產生小麥蛋白水解物的方法
2023-09-16 12:34:40
專利名稱:產生小麥蛋白水解物的方法
產生小麥蛋白水解物的方法涉及序列表本申請含有計算機可讀形式的序列表,所述計算機可讀形式通過提述併入本文。 發明領域本發明涉及使用微生物內肽酶產生小麥蛋白水解物的方法。
背景技術:
小麥蛋白水解物傳統上用作食物添加劑,現在已經在全球用於烹調,例如,用於香 味形成(flavour formation) 0小麥蛋白水解物還用於(例如,在運動飲料中)蛋白質強 化(protein fortification),這是因為小麥蛋白與例如大豆蛋白相比,提供更高水平的谷 氨醯胺,以及用於其他膳食飲料(dietary drink)、幹混飲料(dry blended beaverage), 營養條(nutritional bar)等中。小麥蛋白水解物可使用蛋白水解酶水解小麥蛋白來制 備。在小麥蛋白水解物的工業製備中,所述水解蛋白的高溶解度或可懸浮性無論從加工的 角度,從單純產量/經濟(yield/economical)的角度而言,還是口感和感覺特點(sensory attribute)而言都是重要的。因此,對本發明人來說一個目的是鑑定對於製備具有高溶解 度的小麥蛋白水解物有用的蛋白水解酶。之前已經描述了發現可適用於本發明的內肽酶。例如,來源於擬諾卡氏菌屬 (Nocardiopsis)菌種NRRL 18262的內肽酶公開於WO 88/03947 (其中,該菌株稱為擬諾 卡氏菌屬菌種菌株10R)以及WO 01/58276。其他相關的根據本發明有用的內肽酶公開於 W088/03947、W004/111220、W004/111222、W004/111223、W005/123911 和 W004/072279。
發明內容
本發明人鑑定了下述內肽酶,其被發現適用於製備具有高溶解度並得到均一懸浮 物的小麥蛋白水解物。所述內肽酶與本領域使用的其他內肽酶相比,當以等量的酶蛋白相 比時更加有效,這導致小麥蛋白水解物生產者的產物更經濟。因此,本發明涉及產生小麥蛋 白水解物的方法,包括a)將與SEQ ID NO 1具有至少50%同一性的內肽酶添加至包含小 麥蛋白的組合物;和b)溫育以水解所述小麥蛋白。發明詳述內肽酶本文中所使用的術語內肽酶是水解內肽鍵(internal peptide bond)的酶(具有 內肽酶活性)。對於根據本發明使用的內肽酶的來源並無限制。因此,術語內肽酶不僅包括天然 或野生型的內肽酶,還包括其顯示內肽酶活性的任何突變體、變體、片段等,以及合成的內 肽酶,如經改組的內肽酶。可如本領域所公知的製備經遺傳工程改造的內肽酶變體,例如, 通過定點誘變,通過PCR (使用包含所需突變的PCR片段作為所述PCR反應中的引物之一), 或通過隨機誘變。內肽酶變體的實例,如用於本上下文中,是其中一個或多個胺基酸被缺 失、插入或以其他胺基酸取代的內肽酶。
根據本發明使用的內肽酶的實例是(i)來源於擬諾卡氏菌屬菌種NRRL 18262的內肽酶,其公開於W001/58276,其序 列如本申請文件的SEQ ID NO 1所示;(ii)與⑴的內肽酶具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90或至少95%胺基酸 同一性的內肽酶;(iii)⑴或(ii)的內肽酶的顯示內肽酶活性的突變體、變體或片段。就本發明而言,兩個胺基酸序列的比對可以通過使用EMBOSS程序包(http:// emboss, org)版本 2. 8. 0 的 Needle 程序來確定。Needle 程序執行 Needleman,S. B.和 Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48,443-453 中描述的全局比對算法(global alignment algorithm)。使用的取代矩陣是 BL0SUM62,缺口產生罰分(gap opening penalty)是 10, 並且缺口延伸罰分(gap extension penalty)是 0· 5。兩個胺基酸序列之間的同一性程度這樣計算,用兩個序列的比對中的精確匹配的 數目除以兩個序列中最短序列的長度。結果以同一性百分比表示。當兩個序列在重疊的相同位置具有相同的胺基酸殘基時,出現精確匹配。序列的 長度為序列中的胺基酸殘基的數目(例如SEQ ID NO :1的長度是188)。作為可適用於本發明的細菌內肽酶的實例,還可提及的是W088/03947中 公開的來自白擬諾卡氏菌(Nocardiopsis alba)(先前為達松維爾擬諾卡氏菌 (Nocardiopsis dassonvillei)NRRL 18133的內肽酶;來自達松維爾擬諾卡氏菌達松維 爾亞種(Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei)DSM 43235、白擬諾卡氏菌 DSM 15647、擬諾卡氏菌屬菌種DSM 164M的內肽酶和合成的蛋白酶22,全部四種公開於 W004/111220 中;W004/111222 中公開的來自蔥綠擬諾卡氏菌(Nocardiopsis prasina) DSM 15648的內肽酶;W004/111223中公開的來自蔥綠擬諾卡氏菌DSM 15649的內肽酶; 來自蔥綠擬諾卡氏菌(先前為白擬諾卡氏菌)DSM 14010、嗜鹼擬諾卡氏菌(Nocardiopsis alkaliphila)DSM44657 和盧森坦擬諾卡氏菌(Nocardiopsis lucentensis)DSM 44048 的 內肽酶,全部三種公開於 W005/123911 中;來自 Brachysporiella gayana CGMCC 0865、綠 僵菌(Metarhizium anisopliae)、粘帚酶屬菌種(Gliocladium sp.)CBS 114001、黑團孢 屬菌種(Periconia sp.)CBS 114002、黑團孢屬菌種 CBS 114000 和新月彎孢(Curvularia lunata)CBS 114003的內肽酶,全部六種公開於W004/072279中;以及這些顯示內肽酶活性 的突變體、變體或片段。根據本發明使用的內肽酶是微生物內肽酶,優選細菌內肽酶,術語「細菌的 (bacterial) 」表明所述內肽酶衍生自或起源於細菌,或是源自細菌的類似物、片段、變體、 突變體或合成內肽酶。其可在原始野生型細菌菌株中、在另一微生物菌株中或在植物中產 生或表達;即所述術語涵蓋野生型、天然存在的內肽酶的表達,以及重組內肽酶、遺傳工程 內肽酶或合成內肽酶在任何宿主中的表達。在本發明的方法中,內肽酶可以是純化的。術語「純化的」用於本文包括富集了 所述酶蛋白的酶蛋白製備物。上述富集可為,例如,去除了產生胞外酶蛋白的生物的細胞, 通過蛋白質特異性沉澱去除非蛋白物質,或使用色譜法,其中所述酶蛋白被選擇性吸附並 從色譜基質中洗脫。所述內肽酶可經純化至這樣的程度使得僅僅存在少量的其他蛋白 質。表述「其他蛋白質」具體而言指其他酶。用於本發明方法的內肽酶可為「基本上純的(essentially pure) 」,S卩,基本上不含來自產生它的生物的其他組分,所述生物可為天然 存在的微生物,或經遺傳修飾的供重組產生所述內肽酶的宿主微生物。然而,對於本發明的使用,內肽酶不需要那麼純。其可以(例如)包括其他酶,甚 至其他內肽酶。在一個優選方面,用於本發明方法的內肽酶經純化以含有總蛋白質中至少20%、 優選至少30%、至少40%或至少50% (w/w)的所述內肽酶。內肽酶的量可由製備物活性測 量值除以所述內肽酶的比活性(活性/mg EP)來計算,或可通過SDS-PAGE或本領域已知的 任何其他方法來量化。總蛋白質的量可(例如)通過胺基酸分析來測定。本發明的內肽酶的使用可以與其他酶(例如其他蛋白酶)的使用組合。在一個優 選的實施方案中,將內肽酶,例如源自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL 18262的內肽酶,與外肽酶 組合,或與具有外肽酶活性的蛋白酶製備物組合,例如源自米麴黴(Aspergillus oryzae) 的蛋白Bl製備物,如 W094/25580 中所述,如 Flavourzyme (Novozymes A/S, Denmark)。在一個具體實施方案中,當通過對酪蛋白的水解和後續的TCA可溶性肽與鄰苯二 醛(o-phthaldialdehyde)及2_巰基乙醇的反應,然後測量所得複合物在340nm的吸光度 來進行測定時,用於本發明的內肽酶具有接近中性的PH-活性最優值(最適pH)。術語pH活性最優值接近中性可意為所述內肽酶具有PH 5.5-11,優選pH7_l 1,更 優選PH 8-11,甚至更優選pH 9.5-10.5的區間中,且最優選在大約pH 10的最適pH。在另一具體實施方案中,用於本發明的內肽酶是熱穩定的。術語熱穩定的可意為,當如上所述通過酪蛋白水解進行測定時,在pH 9的最適溫 度為至少50°C或至少55°C,優選至少60°C,更優選至少65°C,且甚至更優選至少67 V,如約 70 "C。小麥蛋白水解物用於本發明方法的小麥蛋白應理解為可從小麥獲得的蛋白質,如從小麥分離的蛋 白質。所述小麥蛋白可包含完整的小麥蛋白或可包含部分水解的小麥蛋白。多種小麥蛋白物質可用於本發明的方法。一般而言,所用的小麥蛋白物質可根據 本領域已知的方法從小麥獲得。在一個實施方案中,所述小麥蛋白物質可為小麥粉,其具有 總乾物質10-15%的蛋白質含量,例如,總乾物質約13%的蛋白質含量。在另一個實施方 案中,所述小麥蛋白物質可經進一步純化,例如,通過用水洗滌小麥粉麵團直至澱粉溶解, 使得不溶性的谷蛋白或麵筋(gluten)作為粘性物質(gummy mass)留下,對其進行進一步 加工。所述小麥蛋白物質可為,例如,小麥蛋白濃縮物(concentrate)或小麥蛋白分離物 (isolate),也稱為小麥谷蛋白濃縮物或小麥谷蛋白分離物。其可具有多於50%,如多於 60%、70%、80%或90%的蛋白質含量。所述小麥蛋白物質可經預處理,如通過加熱或用例如酸、鹼或氯化學處理進行。在本發明方法中,所述小麥蛋白物質通常在水中混合或分散以形成漿料,所述漿 料包含按重量計約到約25%的蛋白質。在一個實施方案中,所述漿料可包含按重量計 約到約5%的蛋白質。在另一個實施方案中,所述漿料可包含按重量計約6%到約10% 的蛋白質。在另一個實施方案中,所述漿料可包含按重量計約11%到約15%的蛋白質。在 又一個實施方案中,所述漿料可包含按重量計約16%到約20%的蛋白質。在又一個實施方案中,所述漿料可包含按重量計約21%到約25%的蛋白質。在一個優選實施方案中,所述 漿料可包含按重量計約5%到約25%的蛋白質。在將所述蛋白質物質分散於水中後,可調整所述蛋白質漿料的pH和/或溫度從而 優化水解反應,特別是保證用於所述水解反應的內肽酶的功能接近其最優活性水平。所述 蛋白質漿料的PH可根據本領域公知的方法進行調整和監測。所述蛋白質漿料的pH可調整 至約5到約10。在一個實施方案中,所述蛋白質漿料的pH可調整至約6到約9。在一個優選 實施方案中,所述蛋白質漿料的PH可調整至約6. 5到約8。所述蛋白質漿料的pH可在水解 反應過程中保持在上述水平,或可允許隨著水解反應的進行而減少。在水解反應過程中根 據本領域公知的方法將所述蛋白質漿料的溫度優選地調整並維持在約45°C到約70°C。在 一個優選實施方案中,在水解反應過程中可將所述蛋白質漿料的溫度調整並維持在約63°C 到約70°C。一般而言,高於該範圍的溫度可能使所述內肽酶失活,而低於或高於該範圍的溫 度會降低(slow)所述內肽酶的活性。所述水解反應通常通過將所述內肽酶添加到蛋白質物質的漿料來起始。或者,所 述酶可分散於水中,並一邊攪拌一邊緩慢添加所述蛋白質物質。在製備濃縮的蛋白質漿料 以避免粘度過高時,後一方法可為有利的。優選地,用於本發明方法的內肽酶的量是每kg小麥蛋白約0. 005到約100AU(定 義如下),優選每kg小麥蛋白約0. 01到約50AU,更優選每kg小麥蛋白約0. 02到約30AU。一個Anson單位(AU)定義為在標準條件下(S卩,25°C,pH7. 5和10分鐘反應時間) 以下述初始速率消化血紅蛋白的酶量,所述速率使得每分鐘釋放的TCA可溶性產物的量與 一毫當量的酪氨酸在與酚試劑作用時得到相同的顏色。當確定AU活性時,血紅蛋白的濃度 可優選為約1.3%。添加至蛋白質物質的內肽酶的量能夠且會依賴於所述蛋白質物質的來源、所需的 水解程度和水解反應的持續時間而變化。內肽酶的量的範圍可為每千克小麥蛋白約Img酶 蛋白到約5000mg酶蛋白。在一個優選實施方案中,所述量的範圍可為每千克小麥蛋白約 Img酶蛋白到約IOOOmg酶蛋白。在另一個優選實施方案中,所述量的範圍可為每千克小麥 蛋白約5mg酶蛋白到約500mg酶蛋白。如本領域技術人員所理解的,水解反應的持續時間能夠且會變化。一般而言,水解 反應的持續時間的範圍可為幾分鐘到許多小時,如約30分鐘到約48小時。優選地,用內肽酶處理導致具有約0. 到約10%,更優選約0. 1<%到約6%,或約 0. 5%到約5%,甚至更優選約0. 5%到約3%的水解度(DH)的小麥蛋白水解物。水解度(DH)表示通過所述方法獲得的蛋白質水解的程度。在本發明的上下文中, 水解度(DH)定義如下DH=(被切割的肽鍵的數目/肽鍵總數)x 100%本領域技術人員會知道如何測量DH。其可,例如,使用如Adler-Nissen,J.,1986, Enzymatic Hydrolysis of Food Proteins,第 5 章,第 122-1M 頁所述的方法進行。在完成步驟b)之後,可將所述內肽酶失活。上述失活可通過本領域已知的任何方 法進行,例如,通過加熱到至少75°C,如至少80°C或至少85°C。在一個實施方案中,本發明方法進一步包括用一種或多種另外的具有蛋白酶活性 的酶處理所述小麥蛋白組合物。上述另外的蛋白水解酶可為一種或多種內肽酶和/或一種或多種外肽酶。所述一種或多種外肽酶可為,例如,一種或多種氨肽酶和/或一種或多種羧 肽酶。用具有與SEQ ID NO=I至少50%的同一性的內肽酶進行溫育,且用一種或多種另 外的具有蛋白酶活性的酶進行溫育可不同時進行。即,如果所述蛋白水解酶並不在相同的 PH和/或相同的溫度起作用,則可將所述小麥蛋白組合物先與一種(或多種)蛋白水解酶 溫育,然後是任選地調整PH和/或溫度和隨後與其他蛋白水解酶溫育。當使用一種或多種另外的具有蛋白酶活性的酶時,所得的小麥蛋白水解物可具有 高於上面所示的水解度(DH)。其可,例如,具有約5-25%的水解度。在本發明方法的另一個實施方案中,對所述小麥蛋白物質可除了用具有蛋白酶活 性的酶以外用其他酶進行處理。上述另外的酶處理可以在所述蛋白酶處理之前、同時或之 後進行,且所述另外的酶可為一種或多種來自包含如下的組的酶澱粉酶、肌醇六磷酸酶 (phytase)、纖維素酶、半纖維素酶、磷脂酶、脂肪酶和木聚糖酶。上述其他的酶可用於向所 述小麥蛋白水解物提供不由所述水解物中的蛋白質和/或肽所指定的特性(to provide properties to the wheat protein hydrolysate which are not dictated by the protein and/or peptides in the hydrolysate)。由本發明方法獲得的小麥蛋白水解物可用於食品,例如,飲料。根據本發明的食品 可為任何意欲供人食用的產物。上述食品的非限制性實例包括營養條、幹混飲料、運動飲料 和能量飲料(energy drink)。通過本發明方法獲得的小麥蛋白水解物還可用於臨床營養 (clinical nutrition),例如,在醫院中。實施例實施例1用來自擬諾卡氏菌屬菌種NRRL18262具有SEQ ID NO :1所示的序列的內肽酶和 Alcalase 2. 4L(NovozymesA/S Denmark) /K解小麥蛋白的比較。用蛋白酶水解蛋白質製備來自Tate & Lyle的活性小麥谷蛋白(vital wheat gluten),75 %蛋白質 15g+^5g 水。將所述小麥蛋白產物用脫礦物質水(demineralised water) (Milli Q)懸浮為5% w/V懸液。將所述蛋白質在磁攪拌器上緩慢添加至Milli Q水(室溫)中。調整rpm以避 免產生泡沫。將所述蛋白質溶液分散15-30分鐘。pH 調整將pH用4N NaOH調整為8. 0,並在水解反應過程中保持。酶劑量將所述擬諾卡氏菌屬蛋白酶以10、50、100和300mg酶蛋白(印)/kg蛋白質劑量添 加,並將Alcalase 2.4L以10、50和IOOmg酶蛋白(印)/kg蛋白質劑量添加。在操作時將 酶儲存於冰上。酶處理溫度60°C+/_1°C
時間120分鐘在磁攪拌器上在水浴中將酶添加至所述小麥蛋白。當蛋白質溶液中的溫度達到 60°C時添加酶。熱失活/儲存在酶處理後,立刻將試樣在85 在振蕩水浴中熱處理15分鐘。將試樣在冰上冷 卻,並冷藏於4°C過夜。在4°C溫育過夜後,評價溶解度和水解度。溶解度使用Leco FP 5 蛋白質/氮分析儀測量溶解度,其通過燃燒法(combustion method)測量蛋白質和氮含量。所述氮含量在可溶性級分中測定,且將溶解度計算為總乾物 質含量中氮含量的百分比。水解度如 Adler-Nissen, J. ,1986,Enzymatic Hydrolysis of Food Proteins,第 5 章, 第122-124頁所述通過pH恆定法(pH stat)來測量所述懸液的水解度。結果水解度
權利要求
1.一種產生小麥蛋白水解物的方法,包括a)向包含小麥蛋白的組合物添加與SEQID NO :1具有至少50%同一性的內肽酶;和b)溫育以水解所述小麥蛋白。
2.權利要求1的方法,其中所述內肽酶與SEQID NO 1具有至少60%的同一性。
3.權利要求1的方法,其中所述內肽酶與SEQID NO 1具有至少80%的同一性。
4.前述任一項權利要求的方法,其中所述內肽酶的最適pH為pH9.5至?!1 10.5。
5.前述任一項權利要求的方法,其中在pH9時所述內肽酶的最適溫度為至少60°C。
6.前述任一項權利要求的方法,其中所述內肽酶來自擬諾卡氏菌屬。
7.前述任一項權利要求的方法,其中所述內肽酶以每千克小麥蛋白1到IOOOmg酶蛋白 的濃度添加。
8.前述任一項權利要求的方法,其中所述內肽酶以每千克小麥蛋白0.01到50AU的活 性添加。
9.前述任一項權利要求的方法,其中所述組合物包含約5%到約25%小麥蛋白。
10.前述任一項權利要求的方法,其進一步包括用一種或多種另外的具有蛋白酶活性 的酶處理所述小麥蛋白組合物。
11.前述任一項權利要求的方法,其進一步包括用一種或多種外肽酶處理所述小麥蛋 白組合物。
12.前述任一項權利要求的方法,其進一步包括用一種或多種來自包含下述酶的組的 酶處理所述小麥蛋白組合物澱粉酶、植酸酶、纖維素酶、半纖維素酶、磷脂酶、脂肪酶和木 聚糖酶。
13.一種由前述任一項權利要求的方法產生的小麥蛋白水解物。
14.由權利要求1-12任一項所述的方法產生的小麥蛋白水解物在食品中的用途。
全文摘要
本發明涉及使用微生物內肽酶產生小麥蛋白水解物的方法。
文檔編號A23J3/34GK102046022SQ200980118942
公開日2011年5月4日 申請日期2009年5月29日 優先權日2008年6月3日
發明者吉特·B·林格裡夫, 珀·M·尼爾森 申請人:諾維信公司