狂犬病街毒株hn10全基因組序列及其製備方法和用途的製作方法

2023-09-16 12:39:05 1

專利名稱：狂犬病街毒株hn10全基因組序列及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及狂犬病街毒序列，具體的說是狂犬病街毒株HNIO全基因組序列，
及其 inj備力法和用途。
背景技術：
狂犬病是死亡率為100%的疾病，對人們的健康構成了很大的威脅，了解狂犬病毒分子流行病學有助於控制狂犬病毒流行，對狂犬病街毒株進行核苷酸的測序並進行分析成為分子流行病學的有力工具。目前，狂犬病街毒株的基因組全長序
列的測定是一個很難的技術，主要是狂犬病毒基因組全長約12kb，鹼基突變的比例較大，在既要保證序列準確性，又要在以儘量很少步驟的情況下得到全長基因組序列，兩者之間一直很難平衡。
針對上述現有技術存在的問題，目前急需一種有效、準確可靠的全基因組測序方法，並通過該方法得到狂犬病街毒全基因組序列。

發明內容
為了改進和彌補現有技術的缺陷，本發明的目的在於提供一種可靠準確的測序方法，並提出該方法測序得到的狂犬病街毒株HN10全基因組序列。
本發明的另一目的在於提出一種所述狂犬病街毒株HN10全基因組序列的用途。
本發明的發明思路為本發明發明人經過長時間的實驗研究，利用分子生物學的方法，對病毒的基因組全長進行了分段，並針對該分段設計了特異性擴增引物，通過對多個狂犬病毒全基因組序列的比對，選擇狂犬病毒保守區域的核苷酸序列進行引物設計，引物3'末端儘可能終止在兼併密碼子較少的胺基酸位置且最後一個鹼基終止在胺基酸密碼子的第二鹼基，共設計24對引物用來擴增狂犬病毒HN10的全基因組，引物擴增片段一般不超過1. lkb;引物設計完成後針對目的基因進行PCR擴增，然後進行測序，最終得到了準確的狂犬病街毒株的全長序列。
為了實現本發明的目的，本發明採用如下具體技術方案狂犬病街毒株HN10全基因組序列，該序列如序列表SEQIDNo.l所示，狂犬病街毒株HNIO的基因組全長包括11923個核苷酸。
上述狂犬病街毒株HN10全基因組序列擴增引物，所述擴增引物如序列表SEQ ID No.2至SEQ ID No.49所示，共24個引物對。
一種製備上述狂犬病街毒株HN10全基因組序列的方法，其具體步驟如下
(1) 病毒的分離；
(2) 病毒RNA的提取；
(3) 病毒RNA的逆轉錄；
(4) 引物合成如SEQ ID No.2至SEQ ID No.49所示，針對所示引物將病毒基因組序列分段，分為24個段；
(5) 利用SEQ IDNo.2至SEQ ID No.49所示引物分別對分段基因序列進行目的基因的PCR擴增；
(6) 目的基因片段的回收；
(7) 目的基因序列測序。
所述步驟(1)病毒RNA的提取具體步驟為取經BHK-21細胞傳至第四代的病毒HNIO，反覆凍融3次；離心，取病毒懸液，先加入0.2ml總RNA提取試劑(TRIzolLS Reagent)勻漿後，再加入0.8ml總RNA提取試劑(TRIzolLSReagent),混勻；-20°(:放置30min，加氯仿，混勻，室溫放置5min，離心；取離心後上層水相，加入與上層水相等體積的異丙醇，混合，室溫放置10min;離心，棄上清，留沉澱，加入75%冰預冷的乙醇，振蕩洗滌，離心，棄上清，室溫乾燥沉澱後將沉澱溶於無核酸酶的超純水中。上述步驟中離心均在4t:下。
所述步驟(2)病毒RNA的逆轉錄具體步驟為將隨機引物稀釋至0.2 u g/ u 1，取33iU總RNA液，65。C水浴10min，取出後立即冰浴，離心，將32 u 1液體轉移至cDNA第一鏈合成試劑(Ready-To-GoYou-Prime First-Strand Beads)反應管中，再向反應管中加入llU隨機引物，使總體積達到33ul，室溫lmin，混勻，離心，37"C水浴60min，即得逆轉錄產物cDNA。
所述步驟(3)病毒基因組序列分段為將步驟(2)病毒逆轉錄產物cDNA分為24個片段，每片段不超過l.lkb。
所述步驟(4) PCR擴增反應體系為H20 34.5ul， 10xPfx擴增緩衝液5ul，10mM dNTPmix 1.5ul， 50mMMgSO4 lul，正向引物Flul，反向引物Rlul，cDNA5ul， PfxDNA聚合酶lul;
PCR循環條件參數先用94°C 2min進行一個循環，然後用94°C 15sec; 50°C30sec; 68°C 40sec進行35個循環，最後再進行一個68°C 10min的延伸。
本發明的用途狂犬病街毒株HN10的全基因組序列確定後，可根據該基因組的序列進行狂犬病毒反向遺傳技術的研究，例如，首先根據全基因組序列設計能將全長基因分割成幾段的酶切位點，然後根據這些酶切位點將全基因組製備成載體(製備載體的方法為本領域技術人員公知內容)，該載體對於某些特殊用途的蛋白有相當大的作用，如，利用狂犬病毒載體的嗜神經特性，將治療老年痴呆症的某些蛋白連上該狂犬病毒載體，狂犬病毒載體將這些蛋白運載到神經組織的特殊位置，發揮作用，從而可有效治療老年痴呆症。可運用模型小鼠(即患老年痴呆症的小鼠)進行這種實驗。
本發明的優點與效益
本發明將病毒基因組序列分為24個片段，用PCR方法擴增相應的cDNA，再利用擴增該片段的引物進行直接測序，在擴增中所用引物是根據狂犬病毒保守區域的核苷酸序列所設計的，引物3'末端儘可能終止在兼併密碼子較少的胺基酸位置，且最後一個鹼基終止在胺基酸密碼子的第二位鹼基。本發明可以有效地擴增出目的片度，提供了全基因序列，有利於了解病毒的分類、進化、致病性及分子流行病學等，本病毒可以作為反向遺傳系統的載體使用，而該病毒序列的測定為病毒載體的構建奠定了基礎，因此，本發明具備潛在的應用前景。
上述內容己經充分的說明了本發明的技術方案和有益效果，下面結合附圖
和具體實施方式
對本發明作進一步敘述，以使公眾對發明內容有更深入的了解，具體實施方式
的實施例均為最佳的技術方案，而並非對本發明的限制。
具體實施例方式
實施例l狂犬病街毒株HN10全基因組序列的製備
(1)病毒的分離
取狂犬病人死後腦組織海馬回部位樣品(樣品來源於湖南省一患狂犬病死亡
的人腦組織，經患者家屬同意)約0.3g，加含青黴素(500U/mL)與鏈黴素(2mg/mL)及2%胎牛血清的PBS (pH7.4)研磨成30%懸液，4°C 2000rpm離心20min，後取上清接種於細胞培養瓶內己形成單層的BHK-21細胞上，2h後補加含2%胎牛血
5清的DMEM液，37°C 5 %C02培養。
(2) 病毒RNA的提取
取經BHK-21細胞傳至第四代的病毒HNIO，反覆凍融3次。4°C 12000r/min 離心10min，取病毒懸液放於1.5ml EP管中，先加入0.2ml TRIzol LS Reagent (Invitrogen公司)勻漿後，再加入0.8mlTRIzo1 LS Reagent。混勻，在-20。C冰箱 中放置30min，加200iU氯仿，快速顛倒充分混勻，室溫放置5min， 4。C離心， 12000rpm離心15min，取離心後上層水相加入新1.5ml EP管中，每管加入與上 清等體積的異丙醇，輕柔混合，室溫放置10min， 4°C12000rpm離心10min，棄 上清，留沉澱，加入lml 75%新配製的冰預冷的乙醇，振蕩洗滌，4°C12000rpm 離心10min，棄上清，室溫乾燥沉澱，後將沉澱溶於70iU無核酸酶的超純水中。
(3) 病毒RNA的逆轉錄
將隨機引物Pd(N)6 (大連寶生物公司)稀釋至0.2wg/ul，將水浴箱預熱至 65°C，吸取33 "1總RNA液加入EP管中，放入65°C中水浴10min，取出後立即 冰浴2min，瞬時離心，將32 u 1液體轉移至Ready-To陽Go You-Prime First-Strand Beads (AMERSHAM公司)反應管中，再向反應管中加入1 u 1隨機引物Pd(N)6 (0.2 " g/ u 1)，使總體積達到33 w 1，室溫lmin，混勻，瞬時離心，37。C水浴60min， 即得逆轉錄產物cDNA。
(4) 病毒基因序列擴增引物的設計與合成 通過對多個狂犬病毒全基因組序列的比對，選擇狂犬病毒保守區域的核苷酸
序列進行引物設計，引物3'末端儘可能終止在兼併密碼子較少的胺基酸位置且 最後一個鹼基終止在胺基酸密碼子的第二鹼基，共設計24對引物用來擴增狂犬 病病毒HN10的全基因組，引物擴增片段一般不超過l.lkb。具體引物序列及其 對應位點如表1所示，SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3為正反引物對，SEQ IDNo.4 和SEQIDNo.5為正反引物對，SEQIDNo.6禾卩SEQIDNo.7為正反引物對，SEQ IDNo.8禾卩SEQIDNo.9為正反引物對，SEQIDNo.lO和SEQIDNo.ll為正反引 物對，SEQIDNo.12和SEQIDNo.13為正反引物對，SEQ ID No. 14和SEQ ID No. 15為正反引物對，SEQ ID No. 16和SEQ ID No. 17為正反引物對，SEQ ID No. 18 和SEQIDNo.l9為正反引物對，SEQIDNo.20和SEQIDNo.21為正反引物對， SEQ ID No.22和SEQ ID No.23為正反引物對，SEQ ID No.24和SEQ ID No.25為正反引物對，SEQ ID No.26和SEQ ID No.27為正反引物對，SEQ ID No.28和SEQ IDNo.29為正反引物對，SEQIDNo.30和SEQIDNo.31為正反引物對，SEQ ID No.32禾P SEQIDNo.33為正反引物對，SEQIDNo.34和SEQ ID No.35為正反引 物對，SEQIDNo.36和SEQIDNo.37為正反引物對，SEQ ID No.38和SEQ ID No.39為正反引物對，SEQ ID No.40和SEQ ID No.41為正反引物對，SEQ ID No.42 和SEQIDNo.43為正反引物對，SEQIDNo.44和SEQ ID No.45為正反引物對， SEQ ID No.46和SEQ ID No.47為正反引物對，SEQ ID No.48和SEQ ID No.49為 正反引物對。引物的位置以狂犬病毒PV株(GenBank登錄號M13215)的基因 組為參考。
表1
片 段 序 號引物名稱a序列(5'-3')位置b擴增 長度 (bp)
1RV1-F RV1-R(SEQ IDNo.2) (SEQIDNo.3)GTACCTAGACGCTTAACAA CGTGACCAACAGCATTTGAT1-992992
2RV2-F RV2-R(SEQ IDNo,4) (SEQ IDNo.5)TTAGTCGGTCTTCTCTTGAGTCTT GGAGGGGTGTTAGTTTTTTTCATG488-14951008
RV3-F RV3-R(SEQ IDNo.6) (SEQ IDNo.7)GTTGGTCACGTGTTCAATCTCATT GGTTTCCTTCTTAAGTTCTCTTCC983-19851003
4RV4-F RV4-R(SEQ IDNo.8) (SEQ IDNo.9)TAACACCCCTCCTTTTGAACCAT GTGGTGTTGCCTGTTTTTTTCAC1485-24871003
RV5-F RV5-R(SEQ ID No.10) (SEQ IDNo.ll)AAACCCCATCAGCTTCTTCT TTGCACTCACTCTTATCTGC1981-2972992
6RV6-F RV6-R(SEQ ID No. 12) (SEQ ID No. 13)AAACAGGCAACACCACTGAT ATCCTTCATCTTCCACAACC2472-34741003
7RV7-F RV7-R(SEQ ID No. 14) (SEQ IDNo.15)CGGAGTGAGTGCAAGACAATGTCAT TTGCTCCCTTTGGATGCTCTCTT2959-39851027
8RV8-F(SEQIDNo.16)CCTGGTTGTGGAAGATGAAGG3452-4448997
7RV8-R (SEQIDNo.n)AAACACCCCGTTCACATGG
9RV9-F (SEQIDNo.18) RV9-R (SEQIDNo.19)AACAGCAGAGGGAAGAGAGCAT GGATGAGATCTTCGGGACTT3951-4934984
10RV10-F (SEQIDNo.20) RV10-R(SEQ ID No.21)AGGCAGATGTCATCCCCAT TCGGATCTACCGGGTCATCAT4415-54511037
11RV1卜F (SEQIDNo.22) RV11-R(SEQ ID No.23)ATCTCATCCCCTTGAGTTGAAG TGGAGAGATACCTTCCAAATGC4926-5913988
12RV12-F (SEQ IDNo.24) RV12-R(SEQ ID No.25)AGGAGAGGTTTATGATGACC ATCGAGTTGACTCACCTTGT5420-64221003
13RV13-F (SEQ IDNo.26) RV13-R(SEQ ID No.27)GACTATGATAAGGCATTTGGAAGG CTAGTCTTGTTCTGGTGAAAGAGT5880-68791000
14RV14-F (SEQ IDNo.28) RV14-R(SEQ ID No.29)TAAAGGACAAGGTGAGTCAACT TCTGGAAAAACTCATGAGTCCT6397-7377981
15RV15-F (SEQIDNo,30) RV15-R(SEQ ID No,31)TAGATGACAAGTCGCACTCTT GAGGTTGACTATTTGGTCGTT684卜78771037
16RV16-F (SEQ IDNo.32) RV16-R(SEQ ID No.33)CTCATGAGTTTTTCCAGAAGTC TTGCATCCTTGAGCAAGATAGT7360-8355996
17RV17-F (SEQ IDNo.34) RV17-R(SEQ ID No.35)CAGAGTCTCTTGCATCTCGAAC GACACTGAGACTCTAGGATTCC7838-88481011
18RV18-F (SEQ IDNo.36) RV18-R(SEQ IDNo.37)TCTTGCTCAAGGATGCAATCAGG TAGAGTCCTTCAGCCTTGTGTCT8338-9336999
19RV19-F (SEQ IDNo.38) RV19-R(SEQ ID No.39)TAGAGTCTCAGTGTCTGTGCTC CAGAGACGGTTCTCTGAGCATT8834-98361003
20RV20-F (SEQ IDNo.40) RV20-R(SEQ lDNo.41)GACTCTACATTTCACTGGCACCTTC AGCAGAGCAAACCCACTCAGAACAT9330-10325996
21RV2卜F (SEQ IDNo.42) RV21-R(SEQ ID No.43)ACATAATGCTCAGAGAACCGT CTGCATCACAAATGATGAGGT9811-10803993
22RV22-F (SEQ IDNo.44) RV22-R(SEQ ID No.45)TGTCTCAGAGCTTGACATAAG CCGTCAATGGTTTAGAGACAT10364-113701007
8RV23-F (SEQ ID No.46 ) CATCATTTGTGATGCAGAAGT
23 10787-11662 876 RV23-R (SEQ ID No,47 ) GTCTTCACTATCTTGTAGATC
RV24-F (SEQ ID No.48 ) AGGGACTCTATCTAAAATGTC
24 11285-11932 639 RV24-R (SEQ ID No.49) TTCTGAGTACACGCTTAACAA
"F"代表正向引物，"R"代表反向引物。引物的位置以狂犬病毒PV株
(GenBank登錄號M13215)的基因組為參考
(5) 目的基因的PCR擴增，將全基因分為24個片段分別擴增並直接測序，引 物和對應擴增位點如表1所示。
PCR擴增反應體系為在0.2ml EP管中加入以下試劑進行PCR反應ddH20 34.5ul， 10 X Pfx Amplification Buffer 5ul， 10mM dNTP mix 1.5ul， 50mM MgS04 lul，正向引物Flul，反向引物Rlul， cDNA5ul， PfxDNAPolymerase (Invitrogen 公司)lul。
PCR用以下程序循環先用94°C 2min進行一個循環，然後用94°C 15sec; 50°C 30sec; 68°C 40sec進行35個循環，最後再進行一個68°C lOmin的延伸。
(6) 目的基因片段的回收
回收基因片段的試劑盒購自QIAgen公司。具體回收方法如下 使用TAE緩衝液製作1 %瓊脂糖凝膠，然後對目的DNA進行瓊脂糖凝膠電 泳。在長波紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的 液體。切碎膠塊。將膠塊放入一無色離心管中，稱其重量(100mg 100tU)。 加3倍膠塊體積的Buffer QG, 5(TC水浴lOmin (或直到膠塊完全溶解)。可以每 隔2-3min震蕩離心管以助溶解。膠塊完全溶解後，混合物應該為黃色(如同沒 溶解膠之前Buffer QG的顏色)，將QIAquick spin column放置於2ml收集管上， 小心將溶液轉移到QIAquick column中，使DNA結合到膜上，13000rpm離心lmin， 棄濾液，將QIAquick column再放回同一收集管中，力卩0.75ml Buffer PE，洗結合 到膜上的DNA。棄濾液，13000rpm再離心lmin，將QIAquick放入乾淨的1.5ml 離心管中，力B 30 ul的洗脫液到QIAquick膜的中心部位，並靜置lmin，然後 13000rpm離心lmin。
(7) 序列測序將所回收的目的基因片段送至北京博邁德科技發展有限公司，
用上述表l中的引物進行分段測序，最後對所測定的序列利用BioEdit生物軟體
9進行序列拼接，利用該軟體對各段序列重疊部分的比對作用，將24個片段首尾
相接，最終得到狂犬病街毒株HN10全基因組序列，如SEQIDNo.l所示。
為了保證測序結果的準確，將每個片段進行了三次獨立的PCR擴增，並將 擴增結果分別送至測序，然後再將這三次的測序結果進行比較，並結合測序峰圖 進行鹼基的校對，這樣儘可能避免了由於鹼基的偶然變異而使序列發生變化。
狂犬病街毒株HN10的全基因組序列確定後，可根據該基因組的序列進行狂 犬病毒反向遺傳技術的研宄。序列表


中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所 狂犬病街毒株HN10全基因組序列及其製備方法和用途
<160〉 49
<170〉 Patentln version 3.3 1 11923 DNA
狂犬病街毒株HN10全基因組序列，人工序列 <400〉 1
acgcttaaca accagatcag agaagaagca gacagtgtca tttgcaaaac aaaaatgtaa 60
cacccctaca atggatgccg acaagattgt attcaaagtc aataatcagg tggtctccct 120
gaagcccgag gttattgtgg atcaatatga atacagatat ccagccatca aagacttgaa 180
gaaacccagt atcactctag ggaaagctcc tgacttaaac aaggcataca agtcagtcct 240
gtctggcatg aatgctgcta agcttgatcc ggatgatgtg tgctcctact tagcagctgc 300
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acgaaaagga gataaaatca cccctgactc tcttgtagac ataaaacgta ctgatgtagg 420
agggaattgg gctctgacgg ggggtatgga gttgacgaga gaccccactg tgtctgagca 480
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agagactgct gttcctcatt cctatttcat ccacttccgt tcactaggcc taagtggaaa 960formula see original document page 12caggatctta cggcatattc ttagatcatt tgatgagata tattctggaa atcacagaat 2760
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爐caataa gaccttgatg gaggctgatg ctcactacaa atcggtccgg acttggaacg 4380
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taatgacgtg ttgccgaagg actaatagag cagaatcgat acaacacagt cttggagaga 4800
cagggaggaa agtgtcggta acctcccaaa gcgggagggt catatcttca tgggagtcat 4860
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agacattgtc atgtggattc ttataacaca agaaatcttc tagcagttcc agtgactaac 5100
ggtgctttta ccctccaaga actgacacca aaggtgatgg acagacctag agatatctca 5160
gacaacgttg tgtttaaaca cagacagaga ttgtggtgag cccccagata ctagactggg 5220
taagagtctg ttaagaaaga atacttgcct cctatgaagg acataagcaa tagatcacca 5280
tcatcttgca tctcagcgaa gtgtgcacaa ttataaaggg ctgggtcatt catgattttc 5340
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tcaccatgat gattgatcca ggagaggttt atgatgaccc ggtagatccg attgagtcag 5460
aggctgaacc cagagggact cccactgtcc ccaacatctt gaggaactcc gactataatc 5520
tcaactctcc tctaatagag gatccggcca aattaatgtt agaatggttg aagacaggaa 5580
atagacctta ccgaatgacc ttgacagaca attgctctag gtcttacaaa gtcctgaagg 5640
attacttcaa gaaggtagat ctgggttccc taaaagtggg tggagccgca gcccagtcaa 5700
tgatctccct ctggttatac ggtgctcact ccgaatcaaa caggagccga aaatgtatga 5760
ctgacttagc ccatttctat tccaagtctt cccccataga gaagctgttg aattgcacac 5820
ttggaaatag agggttaaga atccctccag agggggtgtt aaattgtctt gaaagagttg 5880
actatgataa ggcatttgga aggtatctct ccaacacgta ttcctcttat ctgtttttcc 5940
acgtaattac cctatacatg aatgccctcg actgggagga agagaagacc atcttagctt 6000
tatggaaaga cttgacgtca gttgatgttg ggaaagattt agtcaagttc agagatcaaa 6060
tatggggact cctaattgtg acgaaagact ttgtgtactc tcagagctct aattgtcttt 6120
ttgacaggaa ctatacactt atgctgaaag accttttttt gtctcgtttc aactctctaa 6180
14tgattttgct ttctccccct gagccccggt attcagacga tctgatatcc caactttgcc 6240
aactatacat cgccggagat caagtattgt ctatgtgtgg aaattcgggt tatgaagtca 6300
ttaagatact ggaaccctat gtcgtgaaca gcttagtcca gagggcagaa aagtttaggc 6360
ccctcatcca ctctttaggg gactttcctg tttttataaa ggacaaggtg agtcaactcg 6420
aggggacatt tggtcctagt gcaaaaaggt tttttcgggt attggatcag ttcgacaaca 6480
tacatgatct agtattcgtg tatggctgtt ataggcattg ggggcatcct tatatagatt 6540
atagaaaggg tctgtcaaag ttatatgatc aggttcacat caagaaggtg atagacaagt 6600
cctaccagga gtgtttggcg agcgacctgg cccggaggat ccttaggtgg ggatttgaca 6660
agtactctaa atggtatatt gattcgcgac tcctccccag agaccacccc ttgactcctt 6720
atatcaaaac tcagacatgg ccacccaaac atgtcgtgga tctggtggga gatgcatggc 6780
ataagctccc aatcacacag atatttgaga tccctgagtc aatggatcct tcagaaatac 6840
tagatgacaa gtcgcactct ttcaccagaa caagactagc ttcttggcta tcagagaaca 6900
gaggggggcc tgttcctagt gagaaggtca ttatcacagc tctgtccaag ccgcctgtca 6960
accccaggga gttcttaaaa tctatcgacc tcggagggtt acccgatgaa gacttgataa 7020
ttggcctcaa gccgaaagaa agggagctga agattgaagg tcgattcttt gccttgatgt 7080
cttggaattt gagactgtac ttcgttatca ctgaaaagct cctagctaat tatatcttgc 7140
cactctttga tgcgctgact atgacagaca acctgaacaa ggtgtUaaa aagttgatcg 7200
atcgagtaac cgggcaaggg cttttggact actcaagggt tacatatgct ttccacctgg 7260
actatgagaa gtggaacaat catcaaaggt tagagtcaac agaagatgta ttttctgtcc 7320
tagatcaggt gtttggatta aaaagggtat tctcgaggac tcatgagttt ttccagaagt 7380
cttggatcta ttattcggac agatcagacc tcatcgggct atgggaggac caaatatact 7440
gcttggatat gtctaacggc ccgacctgct ggaatggcca agatggcggg ctggaaggct 7500
tacgacagaa aggctggagt ctggtcagcc tgttaatgat agacagagag tctcagacta 7560
ggaacacaag aaccaagata ctggcgcaag gagacaacca agttctatgt ccaacatata 7620
tgttatcgcc tgggctgtcg agggaggggc ttctttatga actggagagt atatcaagaa 7680
atgccctttc aatataccga gctatcgagg agggagcagc aaagctaggg ctgattatca 7740
agaaggaaga gaccatgtgt agctatgact ttctcatcta cgggaaaact ccattatttc 7800
gaggcaacat cttggtgcct gagtcaaaaa gatgggccag agtctcttgc atctcgaacg 7860accaaatagt caacctcgcc aatataatgt cgacagtgtc caccaacgct ttaactgtgg 7920
cacaacactc tcaatctttg atcaagccga tgagggactt tctgcttatg tcagtgcagg 7980
cagtctttca ctacttgctg ttcagcccca tcttaaaggg tagagtctac aaaattctaa 8040
gtgctgaggg ggacaacttt ctcctagcga tgtcaagaat aatctattta gacccttcct 8100
taggaggagt gtctggaatg tctttgggga gatttcatat acgccagttc tcagaccctg 8160
tctcagaggg gttgtccttc tggagagaga tctggctgag ctctcacgag tcctggattc 8220
acgcgttgtg tcaagaggca gggaaccctg atctcggaga gagaacactc gagagcttca 8280
ctcggcttct cgaggaccct actactttaa atatcaaggg aggggcaagc cccactatct 8340
tgctcaagga tgcaatcagg aaagccctgt atgacgaagt agataaggtg gagaactctg 8400
agttcagaga ggcaatcctc ttgtccaaaa cccataggga taattttata cttttcttga 8460
aatctgttga gcctctattt ccccgatttc tcagtgagct tttcagctcc tccttcttgg 8520
ggattcctga gtcaatcatc ggattgatac aaaactctcg gacaataagg agacagttta 8580
gaaaaagcct ctcaagaact ttggaggagt ctttttacaa ctcagagatc catgggatca 8640
accgaatgac tcagacacct cagcgagttg ggagggtgtg gacctgctcc tcggagaggg 8700
cagatctttt gagggaaatc tcttggggga ggaaagtagt gggtacaaca gttccccacc 8760
cttctgagat gttgggactg cttcctaagt cctccatctc ttgtacttgc ggggcaaccg 8820
gaggagggaa tcctagagtc tcagtgtctg tgctcccgtc ctttgatcag tcattttttt 8880
cacgaggccc tctaaaagga tacttgggat catccacctc catgtcgacc cagctgttcc 8940
atgcctggga gaaggtcacc aatgttcatg tggtgaaaag ggccctctca ctaaaagaat 9000
ccataaactg gttcatcaca agaaactcga atttggctca gactctgatt agaaacatca 9060
tgtctctaac tggccctgat tttcctctag aagaggcccc tgtgttcaag aggacagggt 9120
cagcattgca taggttcaag tccgctagat acagtgaggg gggatattct tctgtatgcc 9180
ccaatctcct ctctcatatc tccgtaagta cagacaccat gtctgatttg acccaagacg 9240
ggaagaacta tgatttcatg ttccagccct tgatgcttta tgcgcagaca tggacctccg 9300
aactggtaca aagagacaca aggctgaagg actctacatt tcactggcac cttcgatgta 9360
acaggtgtgt aaggccaatc gacgatatca cactggagac ctctcaggtc ttcgagtttc 9420
cggatgtgtc gaaaagaata tctaggatgg tctctggggc cgtgcctcac ttccaaaaac 9480
tccctgatat cegcctgaaa cctggagatt ttgaatcttt aagtggtagg gaaaaatccc 9540
gtcacatagg gtctgctcaa gggctcctat attcgatctt ggtcgcaata catgactcag 9600gatacaatga cggaactatc ttccctgtca acatatatgg caaggtctct cctagagact 9660
atttgagggg gctcgcaaga ggagtcctca tagggtcgtc catctgcttt ttgaccagaa 9720
tgactaatat caacattaac aggcctctcg agttgatctc aggcgtgatc tcatatatcc 9780
tcttgaggct ggataatcac ccatctttgt acataatgct cagagaaccg tctctgagag 9840
gagagatatt ttctataccc cagaaaattc cagctgctta cccaaccacg atgagggagg 9900
gtaatagatc tatcctatgt tacctccaac atgtgctgcg ctatgagcga gaggttatta 9960
cagcatctcc agagaatgac tggttgtgga tcttctcaga ctttaggagc tccaagatga 10020
cgtacctaac tctcatcact tatcagtccc atcttctact tcagagggtc gaaagaaatc 10080
tgtcgaagag tatgagagct aacctgcgac agatgagttc cttgatgagg caggtgctag 10140
gagggcatgg agaggacacg ttagagtcag atgatgacat tcaaaggcta ttaaaggact 10200
ctctgcgtag aacgaggtgg gtggatcaag aagtgcgcca tgcagccagg actatgacgg 10260
gggattacag ccccaataaa aagatgtcac gcaaggcggg atgttctgag tgggtttgct 10320
ctgctcagca ggttgcagtc tccacctcgg ctaatccggc ccctgtctca gagcttgaca 10380
taagggccct ctctaggagg tttcagaacc ctctcatctc gggattaaga gtggttcagt 10440
gggcgactgg tgctcattat aaacttaagc caattttgga tgatctcaat gtttttccat 10500
ctttatgtct tgtggtcgga gacggatcag ggggaatatc gagagcagta ctcaacatgt 10560
ttccagatgc taggcttgta ttcaatagct tgttggaggt gaatgacctg atggcctccg 10620
gaacacatcc attacctcct tcagcaatca tgagtggagg agatgacatt gtctccagag 10680
taatagactt cgactcaatc tgggagaaac catcggatct caggaacttg accacatgga 10740
agtacttcca gtcagtccag aggaaggtga acatgtctta tgacctcatc atttgtgatg 10800
cagaagttac tgacatagca tcaattaatc ggataacact gttgatgtct gacttcgcat 10860
tgtctataga tggcccgctg tatttggtct tcaaaactta tgggactatg ctggtaaatc 10920
cagaatatag agcaattcaa cacctgtcaa gggcattccc ttcagtcaca ggatttataa 10980
cccagatgac ttcgtccttc tcatctgagc tataccttcg attctccaaa cggggaaaat 11040
tcttccgaga tgccgagtac ttaacctctt ctacccttcg agagatgagc ctcgtcttgt 11100
tcaactgtag cagccctaag agtgagatgc agagggctcg ctctttgaat taccaagatc 11160
ttgtaagagg attcccagag gagattatat ccaatcctta caatgagatg atcataacct 11220
tgattgacag tgatgtggaa tccttcctgg ttcacaagat ggtagatgat ctcgaattac 11280
aaagagggac tctatctaaa atgtctatca ttatagccat catgatagtt ttctccaata 11340
17gagtctttaa tgtctctaaa ccattgacgg accctttgtt ttatccacca tctgacccca 11400
aaatcttgag gcacttcaac atatgctgca gtacaatgat gtatttggca actgctctag 11460
gtgatgtccc cagctttgct aggcttcatg acttgtacaa tagacccata acttattact 11520
tcaagaagca ggttattcga gggagtattt atctgtcttg gagttggtct gatgatacct 11580
ctgtgttcaa gagggtggca tgcaactcta gcttgagtct gtcgtctcac tggatcaggc 11640
tgatctacaa gatagtgaag accactagac tcatcgggag cattgaagac ttatctggag 11700
aggtggtgag acatcttcaa gggtataaca ggtggattac cctcgaggac atcagatcta 11760
gatcatctct attagactac agctgcttat gagctgaata ttgttgaggc ttgtaaatac 11820
tgaagctctt ggatggtgta ccctgaaaaa aaacaagatc ccaaatcaga acctctggtt 11880
gcttgattgt ttttttcatc tttatggttt atttgttaag cgt 11923
<210〉 2 <211〉 19 DNA <213〉正向引物 2
gtacctagac gcttaac犯 19
3 20 DNA <213〉反向引物 3
cgtgaccaac agcatttgat 20
<210〉 4
24
<212〉 DNA
正向引物
18formula see original document page 19taacacccct ccttttgaac cat 23
9 23 DNA 反向引物 9
gtggtgttgc ctgttttttt cac 23
10 20 <212〉 DNA <213〉正向引物 10
咖ccccatc agcttcttct 20
11 <211〉 20 DNA <213〉反向引物 <400〉 11 ttgcactcac tcttatctg
20
<210〉 12 <211〉 20 DNA 正向引物 12
aa3c3ggc3a caccsctgat 20 13 <211〉 20 DNA 反向引物 13
atccttcatc ttccacaacc 20
14 25 DNA <213〉正向引物 14
cggagtgagt gcaagacaat gtcat 25
15 23 DNA 反向引物 15
ttgctccctt tggatgctct ctt 23
16 21 <212〉 DNA 正向引物 16
cctggttgtg gaagatgaag g 21
21 17 19 DNA 反向引物 17
aaacaccccg ttcacatgg 19
18 22 DNA 正向引物 18
aacagcagag ggaagagagc at 22
<210〉 19 20 DNA 反向引物 19
ggatgagatc ttcgggactt 20
20 <211〉 19 DNA 正向引物 20
aggcagatgt catccccat 19 <210〉 21
22 21 DNA 反向引物 21
tcggatctac cgggtcatca t 21
22 22 DNA 正向引物 22
atctcatccc cttgagttga ag 22
<210〉 23 22 DNA <213〉反向引物 23
tggagagata ccttccaaat gc 22
24 <211〉 20 DNA 正向引物 <400〉 24
aggagaggtt tatgatgacc 20
25 <211〉 20
23 DNA 反向引物 <400〉 25
atcgagttga ctcaccttgt 20
26 24 DNA 正向引物 26
gactatgata aggcatttgg aagg 24
27 24 DNA 反向引物 27
ctagtcttgt tctggtgaaa gagt 24
<210〉 28 22 DNA <213〉 正向引物 <400〉 28
taaaggacaa ggtgagtcaa ct 22
<210〉 29 22 DNA
24反向引物
29
tctggaaaaa ctcatgagtc ct 22
30 21 DNA 正向引物 30
t卿tgacaa gtcgC3ctct t 21
31 21 <212〉 DNA 反向引物 <400〉 31
gaggttgact atttggtcgt t 21
32 22 DNA 正向引物 32
ctcatgagtt tttccagaag tc 22
<210〉 33 22 DNA 反向引物 33
ttgcatcctt gagcaagata gt 22
<210〉 34 22 DNA 正向引物 34
cagagtctct tgcatctcga ac 22
<210〉 35 22 DNA 反向引物 <400〉 35
gacactgaga ctctaggatt cc 22
36 <211〉 23 <212〉 DNA 正向引物 <400〉 36
tcttgctcaa ggatgcaatc agg 23
37 23 DNA 反向引物 37tagagtcctt cagccttgtg tct 23
38 <211〉 22 DNA <213〉 正向引物 38
tagagtctca gtgtctgtgc tc 22
39 <211〉 22 DNA <213〉反向引物 39
cagagacggt tctctgagca tt 22
40 25 DNA 正向引物 40
gactctacat ttcactggca ccttc 25
41 25 DNA 反向引物 41
agcagagcaa acccactcag aacat 25
27<210〉 42 21 DNA 正向引物 42
acataatgct cagagaaccg t 21
43 21 DNA 反向引物 43
ctgcatcaca aatgatgagg t 21
44 21 DNA 正向引物 44
tgtctcagag cttgacataa g 21
45 21 DNA 反向引物 45
ccgtcaatgg tttagagaca t 21formula see original document page 29
權利要求
1、一種狂犬病街毒株HN10全基因組序列，其特徵在於，該序列如SEQ ID No.1所示。
2、 權利要求1所述狂犬病街毒株HN10全基因組序列擴增引物，其特徵在於， 所述擴增引物如SEQ ID No.2至SEQ ID No.49所示，共24個引物對。
3、 一種製備狂犬病街毒株HN10全基因組序列的方法，其特徵在於，引物合成 如SEQ ID No.2至SEQ ID No.49所示，針對所示引物將病毒基因組序列分為 24段；利用SEQIDNo,2至SEQIDNo.49所示引物分別對分段基因序列進行 目的基因的PCR擴增；目的基因片段的回收，測序；對所測定的序列利用生 物軟體對各段序列重疊部分的比對作用進行序列拼接，將24個片段首尾相接， 最終得到狂犬病街毒株HN10全基因組序列，如SEQ ID No.l所示。
4、 根據權利要求3所述的一種製備狂犬病街毒株HN10全基因組序列的方法， 其特徵在於，所述病毒基因組序列分段為根據SEQ ID No.2至SEQIDNo.24 所示引物將病毒逆轉錄產物cDNA分為24個片段，每片段不超過l.lkb。
5、 根據權利要求3所述的一種製備狂犬病街毒株HNIO全基因組序列的方法， 其特徵在於，所述步驟PCR擴增反應體系為H20 34.5ul， 10xPfx擴增緩 衝液5ul， 10mM dNTPmix 1.5ul， 50mMMgSO4 lul，正向引物Flul，反 向引物Rlul， cDNA5ul， PficDNA聚合酶lul;PCR循環條件參數先用94°C 2min進行一個循環，然後用94°C 15sec; 50°C 30sec; 68°C 40sec進行35個循環，最後再進行一個68°C lOmin的延伸。
全文摘要
本發明公開了狂犬病街毒株HN10全基因組序列，該序列如SEQ ID No.1所示。還提供了該全基因組序列擴增引物，如SEQ ID No.2至SEQ ID No.49所示。本發明將病毒基因組序列分為24個片段，用PCR方法擴增相應cDNA，利用片段引物進行直接測序，所用引物根據狂犬病毒的保守區域核苷酸序列所設計，引物3』末端儘可能終止在兼併密碼子較少的胺基酸位置，且最後一個鹼基終止在胺基酸密碼子第二位鹼基。本發明有效地擴增出目的片度，提供了全基因序列，有利於了解病毒的分類、進化、致病性及分子流行病學等，該病毒有可能作為反向遺傳系統載體使用，而該病毒序列的測定為病毒載體的構建奠定了基礎。
文檔編號C12N15/47GK101463355SQ20091007711
公開日2009年6月24日 申請日期2009年1月15日 優先權日2009年1月15日
發明者青 唐, 浩 李 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所