一種製備偽狂犬病病毒的方法

2023-09-16 12:46:35

專利名稱：一種製備偽狂犬病病毒的方法
技術領域：
本發明涉及一種偽狂犬病病毒的生產方法，更具體地說，本發明涉及一種利用哺 乳動物細胞在潮汐式生物反應器的載體罐中大規模生產偽狂犬病病毒的方法。
背景技術：
偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是多種動物共患的傳染病，引起家畜和野生動物急 性致死性的傳染病，以發熱、奇癢和腦脊髓炎為主要症狀，豬是其自然易感宿主，主要引起 妊娠母豬流產、死胎和木乃伊胎，仔豬感染主要是神經症狀，成年豬則以隱性感染為主，該 病已成為種豬繁殖障礙綜合症的主要病因。疫苗免疫是防制偽狂犬病的根本措施，現在用 得較多的是滅活苗、弱毒疫苗和基因缺失苗。弱毒苗和滅活苗在預防控制偽狂犬病方面雖 然能起一定的作用，但弱毒活疫苗有返強和散毒的危險，滅活疫苗雖然安全性較好，但其免 疫效率卻較低，劑量大，有副作用，而且不能提供血清學標誌進行鑑別診斷。基因缺失疫苗 免疫原性強、持久穩定，安全性好無致癌性、接種方便安全，還能提供血清學標誌的鑑別標 志。遺憾的是目前三種疫苗的生產主要依靠轉瓶生產，甚至仍在利用雞胚成纖維原代細胞 進行生產。傳統的轉瓶培養模式具有結構簡單，投資少，技術成熟，放大只需簡單的增加轉瓶 數量等優點。但也有其缺點(1)作坊式生產，勞動強度大，佔地空間大，單位體積提供細胞 生長的表面積小；(2)細胞生長密度低，產量低；(3)收穫病毒液後，後續混合，存在批間差， 均一性不好；(4)培養時各項監測和控制環境條件受到限制等。另外，因雞胚原材料的差異 導致雞胚成纖維原代細胞批間差異較大，造成偽狂犬病毒滴度不高，批間差異大，給疫苗的 產量和效力的提高帶來困難。因此，本領域中仍迫切需要能夠進一步改善生產病毒疫苗的 方法。豬偽狂犬病毒具有廣泛嗜性，除了能在雞胚成纖維原代細胞增殖，還能在多種組 織細胞上增殖。但對不同的細胞具有不同的敏感性。中國專利CN101695572A公開了利用豬 睪丸細胞系ST、豬腎細胞系PK15或豬腎IBRS-2大規模生產偽狂犬活疫苗的方法。該發明 提到了三種傳代細胞用來培養偽狂犬病毒豬睪丸細胞系ST、豬腎細胞系PK15和IBRS-2， 其中PK15細胞極易受豬圓環病毒I型的持續汙染，目前國內難以找到未受汙染的細胞株， 顯然這存在著很大的安全隱患，特別是用來生產活疫苗，所以，至今國內未有利用PK15細 胞培養病毒進而生產活疫苗的行政許可。偽狂犬病毒在ST細胞上增殖要比PK15慢(郝 鵬等.PK15、ST細胞增殖偽狂犬弱毒效果的比較.首屆中國獸藥大會-獸醫生物製品學、 獸醫微生物學學術論壇論文集(2008). 339-340)，目前也有大量使用IBRS細胞進行偽狂犬 病毒培養的報導，病毒增殖後的滴度也未降低，但IBRS細胞分裂增殖慢(見網址http:// biology, dctt. net/showarticle. asp ？ articleid = 26989)，幾乎比 Vero 細胞慢一倍，這 大大提高了生產成本，降低了生產效率。Vero細胞經過全面的研究鑑定，Vero細胞具有遺 傳學穩定，沒有外源因子汙染和無致瘤性的優點，完全符合世界衛生組織(WHO)關於用於 生物製品的傳代細胞的規程要求，已被WHO批准可用做疫苗生產基質。本發明採用Vero細
4胞可以解決目前生產偽狂犬病毒使用的上述傳代細胞存在的問題。另外BHK-21細胞和MDBK細胞也可用來繁殖偽狂犬病毒，目前有利用Vero、 BHK-21、MDBK細胞增殖偽狂犬病毒的報導(王巖等，PK15、Vero、BHK、CEF細胞增殖豬偽狂 犬病病毒的比較，安徽農業科學，2007，35 (18) =5432,5445 ；王樹成等，用PK15、Vero、MDBK 三種細胞增殖偽狂犬病病毒的比較，畜牧與獸醫，1996，28 (2) 80)，這些報導僅是關於實驗 室階段利用細胞瓶進行偽狂犬病毒增殖的相關研究，不能直接放大，更不能達到工業化生 產的要求。國內外有利用Vero細胞生產乙腦病毒疫苗和狂犬疫苗的專利和報導。至今未 見把Vero細胞、MDBK細胞、BHK-21細胞等傳代細胞利用生物反應器進行進行偽狂犬病毒大 規模生產的報導。中國專利CNlO 1695572A公開了大規模生產偽狂犬活疫苗的方法，採用的是 TideCell潮汐式生物反應器，Batch式培養。本發明也採用潮汐式生物反應器，但採用了更 有生物安全保障的細胞，並採用Fed-Batch式培養，通過優化參數實現高滴度多次收穫病 毒液，大大提高了病毒的產量，進而在製備疫苗的後工藝中，不但提高了疫苗產量，也可大 量減少殘餘細胞宿主蛋白、殘餘細胞DNA、殘餘牛血清等異源物質的含量，進一步提高了疫 苗接種的安全性，也更能夠符合WHO《使用動物細胞生產生物製品規程》的要求和市場需求。

發明內容
本發明試圖提供一種偽狂犬病病毒的大規模生產方法，它既能解決傳統的轉瓶培 養模式在病毒生產中存在的病毒產量低，病毒滴度不高，批間差異大的缺點，又能消除現有 潮汐式生產方法中所生產的病毒在後續生產活疫苗時存在的安全隱患，並通過優化參數實 現了高滴度多次收穫病毒液，大大提高了病毒的產量。因此，本發明提供了一種偽狂犬病病毒的大規模生產方法，其特徵在於，包括如下 步驟1)細胞的接種將哺乳動物細胞接種到潮汐式生物反應器載體罐(8)內添加的載 體(9)上，進行細胞的吸附培養；2)在細胞的吸附培養結束後進行細胞的擴增培養；3)將偽狂犬病毒接種到擴增培養的細胞上，進行病毒的吸附培養；4)在病毒的吸附培養結束後進行感染細胞的培養；和5)收穫含有偽狂犬病毒的培養液，其中步驟1)至4)中的培養在潮汐培養條件下進行，所述潮汐培養條件是通過泵 出或泵入載體罐(8)中的培養液以間歇性淹沒與暴露載體實現的。優選的是，該方法中所述的載體罐(8)與裝有培養液的培養液袋(6)以能夠將培 養液袋內的培養液泵入載體罐中和能將載體罐內的培養液泵入培養液袋中的方式相聯通。優選的是，該方法中所述的載體罐中的載體由選自聚丙烯、藻素酸、聚酯纖維、明 膠、聚醯胺、聚乙烯醇、聚苯乙烯、聚氨酯、碳氟聚合物以及陶瓷中的一種或多種製成。更優選的是，該方法中所述的載體罐中的載體佔載體罐容積的40% 100% (V/ V)。最優選的是，該方法中所述的潮汐式生物反應器載體罐容積為2 100L。優選的是，該方法中所述的偽狂犬病毒是選自偽狂犬病病毒強毒株、偽狂犬病病毒基因缺失株和偽狂犬病病毒弱毒株中的一種。更優選的是，該方法中所述的偽狂犬病病毒為選自偽狂犬病病毒強毒株Fa株、Ea 株、偽狂犬病病毒基因缺失株Fa(TK7gE7gI_)株、Ea(TK7gE7gI_)株、偽狂犬病病毒弱毒株 Bartha 株、Bartha-K61 株、Bucharest 株、BUK 株中的一種。最優選的是，該方法中所述的偽狂犬病病毒為選自偽狂犬病毒基因缺失株 Fa (TKVgEVgD、Bartha-K61 株和 BUK 株中的一種。優選的是，該方法中所述的在步驟3)中的病毒接種按照感染複數(M.O. I.)為 0. 0001 1進行。優選的是，該方法中所述的哺乳動物細胞為選自Vero細胞、BHK-21細胞、MDBK細 胞、ST細胞、PK15細胞和IBRS細胞中的一種。更優選的是，該方法中所述的哺乳動物細胞為選自Vero細胞、BHK-21細胞和MDBK 細胞中的一種。優選的是，該方法中所述的在步驟1)中以8.5\106 4.0父107(^118/^載體的細 胞密度接種細胞。優選的是，該方法中所述的在步驟2)中的細胞擴增培養達到5. 5X108 7. 5X108cells/g載體的細胞密度時進行步驟3)所述的病毒接種。優選的是，該方法中所述的步驟1)中所述的吸附培養和步驟2)中所述的擴增培 養使用的培養液為細胞生長液，其中所述的細胞生長液由細胞培養液加3% 5% (V/V)的 牛血清組成；步驟3)中所述的病毒吸附培養和步驟4)中所述的感染細胞的培養使用的培 養液為細胞維持液，所述的細胞維持液由細胞培養液加0.5% 1.5% (V/V)的牛血清配製 而成。細胞培養液為MEM培養液、DMEM培養液、EMEM培養液和199培養液、1640培養液、 α -MEM培養液中的任意一種。所述的牛血清為胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。更優選的是，該方法中所述的步驟1)中所述的吸附培養和步驟3)中所述的病毒 吸附培養設定載體罐與培養液袋的換液量為載體罐容積的5% 20% (V/V)，載體罐中培 養液的液面上下行速度均為0. 5 50L/分鐘，液面在載體上下端點停滯時間均為0 150 分鐘，該吸附培養程序運行60 240分鐘，步驟2)中所述的擴增培養和步驟4)中所述的 感染細胞的培養設定換液量為載體罐容積的70% 95% (V/V)，載體罐中液面上下行速度 均為0. 5 50L/分鐘，液面在反應器上下端點停滯時間均為0 150分鐘。優選的是，該方法中所述的步驟5)中所述的收穫含有偽狂犬病毒的培養液為在 步驟4)所述的感染細胞的培養過程中，自病毒接種之時算起的第2 4天開始第1次收集， 以後每間隔2 4天收穫1次，共收穫2 4次，每次收穫時，將培養液袋中的培養液全部 收集到病毒收集桶，再將新配製的細胞維持液泵入到培養液袋中繼續下一輪感染細胞的培 養和培養液的收集。優選的是，該方法中所述的在步驟1)至4)的培養過程中控制葡萄糖含量範圍為 0. 5 5g/L。更優選的是，該方法中所述的步驟1) 2)中所述的培養在溫度36.5 °C 37. 5°C,pH值調節7. 0 8. 0，溶氧調節10% 80%，二氧化碳濃度為0% 10%的條件下 進行，步驟3) 4)中所述的培養在溫度36. 5°C 37. 5pH調節7. 1 7. 5，溶氧調節 25% 80%，二氧化碳濃度為0% 10%的條件下進行。
優選的是，本發明採用偽狂犬病毒種在Vero細胞上進行傳代適應後，提高了細胞 對病毒的敏感性，然後將在Vero細胞適應的偽狂犬病毒種接種到生物反應器中，在生產過 程中調節各種控制參數，如恆溫振蕩箱的攪拌速度、PH值、DO值、灌流速度、優化接種病毒 的感染複數(M. 0. I.)，同時，還要掌握好接種病毒時細胞的密度和接毒時間等，使病毒在高 密度的生物反應器中高效繁殖，並連續灌流收穫病毒，從而實現連續收穫，並能進一步提高 病毒的滴度。在發明中，術語病毒感染複數(Μ. 0. I.，multiplicity of infection)是指病毒感 染細胞的研究中感染時病毒與細胞數量之比。術語溶氧(DO)指培養液中溶解氧飽和度。術語CO2濃度指載體罐中CO2佔混合氣體的體積百分比。技術效果本發明採用了傳代細胞，尤其是採用了 Vero細胞，具有遺傳學穩定，沒有外源因 子汙染和無致瘤性的優點。本發明反應器系統培養的偽狂犬病毒數量和滴度明顯高於轉 瓶培養，因此在製備疫苗的後工藝中，不但提高了疫苗產量，也可大量減少殘餘細胞宿主蛋 白、殘餘細胞DNA、殘餘牛血清等異源物質的含量，進一步提高了疫苗接種的安全性，也更能 夠符合WHO《使用動物細胞生產生物製品規程》的要求和市場需求。


圖1為Vero細胞接種1天時載體上的顯微照片；圖2為Vero細胞培養至第3天時載體上的顯微照片；圖3為偽狂犬病病毒接種9天時載體上的顯微照片；圖4為潮汐式生物反應器結構示意圖。其中，各個標記分別為1進料桶、2收料桶、 3自動饋料儀、4pH/D0監控器、5恆溫振蕩箱、6培養液袋、7電腦控制器、8載體罐、9載體、10 恆溫培養艙、11進/取樣管。
具體實施例方式本發明的方法對於所用的設備、裝置或儀器沒有特殊要求，其可在各種類型的潮 汐式生物反應器中進行。雖然本申請具體實施例中採用的潮汐式生物反應器是購自賽宇細 胞科技股份有限公司的TideCell生物反應器，但是本領域技術人員在閱讀了本說明書的 描述後可以預計到，其他潮汐式生物反應器(無論大小)也能適用於本發明的方法。因偽 狂犬病病毒能在多種組織細胞上增殖，但對不同的細胞具有不同的敏感性，因此，本發明的 較佳實施方案中，選擇使用的是BHK-21細胞、MDBK細胞，更佳的是Vero細胞。本發明實施例中採用的潮汐式生物反應器結構如圖4所示。其中，各個標記分別 為1進料桶、2收料桶、3自動饋料儀、4pH/D0監控器、5恆溫振蕩箱、6培養液袋、7電腦控制 器、8載體罐、9載體、10恆溫培養艙、11進/取樣管。較佳地，本發明實施例中採用了依據潮汐原理而設計的高密度細胞培養系統，即 TideCell潮汐式生物反應器，該生物反應器的各部分功能及工作原理如下載體罐放置於恆溫培養艙中，恆溫培養艙為載體罐提供一個恆溫的環境。載體罐 是細胞培養與病毒增殖的場所，細胞貼附生長在載體罐內部的載體上，當培養液袋內的培
7養液泵入載體罐時，載體罐內的培養液液面上升並淹沒細胞，向細胞供給養分，並將細胞的 新陳代謝產物從細胞上去除。當載體罐內的培養液泵入培養液袋時，載體罐中的培養液液 面隨之下降，細胞露出，進行通風供氧。間歇淹沒與暴露載體床的培養方式使載體上的細胞 能夠得到足夠的營養和氧氣，同時產生的代謝廢物能夠有效地被排出去。載體罐的蓋子上裝有數根管道，這些管道的作用包括人工手動方式向載體罐內 注入液體(如接種細胞懸液等)或排出載體罐內的液體；由電腦控制器控制向載體罐注入 氣體，氣體通常是壓縮空氣、氧氣及CO2三種的混合物，三種氣體在混合物中的比例可以自 動調節控制，以適應細胞培養需要。電腦控制器可自動控制混合氣體向載體罐內的注入與 排出，並為潮汐提供動力。培養液袋用以盛裝培養液，並通過兩條管道與載體罐底部相通，兩條管道分別為 液體灌流通道，通過與載體罐之間的液體流動，從而完成潮汐過程。培養液在潮汐過程中的 灌流速度可通過電腦控制器進行調整。培養液的換液量是指在一次潮汐過程中，泵入或泵 出載體罐的液體量，換液量的大小決定了載體罐內液面頂部和底部所處的位置。在培養液袋與載體罐之間相連通的管道上設有進/取樣管，可使用無菌注射器通 過進/取樣管對培養液進行取樣，用以檢測其中的葡萄糖含量及病毒含量等指標。葡萄糖 的添加若葡萄糖低於規定標準，則根據葡萄糖測定儀測定培養液中剩餘葡萄糖的含量，及 培養液的總體積計算出需補加的葡萄糖量，利用無菌注射器抽取配製的葡萄糖溶液從進/ 取樣管中注射到載體罐與培養液袋之間的導管中，葡萄糖溶液隨著載體罐的換液得以從導 管進入培養液袋並做進一步混勻。恆溫振蕩箱通過加熱與振蕩，來維持培養液袋內培養液溫度的恆定及成分的勻質 性。pH/DO監控器可以監測培養液袋內培養液的酸鹼度(pH值)及溶氧(DO)，並通過 注入鹼性溶液(NaOH或NaHCO3溶液)將培養液的pH值控制在合適範圍內。收料桶及進料桶均通過自動饋料儀與培養液袋相連，培養液袋內的培養液需要進 行收穫時，可通過自動饋料儀進入收料桶，而進料桶內的培養液則可以通過自動饋料儀對 培養液袋進行補充。在本發明實施例中，所用的生物反應器的載體罐體積為2 100L，電腦控制器可 以調節控制多種參數，如潮汐過程中載體罐內培養液的潮汐速率及頻率、恆溫培養艙的溫 度、溶氧、CO2濃度等。本發明實施例所用的載體由聚丙烯與藻素酸等材料製成。本領域細胞培養常用的 其他材質製作的載體如聚酯纖維載體、明膠載體、聚醯胺載體、聚乙烯醇載體、聚苯乙烯載 體、聚丙烯載體、聚氨酯載體、碳氟聚合物載體以及陶瓷載體等，均可使用本發明之方法生 產偽狂犬病病毒。本發明實施例所用的病毒株包括偽狂犬病病毒基因工程株、弱毒株、強毒株等，均 可使用本發明的方法進行大規模培養。本發明實施例所用的病毒株採用的毒株分別為偽 狂犬病病毒強毒株Fa株(購自中國獸醫藥品監察所)、Ea株(購自中國獸醫藥品監察所)； 偽狂犬病病毒缺失株Fa(TK7gE7gI_)(該毒株參見中國專利CNlO 1186902A，該毒株以保藏 編號V200002保藏於中國典型培養物典藏中心(CCTCC)，Ea株(TK_/gE7gI_)(該毒株參見中 國專利CN1523103A，該毒株以保藏編號0907保存於CGMCC)；偽狂犬病病毒弱毒株Bartha
8株(購自中國獸醫藥品監察所)、Bartha_K61株(購自中國獸醫藥品監察所)、Bucharest 株(購自中國獸醫藥品監察所)、BUK株(中國獸醫藥品監察所)。傳代細胞使用的Vero細 胞，來源於美國典型培養物典藏中心(ATCC)，傳代數124，保藏號為CCL-81。為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這 些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍，下列實施例中未提及的具體實驗 方法，通常按照常規實驗方法進行。實施例1利用Vero細胞在潮汐式生物反應器中連續生產偽狂犬病病毒生物反應器=TideCell生物反應器，購自賽宇細胞科技股份有限公司。載體BioN0C II載體，購自賽宇細胞科技股份有限公司。CVD細胞核計數試劑盒購自賽宇細胞科技股份有限公司，貨號AB0100，批號 3007。葡萄糖測定儀購自賽宇細胞科技股份有限公司。偽狂犬病毒Bartha-K61株(購自中國獸醫藥品監察所)。培養基DMEM培養基購自GIBCO公司(貨號12800-082，批號1309922)。胰酶購自BD-Difco 公司(貨號215250，批號=5213753)。胎牛血清購自PAA公司(貨號=A 15-151，批號A64905_0972)葡萄糖購自SIGMA 公司(貨號:7021，批號:MFCD00063774)。碳酸氫鈉(NaHCO3)購自SIGMA公司(貨號:S_4019)。1)細胞的復甦培養先進行細胞的復甦，將一支工作細胞庫中的Vero細胞(該 細胞株以保藏編號CCL-81保藏於美國典型培養物典藏中心(ATCC)具體可見ATCC網 頁:http//www. atcc. org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/ Default, aspx ？ ATCCNum = CCL_81&Template = cellBiology)從液氮中取出，把細胞懸液 加入到方瓶中，利用細胞生長液(先按照說明書把DMEM培養基配成細胞培養液，每IL DMEM 細胞培養液中加入40ml PAA胎牛血清即為細胞生長液)進行培養，每3天傳代1次，具體 為，把已培養3天的細胞瓶中的細胞生長液倒掉，利用消化液(稱取8g NaCl、4g KClUOg 葡萄糖、2g EDTA-2Na、5. 8g NaHCO3和胰酶5g溶於800ml超純水中，最後加超純水定容至IL 過濾除菌)消化完全後，將細胞懸液與細胞生長液(配方如上所述)按1 3的比例重懸 進行分散。當利用方瓶培養一定數量後，再利用轉瓶進行傳代培養，方法與方瓶一樣。2)生物反應器中細胞的接種稱取BioNOC II載體600g(體積為10L)倒入IOL載 體罐中，加入 9. 5L PBS 緩衝液(0. 01mol/L，pH7. 2，稱取 8g NaCl,0. 2g KCl、1.44g Na2HP04 和0. 24g KH2P04，溶於800ml蒸餾水中，用HCl調節溶液的pH值至7. 2，最後加蒸餾水定容 至1L，121°C高壓蒸氣滅菌30分鐘，室溫保存)至完全浸沒載體過夜，將載體罐連同載體以 蒸汽高溫高壓(121°C)滅菌30分鐘，然後利用雙耳球把載體罐中的PBS緩衝液泵出。把 轉瓶培養的Vero細胞利用消化液(配方如上所述)消化分散，用細胞生長液(配方如上所 述)重懸後，按照1. 5X 107cells/g載體的終密度接入IOL載體罐中，並補加細胞生長液至 8. 0L，將載體罐放入37°C恆溫培養艙中。把50L無菌培養液袋置入恆溫攪拌箱中，把50L細 胞生長液(配方如上所述)泵入無菌培養液袋中，恆溫攪拌箱的溫度設為37.0°C，攪拌速 度45轉/分，再通過導管把載體罐與培養液袋進行連接，啟動細胞吸附程序設定換液量為 1L，載體罐中培養液的液面上下行速度均為2600ml/分鐘，液面在反應器上下端點(上下端點為載體罐內的液面在潮汐過程中所能達到的最高點和最低點，隨著換液量的大小不同而 不同。)停滯時間為30/20S，該程序運行180min。利用葡萄糖測定儀測定生長液中的葡萄 糖含量，若葡萄糖低於lg/L則利用無菌注射器抽取30 %的葡萄糖溶液(稱取30g葡萄糖 完全溶解於超純水中，定容至100ml，過濾除菌)控制葡萄糖含量範圍lg/L 3g/L。利用 7. 5% NaHCO3 (稱取7. 5g NaHCO3完全溶於超純水中，定容至100ml，過濾除菌)由pH監控 器自動調節pH值7. 2 士 0. 2，溶氧自動控制65 %，二氧化碳濃度自動調節5.0%。3)生物反應器中細胞的培養細胞吸附程序結束後改為細胞培養程序設定換液 量為9. 0L，載體罐中培養液的液面上下行速度為2000ml/min，液面在反應器上下端點(上 下端點為載體罐內的液面在潮汐過程中所能達到的最高點和最低點，隨著換液量的大小不 同而不同)停滯時間為40s/40s。培養期間，自接種細胞時算起，每24小時把TideCell載 體罐的蓋子打開利用載體取樣器取載體5片，並把其分別放入Iml的CVD細胞核染色液中， 37°C作用Ih後利用細胞計數板計數，以了解細胞增殖情況；同時也每24小時通過進/取樣 管利用無菌注射器抽取少量培養液，採用葡萄糖測定儀測定培養液中葡萄糖含量。葡萄糖 含量、PH值、溶氧和二氧化碳濃度的參數設定同步驟2)。載體與Vero細胞結合的電子顯微 鏡照片參見圖1。可以看出，Vero細胞培養至第1天，基本上全貼附於載體之上，細胞圓潤 長勢良好，但細胞稍稀疏。4)生物反應器中接種病毒自細胞接種之時算起，Vero細胞培養至第3天，Vero 細胞與載體結合的電子顯微鏡照片，如圖2所示，細胞密度較高，緊密貼附於載體之上，且 有大量細胞附著於載體縫隙中。此時細胞密度已達到6. OX 108cellS/g載體則開始接毒，先 把載體罐中的培養液泵出，按照病毒與細胞的比即感染複數(M.O. I.)為0.001接毒。然後 往載體罐中補加細胞維持液(先按照說明書把DMEM培養基配成細胞培養液，每IL DMEM細 胞培養液中加入IOml PAA胎牛血清即為細胞維持液)8. OL,同時把培養液袋中50L的細胞 生長液泵出，再泵進50L的細胞維持液(配方如上所述)。啟動病毒吸附程序設定載體罐 與培養液袋的換液量為1L，載體罐中培養液的液面上下行速度均為2500ml/分鐘，液面在 反應器上下端點(上下端點為載體罐內的液面在潮汐過程中所能達到的最高點和最低點， 隨著換液量的大小不同而不同。)停滯時間為40s/10s，該程序運行200min。利用30%的 葡萄糖溶液(配方如上所述)控制葡萄糖含量範圍lg/L 3g/L，利用7. 5% NaHCO3(配方 如上所述)自動調節PH值7. 35 士 0. 15，溶氧自動控制40 %，二氧化碳濃度自動調節5.0%。5)生物反應器中病毒的收穫病毒吸附程序結束後，仍運行步驟3)中的細胞培養 程序。利用30%的葡萄糖溶液(配方如上所述)控制葡萄糖含量範圍lg/L 3g/L，利用 7. 5^NaHCO3(配方如上所述)自動調節pH值7. 25士0. 15，溶氧自動控制30%，二氧化碳濃 度自動調節1.0%。自接毒之時算起，分別於第3、6、9天收穫病毒液。每次收穫病毒液時， 利用自動饋料儀先把培養液袋中50L的培養液(即病毒液)按照5L/min的流速收集到病 毒收集桶，並於-40°C凍存，再利用自動饋料儀把新配製的細胞維持液(配方如上所述)泵 入到50L培養液袋中。最後一次收穫時，載體罐中的載體連同其中的培養液(即病毒液) 一起於_40°C凍融1次收穫。接毒後隨著病毒的增殖Vero細胞病變逐漸加重，先後出現變 圓從載體上脫落、萎縮、破碎的現象，連續關注至接毒後第9天細胞大量脫落，破碎附著在 載體上，如圖3所示。病毒液的病毒含量TCID5tl測定按照常規方法進行，比如可以按照文獻 方法進行(如參照中華人民共和國獸用生物製品規程，2000年版附錄446頁)，第3、6、9天
10收穫的病毒液的滴度分別為 109_ 8TCID50/ml、109_ 75TCID50/ml、109_ 8TCID50/ml。Vero細胞在利用其他體積的潮汐式生物反應器和其他偽狂犬病毒毒株時，細胞培 養和病毒增殖情況基本相同，收穫病毒也的滴度也無明顯差異。實施例2BHK-21細胞在潮汐式生物反應器中連續生產偽狂犬病病毒細胞培養液MEM培養基購自GIBCO公司(貨號61100-087，批號678277)，按產 品說明書所述配製成細胞培養液。牛血清購自Hyclone 公司(貨號:SV30087. 02，批號:NSK0069)偽狂犬病毒Fa基因缺失株(TK_/gE7gr)(該毒株參見中國專利CN101186902A， 該毒株以保藏編號V200002保藏於中國典型培養物典藏中心(CCTCC))。其他材料與試劑同實施例1。本實施例採用的BHK-21細胞以保藏號CCL-10保藏於美國典型培養物典藏中 心(ATCC)具體可見 ATCC 網頁 http://www. atcc. org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ ProductDetails/tabid/452/Default. aspx ？ ATCCNum = CCL—lO&Template = cellBiology，在本實例中採用載體罐為IOL的TideCell生物反應器，該實施例的步驟、 方法和參數與實施例1的步驟、方法和參數基本相同，使用的細胞生長液和細胞維持液中 牛血清的配比也相同，不同之處在於，使用的細胞培養液和牛血清如上所述，BHK-21細胞 以1.3X107cellS/g載體的密度接入反應器。實施例中病毒接種感染複數也為0.001， 潮汐式培養9天，每次收毒50L，第3、6、9天收穫潮汐式培養的病毒液，病毒滴度分別為 ΙΟ9' 75TCID50/ml、ΙΟ9' 8TCID50/ml、IO9' 75TCID50/ml。BHK-21細胞在利用其他體積的潮汐式生物反應器和其他偽狂犬病毒毒株時，細胞 培養和病毒增殖情況基本相同，收穫病毒也的滴度也無明顯差異。實施例3MDBK細胞在潮汐式生物反應器中連續生產偽狂犬病病毒細胞培養液MEM培養基購自GIBCO公司(貨號61100-087，批號678277)，按產 品說明書所述配製成細胞培養液。新生牛血清(GIBC0公司生產，貨號16010-14，批號693745)其他材料與試劑同實施例1。本實施例中MDBK細胞(NBL-I)以保藏號CCL-22保藏於美國典型培養物典藏中 心(ATCC)具體可見 ATCC 網頁。http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ ProductDetails/tabid/452/Default. aspx ？ ATCCNum = CCL_22&Templ￡ite = CellBiology0本實施例採用載體罐為IOL的潮汐式生物反應器，採用的步驟、方法和參 數與實施例1的步驟、方法和參數基本相同，採用的細胞生長液和細胞維持液也與實施 例1中牛血清的配比相同，不同之處在於，使用的細胞培養液和牛血清如上所述，MDBK細 胞以1.5X107cellS/g載體的密度接入反應器。實施例中病毒接種時感染複數為0.001。 潮汐式培養9天，每次收毒50L，第3、6、9天收穫潮汐式培養的病毒液，病毒滴度分別為 ΙΟ9' 75TCID50/ml、ΙΟ9' 8TCID50/ml、IO9' 8TCID50/ml。MDBK細胞在利用其他體積的潮汐式生物反應器和其他偽狂犬病毒毒株時，細胞培 養和病毒增殖情況基本相同，收穫病毒也的滴度也無明顯差異。實施例4 轉瓶培養與潮汐式生物反應器的比較材料與試劑同實施例1。另外有10L轉瓶購自四川萬福玻璃儀器有限責任公司。
11轉瓶機(型號ZP01)購自湖北省黃石市恆豐醫療器械有限公司。1)在IOL轉瓶中生產偽狂犬病毒，先將Vero細胞進行細胞的復甦、方瓶擴增培養， 具體方法如實施例1中的步驟1)，再以終濃度為4. 5X104cells/ml接種至IOL轉瓶，加細 胞生長液(配方如實施例1所述)至3.0L。至37°C溫室中於轉瓶機上以5轉/小時培養， 以此方式培養細胞至2天接種偽狂犬病毒，接毒前，先把IOL轉瓶中的細胞生長液倒掉，然 後按照以0. 001的感染複數進行接毒，補加細胞維持液至3L，至37°C溫室中於轉瓶機上以 10轉/小時培養，此過程為病毒吸附1小時後，1小時後把轉瓶機的轉速改為5轉/小時， 其他條件不變，自接毒之時算起培養至第3天，收穫病毒液，即IOL轉瓶連同其中的細胞、細 胞維持液置-40°C凍融一次後完全收穫，測定病毒滴度TCID5tl，方法同實施例1。2)在載體罐為IOL的生物反應器中生產偽狂犬病毒，方法步驟同實施例1。3)實驗結果=Vero細胞在IOL轉瓶中培養偽狂犬病毒的的滴度為108 8TCID5Q/ml ； 在IOL反應器中培養的偽狂犬病毒，3次收穫平均滴度為109_8TCID5(l/ml。各項參數比較具 體見表1。表1兩種培養方式比較
權利要求
一種偽狂犬病病毒的大規模生產方法，其特徵在於，包括如下步驟1)細胞的接種將哺乳動物細胞接種到潮汐式生物反應器載體罐(8)內添加的載體(9)上，進行細胞的吸附培養；2)在細胞的吸附培養結束後進行細胞的擴增培養；3)將偽狂犬病毒接種到擴增培養的細胞上，進行病毒的吸附培養；4)在病毒的吸附培養結束後進行感染細胞的培養；和5)收穫含有偽狂犬病毒的培養液，其中步驟1)至4)中的培養在潮汐培養條件下進行，所述潮汐培養條件是通過泵出或泵入載體罐(8)中的培養液以間歇性淹沒與暴露載體實現的。
2.根據權利要求1所述的偽狂犬病病毒的大規模生產方法，其特徵在於，所述載體罐 (8)與裝有培養液的培養液袋(6)以能夠將培養液袋內的培養液泵入載體罐中和能將載體 罐內的培養液泵入培養液袋中的方式相聯通。
3.根據權利要求1所述的偽狂犬病病毒的大規模生產方法，其特徵在於，所述載體罐 中的載體由選自聚丙烯、藻素酸、聚酯纖維、明膠、聚醯胺、聚乙烯醇、聚苯乙烯、聚氨酯、碳 氟聚合物以及陶瓷中的一種或多種製成。
4.根據權利要求1所述的偽狂犬病病毒的大規模生產方法，其特徵在於，所述載體罐 中的載體佔載體罐容積的40% 100% (V/V)。
5.根據權利要求1 4任一項所述的偽狂犬病病毒的大規模生產方法，其特徵在於，所 述的潮汐式生物反應器載體罐容積為2 100L。
6.根據權利要求1 4任一項所述的偽狂犬病病毒的大規模生產方法，其特徵在於，所 述偽狂犬病毒是選自偽狂犬病病毒強毒株、偽狂犬病病毒基因缺失株和偽狂犬病病毒弱毒 株中的一種。
7.根據權利要求6所述的偽狂犬病病毒的大規模生產方法，其特徵在於，所述的偽狂 犬病病毒為選自偽狂犬病病毒強毒株Fa株、Ea株、偽狂犬病病毒基因缺失株Fa (TKVgEV gF)株、Ea(TK7gE7gr)株、偽狂犬病病毒弱毒株 Bartha 株、Bartha_K61 株、Bucharest 株、 BUK株中的一種。
8.根據權利要求7所述的偽狂犬病病毒的大規模生產方法，其特徵在於，所述的偽狂 犬病病毒為選自偽狂犬病毒基因缺失株Fa(TK7gE7gI_)株、Bartha-K61株和BUK株中的一 種。
9.根據權利要求7或8所述的偽狂犬病病毒的大規模生產方法，其特徵在於，在步驟 3)中的病毒接種按照感染複數為0. 0001 1進行。
10.根據權利要求9所述的偽狂犬病病毒的大規模生產方法，其特徵在於，所述哺乳動 物細胞為選自Vero細胞、BHK-21細胞、MDBK細胞、ST細胞、PK15細胞和IBRS細胞中的一 種。
11.根據權利要求10所述的偽狂犬病病毒的大規模生產方法，其特徵在於，所述哺乳 動物細胞為選自Vero細胞、BHK-21細胞和MDBK細胞中的一種。
12.根據權利要求10或11所述的偽狂犬病病毒的大規模生產方法，其特徵在於，在步 驟1)中以8. 5 X IO6 4. OX 107cells/g載體的細胞密度接種細胞。
13.根據權利要求12所述的偽狂犬病病毒的大規模生產方法，其特徵在於，在步驟2)中的細胞擴增培養達到5. 5X IO8 7. 5X108cells/g載體的細胞密度時進行步驟3)所述 的病毒接種。
14.根據權利要求13所述的偽狂犬病病毒的大規模生產方法，其特徵在於，步驟1)中 所述的吸附培養和步驟2)中所述的擴增培養使用的培養液為細胞生長液，其中所述的細 胞生長液由細胞培養液加3% 5% (V/V)的牛血清組成；步驟3)中所述的病毒吸附培養 和步驟4)中所述的感染細胞的培養使用的培養液為細胞維持液，所述的細胞維持液由細 胞培養液加0.5% 1.5% (V/V)的牛血清配製而成，其中所述的細胞培養液為選自MEM培 養液、DMEM培養液、EMEM培養液、199培養液、1640培養液和α -MEM培養液中的任意一種， 所述的牛血清為胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。
15.根據權利要求14所述的偽狂犬病病毒的大規模生產方法，其特徵在於，步驟1)中 所述的吸附培養和步驟3)中所述的病毒吸附培養設定載體罐與培養液袋的換液量為載體 罐容積的5% 20% (V/V)，載體罐中生長液的液面上下行速度均為0. 5 50L/分鐘，液面 在載體上下端點停滯時間均為0 150分鐘，該吸附培養程序運行60 240分鐘，步驟2) 中所述的擴增培養和步驟4)中所述的感染細胞的培養設定換液量為載體罐容積的70% 95% (V/V)，載體罐中液面上下行速度均為0. 5 50L/分鐘，液面在反應器上下端點停滯時 間均為0 150分鐘。
16.根據權利要求15所述的偽狂犬病病毒的大規模生產方法，其特徵在於，步驟5)中 所述的收穫含有偽狂犬病毒的培養液為在步驟4)所述的感染細胞的培養過程中，自病毒 接種之時算起的第2 4天開始第1次收集，以後每間隔2 4天收穫1次，共收穫2 4 次，每次收穫時，將培養液袋中的培養液全部收集到病毒收集桶，再將新配製的細胞維持液 泵入到培養液袋中繼續下一輪感染細胞的培養和培養液的收集。
17.根據權利要求13 16中任一項所述的偽狂犬病病毒的大規模生產方法，其特徵在 於，在步驟1)至4)的培養過程中控制葡萄糖含量範圍為0. 5 5g/L。
18.根據權利要求17所述的偽狂犬病病毒的大規模生產方法，其特徵在於，步驟1) 2)中所述的培養在溫度36. 5 0C 37. 5 0C，pH值調節7. 0 8. 0，溶氧調節10% 80%，二氧 化碳濃度為0% 10%的條件下進行，步驟3) 4)中所述的培養在溫度36. 5°C 37. 5°C， pH調節7. 1 7. 5，溶氧調節25% 80%，二氧化碳濃度為0% 10%的條件下進行。
全文摘要
本發明涉及一種用潮汐式生物反應器培養傳代細胞生產基因缺陷型偽狂犬病毒的方法(1)復甦細胞進行傳代培養；(2)應用特定生物反應器和載體系統進行細胞的高密度培養，讓細胞在載體上貼附，讓培養基循環、充氧、調控pH值和葡萄糖；(3)應用生物反應器進行病毒感染，更換成病毒培養基，接入病毒，讓病毒在細胞上吸附完全；(4)特定的條件培養、擴增病毒；(5)收穫病毒，實現大規模生產。
文檔編號C12N7/00GK101979518SQ201010513449
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月15日 優先權日2010年5月10日
發明者喬榮岑, 孫進忠, 張許科 申請人:洛陽普萊柯生物工程有限公司