，獲得抗性細胞克隆。在含G418的培養液中，未轉染質粒的細胞死亡。將獲得的抗性細胞混合克隆用G418進行系列稀釋、鑑定、選擇後得到單克隆抗性細胞株。螢光顯微鏡下可見清晰的綠色螢光，證明eGFP表達，也間接證明目的基因ST3GAL1的表達成功，MDCK-ST3GALI與正常MDCK細胞未見明顯的形態差異(圖5)。持續傳代過程中我們使用無G418培養液培養仍可見綠色螢光的表達，同時在後續的RT-PCR鑑定過程中我們也使用的是無G418培養液培養的細胞株，說明目的基因已整合進MDCK細胞基因組中可持續表達。真核表達載體pIRES2-eGFP含有巨細胞病毒(CMV)啟動子序列及SV40加尾信號和終止序列，可以在多種細胞內表達外源基因。將雞ST3GALI的開放閱讀框序列cDNA克隆至pIRES2-eGFP質粒中，構建成pIRES2-eGFP-ST3GALI表達質粒，轉染MDCK細胞，構建成穩定表達ST3GALI的MDCK細胞系。在本部分研究工作中，我們對構建好的MDCK-ST3GALI細胞系進行了RT-PCR鑑定，同時在無G418壓力篩選下持續傳代細胞株，結果顯示外源基因仍可持續穩定表達至少10代以上。這些鑑定結果說明，在所得單克隆細胞株中，ST3GALI基因開放閱讀框序列cDNA己整合進入MDCK細胞基因組中，能夠隨著MDCK細胞傳代而穩定持續地轉錄和表達。在篩選過程中我們發現，有限稀釋法篩選過程中加入至少20%的細胞母液更有利於少量甚至單個細胞的生長，而重複一次有限稀釋法篩選對於選出穩定表達目的基因的單細胞克隆是必要的。RT-PCR鑑定結果為陽性的細胞克隆都是經兩次有限稀釋篩選出的細胞克隆。之後我們還使用Westernblot對MDCK-ST3GALI細胞系與MDCK細胞進行了鑑定，方法參照DIGGlyanDifferentiationKit的方法進行，但實驗結果並未顯示出明顯差異，進一步探究其原因，可能是細胞不同時期表達產物的量不同，Westernblot方法從敏感性、特異性等方面還不足已檢測出兩種細胞系的某一組份表達量的差別，也促使我們採用更加敏感與精確的方法如流式細胞術來檢測目的基因的表達量。國外研究者己將人流感病毒受體組份2,6連接基因ST6GALI整合進MDCK細胞構建成穩定表達細胞系(12，19)，用以研究人流感病毒對2,6連接型受體的親合能力，同時用來監測對神經氨酸酶抑制劑(NAI)呈耐藥性的突變毒株的出現。之前對於流感病毒受體的研究更多的集中在人流感病毒2，6連接型受體，但當禽流感病毒突破種間限制感染人時，要求我們對於流感受體的研究更加廣泛與深入。本研究首次成功構建穩定表達ST3GALI的MDCK細胞系MDCK-ST3GALI，通過增強ST3GALI催化唾液酸與乳糖以a2,3形式連接的效力以期提高MDCK細胞表面NeuAca-2,3-Gal受體豐度。該穩定表達細胞系的建立，不僅為禽流感病毒2,3連接受體傾向性提供了重要的研究工具，對於禽流感病毒受體結合特性變異株監測、抗禽病毒藥物的篩選、中和抗體的測定乃至大規模生產細胞培養疫苗生產應用，具有廣泛應用前景。實施例3流式細胞儀檢測ST3GALI的表達材料與方法試劑與儀器流式細胞儀為Beckman產品。DIGGlyanDifferentiationKit(CatNo.l1210238001)、Anti-digoxigenin-rhodamine均購自Roche公司。流式細胞檢測ST3GALI的表達MDCK與MDCK-ST3GALI分別鋪於六孔板各三個孔。待細胞密度約為90%時(每孔細胞約為1.5x106個細胞)，胰酶消化，分別收集每孔細胞，加少量含血清的培養液以中和胰酶活性，收集細胞沉澱。用含10mMGlycine的PBS洗兩次，再用Buffer1(50mMTris-HCl、0.15MNaCl、lmMMgCl2、lmMMnCl2、lmMCaCl2，PH7.5)洗一次。用配置好的封閉液BlockingSolution(10倍稀釋BlockingSolution於TBS中，TBS:0.05MTris-HCl、0.15MNaCl，PH7.5)均勻重懸細胞沉澱，在冰上封閉1小時。之後按上述方法重複洗滌步驟，再分別用MAA、SNA及空白對照(即不加一抗)同樣處理MDCK與MDCK-ST3GALI，艮卩l^il一抗(或不加)於3(^1Buffer1中均勻重懸細胞沉澱，冰上孵育1小時。重複洗滌步驟，再用I-羅丹明標記抗i也高辛二抗(Anti-digoxigenin-rhodamine，Roche)於3O(ilBuffer1中均勻重懸細胞沉澱，冰上孵育l小時，最後PBS洗滌三次後可用於流式檢測。(12,19)結果目的基因的表達與螢光強度成正相關，相對螢光強度單位用"道數"表示(X軸)。本實驗中，我們構建的MDCK-ST3GALI細胞系有綠色螢光蛋白eGFP的表達，因此可以不做特殊處理直接用於流式細胞儀的檢測。由圖7可知，至少70%以上的細胞被檢出有綠色螢光蛋白的表達，對照MDCK細胞螢光強度集中在10°—10'道數區，而被測細胞主要集中在103道數區，同螢光顯微鏡下觀察的結果相符，證明我們經過兩次單克隆篩選，選出了比較純一的表達外源基因的細胞克隆。為了檢測a-2,3及a-2,6連接型受體在MDCK及MDCK-SG3GALI的含量，我們使用地高辛標記的兩種凝集素作為一抗檢測a-2,3及a-2，6連接型受體的表達量黑接骨木果凝集素(Sambucusnigraagglutinin,SNA)特異性識別2,6連接型唾液酸，高麗槐黃柏甙凝集素(Maackiaamurensisagglutinin,MAA)特異性識別2,3連接型唾液酸(Roche)。羅丹明標記抗地高辛抗體為二抗。檢測結果顯示，MDCK-SG3GALI細胞中a-2,3連接型受體含量著高於MDCK細胞，50。/。以上的被測細胞螢光強度道數區由對照MDCK細胞的10'—12變為102—103。說明ST3GALI基因在MDCK細胞中的穩定表達顯著提高了MDCK細胞表面ot-2，3連接型受體的豐度。而2,6連接型受體含量在兩種細胞中並沒有顯示出明顯差異(圖8)。流式細胞儀檢測目的褲l天l的表達MDCK-ST3GAL1MDCK%totalcveGFPMedian606.431596.341612.8672.6939.28MAAManMedian797.48656.79102.0390.2763.8450.50SNAMedian121.44116.52160.12110.900.9516.55流式細胞術(fluorescence-activatedcellsorting,FACS)是一種可以對細胞或亞細胞結構進行快速測量的新型分析技術和分選技術，是八十年代集單克隆抗體、螢光化學、雷射、計算機等高技術發展起來的一種先進儀器，己廣泛應用於免疫學、生物化學、生物學、腫瘤學以及血液學等方面的研究和臨床常規工作。其特點是①測量速度快，最快可在l秒種內計測數萬個細胞；②可進行多參數測量，可以對同一個細胞做有關物理、化學特性的多參數測量，並具有明顯的統計學意義；③是一門綜合性的高科技方法，它綜合了雷射技術、計算機技術、流體力學、細胞化學、圖像技術等從多領域的知識和成果；④既是細胞分析技術，又是精確的分選技術。近20年來，國內外在FACS上都做了不少的研究和應用工作，也取得了不少成果。特別是隨著儀器和方法和日臻完善，人們越來越致力於樣品製備、細胞標記、軟體開發等方面的工作以擴大FACS的應用領域和使用效果。FACS在免疫組織化學中的應用也大致相同，並注重了在臨床應用的推廣。其中檢測人白細胞表面標誌可對白血病、淋巴瘤作用迅速正確的診斷，對淋巴細胞群和亞群進行精確分類，還能分離純化某一群或亞群細胞。活細胞免疫螢光技術是用於FCM檢測的標本準備，染色後也能在螢光顯微鏡下進行觀察，在某些實驗條件下，活細胞免疫螢光染色後的特異性和敏感性要優於滴片固定的常規間接免疫螢光的結果。活細胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性單克隆抗體與細胞表面相應抗原結合，再用螢光標記的第二抗體結合，根據所測定的螢光強度和陽性百分率即可知相應抗原的密度和分布。在本部分實驗中，我們使用了特異識別2，3連接型唾液酸受體的MAA與特異識別2,6連接型唾液酸受體的SNA為抗體檢測不同連接型受體的表達。1958年，S.H.Madin和N.B.Darby從表觀正常的成年雌性科克獵犬的腎建立了MDCK(NBL-2)細胞株。a-2,3與a-2,6連接型受體在MDCK細胞上都表達，因此它成為研究流感病毒的主要細胞，廣泛用於流感病毒分離、增殖、中和試驗及抗病毒藥物篩選。前面提到MDCK細胞對流感病毒的敏感性隨其代數增加而下降，其原因可能是受體在MDCK細胞上豐度較低造成的(20,23)。MDCK細胞上a-2,6連接型受體豐度要比a-2，3型受體豐度低(6,9，18)。目前已建成提高a-2,6連接型受體表達量的MDCK細胞系以提高對人流感病毒的敏感性。本研究建立了MDCK-ST3GALI細胞系以提高ot-2,3連接型受體的豐度。流式檢測結果證明我們建立的MDCK-ST3GALI細胞系中a-2,3連接型受體的豐度要顯著高於MDCK細胞。此外，有研究證實a-2,3與a-2,6-唾液酸轉移酶由於競爭相同作用底物而導致一方的過表達將抑制另一方的表達(21)，但在本研究中2，6連接型受體含量在MDCK-ST3GALI及MDCK細胞中並沒有顯示出明顯差異，其原因可能是ST3GalIII、ST3GalIV、ST6GALI等的作用底物為Gal(卩l，4)GlcNAc，而ST3GalI、ST3GalII等的作用底物為Gal((31,3)GalNAc;SNA、MAA特異性識別不同底物生成的不同連接型的唾液酸受體(10,21)。因此，提高ST3GALI的表達量不一定能夠顯著抑制2,6連接型唾液酸受體的表達量。實施例4TGID5。的測定與病毒蝕斑材料與方法毒株與試劑H5N1:DKF鹿/02DKGX/53/02H9N2:A/Chicken/Shandong/6/96SD/PR8-HAA198T/T200KA/Chicken/G訓gxi/10/99SD/PR8-HAQ234L/D256NSD/PR8-HAT213A/D218N/V224L以上毒株(1,2)都來自於有溫和型禽流感症狀的養禽場，病禽表現噴嚏，咳嗽，流淚，產蛋下降、下痢等症狀，死淘率升高，並且大部分禽群有細菌混合感染。採集患病禽病料標本或洩殖腔、喉頭棉拭子後送往哈爾濱獸醫研究所國家禽流感參考實驗室進行疾病診斷和病毒分離並保存。"r"表示採用反向遺傳技術獲救的病毒(5,13)，並且利用定點突變技術人為的對某些位點進行了突變(1,2)。TPCK胰蛋白酶為Sigma產品TCIDso的測定MDCK與MDCK-ST3GALI細胞分別鋪於96孔板，待細胞密度至80%-90%時用無血清DMEM洗兩次以洗去死細胞及殘留血清後可用於接毒。於冰上在離心管中用無血清DMEM將病毒液作連續10倍梯度稀釋，從10-1—10-10。將稀釋好的病毒接種到96孔板中，每一稀釋度接種4個孔，每孔接種100ul。其中H9N2病毒稀釋液中加入TPCK胰蛋白酶，並使其終濃度為0.5ug/ml。37°C、5%C02培養箱感作1小時，每20分鐘晃勻一次。感作完畢後棄去毒液，加入無血清DMEM，每孔200ul，H9N2病毒中還需加入終濃度為0.5lig/mlTPCK胰蛋白酶。H5N1亞型病毒培養48小時、H9N2亞型病毒培養72小時後分別吸取上清50iU血凝板中，加入等體積1%雞紅細胞懸液，20分鐘後觀察每孔的血凝活性，以血凝活性的有無代表細胞病變的有無，按Reed-Muench法(4)計算結果。病毒蝕斑MDCK與MDCK-ST3GALI細胞分別鋪於六孔板，待細胞密度至80%-90%時用無血清DMEM洗兩次以洗去死細胞及殘留血清後可用於接毒。用無血清DMEM10倍梯度稀釋病毒至10-8，每個稀釋度接一個孔，每孔500|il，H9N2病毒稀釋液中加入TPCK胰蛋白酶，使其終濃度0.5|ig/ml。37°C、5%C02培養箱感作1小時，每20分鐘晃勻一次。感作完畢後棄去毒液，2XDMEM與2%低熔點瓊脂糖溶液等體積混勻後鋪膠於細胞表面使之完全覆蓋，H9N2病毒凝膠液中需加入TPCK胰蛋白酶，使其終濃度為0.5pg/ml。待膠液凝固後倒置於細胞培養箱繼續培養，72小時後結晶紫(0.1%結晶紫溶於20%甲醇中)染色觀察結果。(12,19)結果TCIDso測定結果為檢測提高2,3連接型受體豐度的MDCK-ST3GALI細胞是否更適於禽流感病毒增殖，我們在H5N1及H9N2亞型毒株中各選擇了幾株測定其TCID50，實驗結果(圖9)測試的毒株中，不論是H5N1亞型還是H9N2亞型，在MDCK-ST3GALI細胞上測定的滴度高於在MDCK細胞上測定的結果，初步說明我們構建的MDCK-ST3GALI細胞系因2,3連接型受體豐度提高而比MDCK細胞更適於禽流感病毒的增殖。TCIDs。測定結果Virustiter(TCID50:Lg/100pi;)VimstypeAntigenicproperty-MDCK-ST3GAL1cellsMDCKcellsH5N11DKFJ/01/028.5丐5DKGX/53/027.07.0H9N23A/Chicken/Shandong/6/966.15.84SD/PR8-HAA198T/T200K6.66.5A/Chicken/Guangxi/10/996.65.16SD/PR8-HAQ234L/D256N5.3305.17SD/PR8-HAT213A/D218N/V224L7.2病毒蝕斑圖10顯示了DKFJ/01/02(H5N1)及A/Chicken/Guangxi/10/99(H9N2)兩株病毒進行病毒蝕斑實驗的結果。實驗結果表明，這兩株不同亞型的毒株在MDCK-ST3GALI上均生長良好，較之在原代MDCK細胞上形成的蝕斑個體更大，邊緣清晰，且數量也較多，進一步證明我們構建的MDCK-ST3GALI細胞系更適合禽流感病毒的增殖。理論上講，提高ST3GALI表達可提高a-2,3連接型受體的豐度，所以我們構建的MDCK-ST3GALI細胞系要比MDCK細胞對禽流感病毒更加敏感，而在其上測定的TCID50值也應該比在MDCK上測定的高。實驗結果與預期相符，所測試的7個毒株中，不論是H5N1亞型還是H9N2亞型，對MDCK-ST3GALI細胞更加敏感，病毒滴度均略高於在MDCK細胞上測得的結果。另外，胺基酸位點的突變可能影響禽流感病毒HA與宿主細胞受體的結合能力，而提高受體含量的MDCK-ST3GALI細胞系對這些改變卻更加敏感。已有報導發現對抗流感藥物Zanamivir或Oseltamivir敏感性下降的變異株出現。若突變位點發生在HA受體結合位點上或其附近，則導致病毒與細胞受體親合力下降。因此，我們構建的MDCK-ST3GALI細胞系也成為監測禽流感病毒變異的便捷工具。病毒蝕斑又稱空斑，是指病毒在已長成的單層細胞上形成的局限性病灶。當病毒在最初感染的細胞內增殖後，由於固體介質的限制，只能進而感染和破壞鄰近的細胞。經過幾個這樣的增殖周期，就將形成一個局限性的肉眼可見的變性細胞區，即蝕斑。從理論上講，一個病毒粒可以形成一個蝕斑。反之，每產生一個蝕斑也就說明原接種物中含有一個活的病毒粒子。但實際情況遠非如此，因為並非每個病毒粒子都有感染和增殖能力，操作過程中也常有許多病毒粒子滅活。因此，以蝕斑形成單位(pl叫ueformingunit,PFU)表示病毒懸液中的感染病毒濃度似乎更為確切。相比其它技術而言，蝕斑技術還是測定病毒懸液中感染病毒含量的一個準確方法。因為組織培養細胞的敏感性比較一致，培養條件也易統一。蝕斑技術主要用於病毒純化，亦即挑選病毒克隆株。由於病毒的遺傳變異，一般所用的病毒懸液或所謂的病毒株，實際上都是由許多在特性上不盡一致的病毒粒子組成的混雜群體。應用蝕斑技術，也就是根據蝕斑的不同的性狀、產斑條件和產斑時間等進行挑斑，可以從這類混雜群體中挑選出各個不同的純化病毒，亦即克隆株。近年來，許多弱毒疫苗株就是能過蝕斑技術選育而成。而在弱毒疫苗的生產中，也需要經常地通蝕斑技術選出克隆株，藉以保證疫苗株穩定的免疫原性和弱毒性。過去認為流感病毒在細胞傳代後會出現感染力下降的情況(23)，另外由於受體豐度較低，用流感病毒感染MDCK細胞也很難取得比較高的血凝單位，通常在160血凝單位以下。然而根據物種進化的原理，如果流感病毒在MDCK連續傳代兩代以上而不出現毒力下降或血凝單位下降，那麼可以認為病毒應該在細胞上有感染力的病毒顆粒存活下來(5)。而篩選出在細胞上高產毒株的意義在於可以和流行毒株表面抗原基因進行重配，從而獲得在哺乳動物細胞上高產的流感疫苗株。-流感病毒由於抗原轉換或抗原漂移常導致新的變異抗原的出現，因此疫苗株需要經常更換(8)。當前獲得批准生產的是雞胚來源的滅活疫苗，儘管採取了有效的純化工藝，但是仍然存在著許多不足。不僅成本昂貴，而且雞胚的殘留物可能引起過敏反應，更主要的問題是雞胚來源的病毒在雞胚連續傳代後常常引起HA的變異，這種變異也可能發生在病毒其它節段(14,15,17,22)，結果使雞胚來源的疫苗不能與人群中的流行毒株完全匹配。應用哺乳動物細胞生產的疫苗在動物模型顯示出比較好的保護作用(16)。MDCK細胞被認為是培養甲型和乙型流感病毒最合適的細胞系(7)。MDCK來源的病毒經過連續傳代後，保持了抗原的穩定性(ll)。然而不是所有的病毒都適合疫苗生產，一些病毒在雞胚的細胞中產量很低。RMS(nationlicensureinreferencememberstate)禾口MRP(mutualrecognitionprocedure)己經接受用MDCK和Vera細胞生產疫苗。因此，當前要解決的問題是獲得高產的母株，然後與流行毒株的HA和NA重配，使疫苗株既保持高產的特性，又具有流行毒株抗原性的特點(S)。工業實用性禽流感病毒在相同條件下在本發明提供的MDCK-ST3GALI細胞系上成斑能力遠遠高於在MDCK細胞上的成斑能力，PFU更高，其產斑時間與MDCK細胞差別不大。使用MDCK-ST3GALI細胞系可用於提高禽流感病毒產量並且用該細胞系避免了雞胚來源滅活疫苗中雞胚的殘留物帶來的副反應效應，可用於研究禽流感病毒2,3連接受體傾向性；用於禽流感病毒受體結合特性變異株監測；用於抗禽病毒藥物的篩選；用於中和抗體的測定；以及用於大規模生產細胞培養疫苗中具有廣泛的應用。參考文獻1Chen,H.,G.Deng,Z.Li，etal.TheevolutionofH5N1influenzavirusesinducksinsouthernChina.ProcNatlAcadSciUSA,2004,101(28):10452-10457。2Ping,J,,C.Li,G.Deng,etaLSingk-amino隱addmutationintheHAalterstherecognitionofH9N2influenzavirusbyamonoclonalantibody.BiochemBiophysResCommun，2008,371(1):168-171。3齊立，吳昆昱，李梓等在MDCK細胞上高產的乙型流行性感冒病毒株的篩選及其全基因組克隆病毒學報200420(3):195-199。4殷震，劉景華動物病毒學(第二版)科學出版社1997329-330。5FodorE，DevenishL,EngdhardtOG,etal.RescueofinfluenzaAvirusfromrecombinantDNA.JVirol199973(11):9679-82。6Govorkova,E.A.,G.Murti，B.Meignier,C.deTaisne,andR.G.WebsterAfricangreenmonkeykidney(Vero)cellsprovideanalternativehostcelsystemforinfluenzaAandBviruses.J.Virol.199670:5519-5524。7Govorkova,E.A.，KodihalliS，AlymovaIV,etal.GrowthandimmunogenicityofinfluenzavirusescultivatedinVeroorMDCKcellsandinembryonatedchickeneggs[J].DevBiolStand.199998:39-51。8HoffmanE,MahmoodK,YangCF,etal.RescueofinfluenzaBvirusfromeightplasmids[J].ProcNatlAcadSciUSA.200299(17):U411-11416。9Ito,T.,Y.Suzuki,A.Takada,A.Kawamoto,K.Otsuki，H.Masuda,M.Yamada，T.Suzuki,H.Kida,andY.Kawaoka.Differencesinsialicacid-galactoselinkagesinthechickeneggamnionandallantoisinfluencehumaninfluenzavirusreceptorspecificityandvariantselection.J.Virol.199771:3357-3362。10Matrosovich,M.,T.Matrosovich，J.Carr,N.A.Roberts,andH.D.Klenk.Overexpressionofthealpha-2,6-sialyltransferaseinMDCKcellsincreasesinfluenzavirussensitivitytoneuraminidaseinhibitors.J.Virol.200377:8418—8425。11MertenOW，ManuguerraJC,HannounC,etal.Productionofinfluenzavirusinserum-freemammaliancellcultures[J].DevBiolStand.199998:23-37。12MikhailMatrosovich,TatyanaMatrosovich,JackieCarr,etalOverexpressionofthea-2,6-siaIyltransferaseinMDCKcellsincreasesinfluenzavirussensitivitytoneuraminidaseinhibitorsJournalofVirology,Aug.2003Vol.77,No.15p.8418—8425。13NeumannG，WatanabeT,ItoH，etal.GenerationofinfluenzaAvirusesentirelyfromclonedcDNAs.ProcNatlAcadSciUSA199996(16):9345匿50。14OxfordJS,NewmanR,CorcoranT，etal.DirectisolationineggsofinfluenzaA(H1N1)andBviruseswithhaemagglutininsofdifferentantigenicandaminoacidcomposition[J].JGenVirol.199172(Ptl):185-189。15RobertsonJS，BootmanJS，NewmanR,etal.StructuralchangesinthehaemagglutininwhichaccompanyeggadaptationofaninfluenzaA(HINI)vims[J].Viorlogy.1987160(1):31-37。16RobertsonJS.Anoverviewofhostcellselection[J].DevBiolStand.199998:7-11。17RochaEP，XuX,HallHE,etal.Comparisonof10influenzaA(H1N1andH3N2)haemagglutininsequencestothoseofMDCKcellandegggrownviruses[J].JGenVirol.199374(Ptl):2513-2518。18Seo,S.H.，O.Goloubeva,R.Webby,andR.G.Webster.Characterizationofaporcinelungepithelialcelllinesuitableforinfluenzavirusstudies.J.Virol.200175:9517—9525。19ShujiHatakeyama,YukoSakai-Tagawa,MakiKiso,etalEnhancedexpressionofana2，6-linkedsialicacidonMDCKcellsimprovesisolationofhumaninfluenzavirusesandevaluationoftheirsensitivitytoaneuraminidaseinhibitorJournalofClinicalMicrobiology,Aug.2005Vol.43,No.8p.4139-4146。20Tisdale,MMonitoringofviralsusceptibility:newchallengeswiththedevelopmentofinfluenzaNAinhibitors.Rev.Med.Virol.200010:45—55。21Tsuji，S.Molecularcloningandfunctionalanalysisofsialyltransferases.J.Biochem.1996120:1-13。22WangML，KatzJM,WebsterRG.Extensiveheterogeneityinthehemagglutininofegg-growninfluenzavirusesfromdifferentpatients[J].Viorlogy.1989171(1):275畫279。23Zambon,M.,andF.G.Hayden.GlobalNeuraminidaseInhibitorSusceptibilityNetwork.Positionstatement:globalneuraminidaseinhibitorsusceptibilitynetwork.AntiviralRes.200149:147—156。IB083409序列表.ST25序列表〈110〉中閨農業科學院哈爾濱獸醫研究所穩定表達)3-f.乳糖苷。-2,3-啤液酸轉移酶I(ST3GALI)的MDCK細胞系的建立〈130〉IB083409Patent.Inversion3.1〈210>1<211〉1029<212〉麵〈213〉雞〈400〉1atggtgaccgtgcgcaagcgcaacgtgaaggtgttcaccttcgcct.tcgtgctgatcacc60gtgacctccttcctgct.gaactacaagcaccaggtgaccatgaccacctgggaccccaag120cacat,catctCCC3gttCtCcgagcaggtgcgcaagctg3tcaagttcccccgccgcccc180tgct.cctgctcc,3cctgcatctccgagctgggCC3CtC'CCtgtggttcga.CC3gCgC"ttC240tgc.agcccttcctg'acctcccagaacgc('.ctgatc('ccgaggactcctac300cgctggtggc.gggcgagasgcaccctgaag360g3gCt.gttCggC3tC3tCCCcggcgaccgcgaccccctgcaggagcgcggcaccttctcc420tgccgccgct.gcgccgtggtgggcaactccggcaacctgcgccagtcccagtacggccag480gacatcgactcccacgactt,cgtgctgcgcatgaaccgcgCCCCC3CC3tcggctacgag540tccgscgt.gggctccaa.gaccscccaccacttcgtgtsccccgagtcctac犯ggagctg600gCCg3g33Cgtgtccatgatcgtgatccccttcaagaccctggacctgcgctggstcgtg660accgccctgaccaccggcaccatcaacttcacctacgtgcccgtgccccgcaagatcaag720gtgCgC33gggatct.acascccctcctt.catcaagtacgtgt3Cg3g33C780tgg'CtgC3g3accacggccgctacccctcc&ccggcctgctgt,ccgtgatcttcgccctg840C3CgtgtgCgacgaggtgaacgtgtacggcttcggcgccgactcc33gggccactggcac900cactact.gggagaaca.acgcctccgccggcgccttccgccagaccggcgtgcacgacggc960g3CttCg8gttcsacgtgaccctgaccctggCCtCC3tCgagaagstcaagttcttc犯g訓ggCCgCt331029〈210〉2342IB083409序列表.ST25〈212〉PRT<213〉雞2MetValThrValArgLysAi'gAsnValLysValPheThrPhe1510AlaPhe15ValLeulieThrValThrSerPheLeuLeuAsnTyrLysHisGinVal202530ThrMetThrThrTrpAspProLysHislielieSerGinPheSerGlu354045(;nVa]Argl_ysLeuI]el.ysPheProArgArgProCysSerCysSer505560丁hrCysIJeSerGJuLeuG]yHisSerLeuTrpPheAspG]nArgPhe65707580AsnSerThrMetGinProPheLeuThrSerGinAsnAlaLeuliePro859095GluAspSerTyrArgTrpTrpLeuLysLeuGinGlyGluLysSerPro100105110LysAsnlieAsnAspThrLeul>ysGluLeuPheGlylielieProGly115120125AspArgAspProGinG]uArgGlyThrPheSerCysA，'gArgCys130135140AlaValValGlyAsnSerGlyAsnLeuArgGinSerGinTyrGlyGin145150155咖AsplieAspSerHisAspPheValLeuArgMetAsnArgAlaProThr165170175lieG1yTvrGluSerAspValGlvSerLysThrThrHisHisPheVal180185190Tvi-ProGluSerTyrLvsGluLeuAlaGluAsnValSerMetlieVal195200205lieProPheLysThrLeuAspLeuArgTrplieValThrAlaLeuThr210215220ThrGlyThrlieAsnPheThrTyrValProValProArgLyslieLys225230235240ValArgLysGluLys'ValLeulieTvrAsnProSerPhelieLysTyr245250255Val丁yrG)uAsn丁rpLeuGinAsnHisGlyArg丁yrProSerThrGly260265270JB083409;f列表.ST25liePheAlaLeuHisValCvsAspGluValAsnVal280285Tyi'G1yPheG1yAlaAspSerL、'sG1yHisTrpHisHisTYrTrpGlu'290295300AsnAsnAlaSerAlaGlyAlaPheArgGinThrGlyValHisAspGly3053lb315320AspPheGluPheAsnValThrLeuThrLeuAlaSerlieGluUslie325330335UsPhePheUsGlyArg340權利要求1.一種表達ST3GALI的MDCK-ST3GALI細胞系，其含有ST3GALI的編碼基因序列。2.根據權利要求1所述的MDCK-ST3GALI細胞系，其中所述ST3GALI的胺基酸序列如SEQIDNO:2所示。3.根據權利要求1所述的MDCK-ST3GALI細胞系，其中所述編碼ST3GALI的基因序列如SEQIDNO:1所示。4.根據權利要求1-3項任一項所述的MDCK-ST3GALI細胞系，其中在所述編碼ST3GALI的基因序列前加入Kozak序列。5.根據權利要求1所述的MDCK-ST3GALI細胞系，其是保藏號為CGMCCNo.2620的MDCK-ST3GALI細胞系。6.—種構建權利要求1所述的MDCK-ST3GALI細胞系的方法，所述方法包括將編碼ST3GALI的開放閱讀框cDNA序列克隆至MDCK細胞系中。7.權利要求6的方法，其中首先將編碼ST3GALI的開放閱讀框cDNA序列與真核表達載體連接，再將所述真核表達載體轉染到MDCK細胞系中。8.—種提高禽流感病毒生長滴度以及噬斑形成能力的方法，該方法包括，將禽流感病毒毒株接毒於權利要求1-5任一項的MDCK-ST3GALI細胞系中。9.權利要求1-5任一項的MDCK-ST3GALI細胞系用於提高禽流感病毒生長滴度以及噬斑形成能力的應用，用於研究禽流感病毒2,3連接受體傾向性的應用；用於禽流感病毒受體結合特性變異株監測的應用；用於抗禽病毒藥物的篩選的應用；用於中和抗體的測定的應用；用於大規模生產細胞培養疫苗的應用。全文摘要本發明提供一種MDCK-ST3GALI細胞系，具體地本發明提供一株穩定表達β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸轉移酶I(ST3GALI)的MDCK細胞系，其保藏號為CGMCCNo.2620，本發明還提供一種構建所述MDCK-ST3GALI細胞系的方法，以及提高禽流感病毒生長滴度和噬斑形成能力的方法，本發明還提供將所述MDCK-ST3GALI細胞系用於研究禽流感病毒2，3連接受體傾向性的應用；用於禽流感病毒受體結合特性變異株監測的應用；用於抗禽病毒藥物的篩選的應用；用於中和抗體的測定的應用；用於大規模生產細胞培養疫苗的應用。文檔編號C12N5/10GK101613678SQ200910076948公開日2009年12月30日申請日期2009年1月14日優先權日2009年1月14日發明者步志高,陳偉業,陳化蘭申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所