狂犬病毒CTN株全基因組感染性cDNA克隆及其製備方法和應用的製作方法

2023-09-16 12:50:00 3

專利名稱：：狂犬病毒CTN株全基因組感染性cDNA克隆及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種狂犬病毒，更具體地說是利用反向遺傳技術拯救重組狂犬病毒，屬於生物工程領域。
背景技術：
：狂犬病(RV)是由狂犬病毒引起的一種人畜共患病，病死率幾乎高達100%。該病流行於100多個國家和地區，全世界每年因狂犬病死亡的人數達55000人，印度是狂犬病流行最嚴重的國家，其死亡人數佔一半；中國的狂犬病例數僅次於印度，佔世界第二位。狂犬病毒具有神經嗜性，在動物機體內的感染可以分為向心性擴散和離心性擴散兩個過程。前者即病毒從入侵部位通過神經-肌肉接頭或神經傳感器侵入外周神經，再沿脊髓到達中樞神經系統，導致腦脊髓炎；後者即離心性擴散，是病毒從中樞神經向周圍神經系統擴散，導致臨近某些非神經系統的感染，特別是受神經系統高度支配的器官，因此最終不可避免地發展為全身神經系統的衰竭和死亡，具體的致病機理尚不明確。反向遺傳技術是20世紀末新興起來的一種技術，即從克隆的質粒中拯救出具有感染活性的病毒。此技術可以用於製造弱毒活疫苗用於野生動物的免疫，效果很好，在歐美國家應用較多，所以在這些國家野生動物狂犬病得到了很好的控制。1994年，Schell等首次建立了狂犬病毒的反向遺傳學，成功拯救了SADB19株狂犬病毒，此後相繼用此方法成功拯救出其他兩株RC-HL，HEP-Flory和ERA株狂犬病毒。目前，對狂犬病尚無有效的治療方法，免疫接種疫苗是預防狂犬病的最有效措施之一。現有的狂犬病毒疫苗主要是滅活疫苗，用於人的免疫，對於動物的免疫或者野生動物的免疫依然存在漏洞和不足，由於滅活疫苗為注射型疫苗，對於野生散養動物的免疫並不實用，而且面臨動物疫苗生產成本高，用於野生動物免疫費用昂貴等問題。在反向遺傳系統中，獲得基因組轉錄後精確的5'和3'末端是通過在其全長基因組3'和5'末端添加具有自我切割活性的HamRz和HdvRz實現的。而狂犬病病毒全長基因組有12kb，不可能一次完成擴增，所以全長基因的擴增都採用分段擴增的方法。預在基因組cDNA的5'端加入錘頭狀核酶序列，就將錘頭狀核酶序列直接設計在第一個基因片段的上遊引物中；同樣，預將丁型肝炎核酶序列添加在基因組cDNA序列的3'末端，就將丁型肝炎核酶的序列設計在最後一個基因片段的下遊引物中。這種設計必然存在一些問題。首先，HamRz和HdvRz的活性中心最小結構分別包括45nt和85nt，這麼長的引物必會造成上下遊引物長度不匹配；引物之間GC呢失調；引物之間二聚體、髮夾結構不可避免；其次，由於上下遊引物長度的差距，很難找到合適的退火溫度，PCR反應條件也難於優化。
發明內容本發明的一個目的是提供一種狂犬病毒CTN株全基因組感染性cDNA克隆。本發明的另一目的是提供一種上述狂犬病毒cDNA克隆的製備方法。本發明的又一目的是提供上述方法中使用的擴增引物及表達載體。為了實現上述目的，本發明思路為本發明利用CTN株狂犬病病毒全長基因組內的單一限制性酶切位點將病毒全長分成四段進行擴增，在擴增同時去除偽基因處423bp鹼基，代之以綠色螢光蛋白基因，最後克隆入pVAX-R表達載體，載體序列如SEQIDNo.24所示；構建成病毒基因組全長質粒。pVAX-R載體為pVAXl載體的改造體，即將pVAXl載體的多克隆酶切位點處切除，代之以錘頭狀核酶、由9個限制性酶切位點組成的linker、丁型肝炎核酶序列。另外，用RT-PCR擴增CTN株狂犬病病毒的核蛋白(N)，磷蛋白(P)，糖蛋白(G)，轉錄大蛋白(L)基因序列，並將擴增片段直接克隆入pVAXl載體中，構成反向遺傳系統中的4個輔助質粒。最後將這5個質粒共同轉染BHK-21細胞，最終拯救狂犬病病毒，得到狂犬病毒CTN株全基因組感染性cDNA克隆。CTN株狂犬病病毒全長基因組包括11923個核苷酸，(Genbank編號EF564174)本發明的具體技術方案為狂犬病毒CTN株全基因組感染性cDNA克隆，該cDNA克隆的核酸序列為SEQIDNo.l所示。一種狂犬病毒CTN株全基因組感染性cDNA克隆的製備方法，其包括下列步驟(1)利用CTN株狂犬病病毒全長基因組內的單一限制性酶切位點將病毒全長分成四段進行擴增，在擴增同時去除偽基因處423bp鹼基，代之以綠色螢光蛋白基因，5最後克隆入pVAX-R表達載體，載體序列如SEQIDNo.24所示；構建成病毒基因組全長質粒；(2)用RT-PCR擴增CTN株狂犬病病毒的核蛋白、磷蛋白、糖蛋白和轉錄大蛋白基因序列，並將擴增片段直接克隆入pVAXl載體中，構成反向遺傳系統中的4個輔助質粒；(3)將上述5個質粒共同轉染細胞，最終獲得狂犬病毒CTN株全基因組感染性cDNA克隆。上述PVAX-R表達載體的構建方法為將pVAXl載體的多克隆酶切位點處切除，代之以錘頭狀核酶、由9個限制性酶切位點組成的linker和丁型肝炎核酶序列。所述PVAX-R表達載體的核苷酸序列如SEQIDNo.24所示。Linker的合成過程為了便於病毒全長cDNA的克隆，設計一個linker將連接基因組片段所需的限制性內切酶按順序依次排列。LinkercDNA序列為linker-F:1inker-R:5'-GGCCGCAAGGGCCCACTGCAGAGTTTAAACAGCTAGCAGGCGCGCCAGCGCGCAGAATTCAGGTAC-3，。劃線部分為KpnI，EcoRI,BssHII，AscI,NheI,PmeI，PstI，ApaI，NotI酶切位點，這兩條寡聚核苷酸鏈有上海生物工程公司合成，將這兩個寡聚核苷酸鏈直接退火形成雙連結構後克隆於pVAXl載體中KpnI/NotI位置。由此在pVAXl載體的CMV啟動子下遊依次連接著HamRz，含有9個限制性酶切位點的linker和HdvRzcDNA序列，將改造後的載體命名為pVAX-R。pVAX-R載體為pVAXl載體的改造體，為克服現有技術的的不足並結合HamRz和HdvRz各自的結構特點，本發明載體的構建中在錘頭型核酶的螺旋III區內引入Kpnl限制性酶切位點，將此位點至核酶5，端的cDNA序列人工合成，形成雙鏈，直接克隆到表達載體中。而Kpnl酶切位點至HamRz3，端的cDNA序列(大概10nt左右)直接設計在第一個基因片段的上遊引物中，通過PCR反應直接擴增獲得。這樣在KpnI限制性酶切位點處形成一個連接位點，將HaraRz和基因組cDNA5'末端連接在一起，並且使基因組cDNA5'末端序列直接位於切點處，轉錄後產生精確的基因組5'末端，沒有任何額外序列。按照同樣的方法，根據這種HdvRz的結構特點，在HdvRz的J1/2區引入一個NotI切點，將HdvRz分成兩個部分，NotI切點至HdvRz3，末端的cDNA序列人工合成後，直接克隆到連有HamRz的pVAXl載體中，而NotI切點至HdvRz5'末端的這段cDNA序列添加到F4的下遊引物中，6通過F4段的PCR擴增得到，這樣NotI就成為連接基因組cDNA3'末端序列和HdvRz的連接點，使基因組cDNA3'末端位於HdvRz的切點位置，轉錄後產生3'末端無多餘序列的基因RNA。上述步驟(1)中擴增引物序列為SEQIDNo.2至SEQIDNo.9所示，共4個引物對。所述核蛋白的擴增引物為SEQIDNo.10和SEQIDNo.11所示；所述磷蛋白的擴增引物為SEQIDNo.12和SEQIDNo.13所示；所述糖蛋白的擴增引物為SEQIDNo.14和SEQIDNo.15所示；所述轉錄大蛋白的擴增引物為SEQIDNo.16和SEQIDNo.23所示。上述的狂犬病毒CTN株全基因組感染性cDNA克隆的擴增引物，其中，所述引物的核苷酸序列為SEQIDNo.2至SEQIDNo.23所示。本發明用途本發明狂犬病毒CTN株全基因組感染性cDNA克隆在製備狂犬病疫苗中的應用或作為病毒載體的應用。本發明的優點及有益效果現有技術無法直接將CTN株狂犬病病毒進行改造，使其可以加入外源性功能蛋白進行功能上的擴展。本發明使用反向遺傳技術並通過對載體的構建使重組狂犬病病毒從克隆的質粒中獲得拯救獲得狂犬病毒CTN株全基因組感染性cDNA克隆。本發明的優點在於本發明獲得的狂犬病毒CTN株全基因組感染性cDNA克隆保存其原有病毒的弱毒性，具有安全性，並且可以對其在RNA水平上進行加工和修飾、基因的替換和刪除、外源基因的插入等一系列改變，功能性更強大，應用範圍更廣泛，可以用來製備新型狂犬病疫苗如野生動物口服疫苗等或做為病毒載體使用。本發明可以進一步用來研究狂犬病病毒的致病機理、中國狂犬病持續流行的分子機制等。因此，本發明極具開發應用價值和市場前景。本發明將綠色螢光蛋白插入CTN株狂犬病病毒全長基因組內構建全長質粒，通過狂犬病病毒的反向遺傳技術，最終才能夠克隆cDNA質粒中拯救出具有活性的狂犬病病毒，此病毒能夠穩定表達綠色螢光蛋白基因，最終確定重組病毒是否拯救成功時，只需在螢光顯微鏡下觀察是否可見綠色螢光蛋白的表達即可得知。無需像現有技術一樣利用抗體等技術進行確認。下面結合附圖和具體實施方式對本發明做進一步說明，以使本領域技術人員可以更清楚的得知本發明的技術方案，並非對本發明的限制。圖l為真核表達載體pVAXl和本發明構建的pVAX-R載體圖譜。具體實施例方式實施例1狂犬病毒CTN株全基因組感染性cDNA克隆的構建方法(1)病毒CTN株狂犬病病毒的親代病毒是1953年從山東省淄博市一個感染了狂犬病病毒病人的腦組織中分離得到的，將分離到的病毒在鼠腦中連續傳代56代，隨後在人二倍體細胞(BMK-17)上繼續傳代50代得到的狂犬病病毒減毒疫苗株，並於1983年和2005被世界衛生組織(冊0)獲批作為中國狂犬病疫苗生產用毒株。此病毒株由中國藥品生物製品檢定所保存並提供。(1)病毒RNA的提取取少量凍幹的帶毒鼠腦，先加入O.2mlTRIzolReagent(Invitrogen公司)研磨成勻漿後，再加入O.8mlTRIzo1Reagent(Invitrogen公司)。混勻，在-20。C冰箱中放置30min，力H200ul氯仿，快速顛倒充分混勻，室溫放置5rain，4"C離心，12000rpm離心15min，取離心後上層水相加入新l.5ral1.5ml離心管中，每管加入與上清等體積的異丙醇，輕柔混合，室溫放置10min，4'C12000rpm離心10min，棄上清，留沉澱，加入lml75%新配製的冰預冷的乙醇，振蕩洗滌，4"C12000rpm離心10min，棄上清，室溫乾燥沉澱，後將沉澱溶於70wl無核酸酶的超純水中。(2)病毒RNA的逆轉錄將隨機引物Pd(N)6稀釋至0.2iig/"l，將水浴箱預熱至65。C，吸取33tx1總RNA液加入l.5ml離心管中，放入65。C中水浴10min，取出後立即冰浴2rain，瞬時離心，將32ul液體轉移至Ready-To-GoYou-PrimeFirst-StrandBeads(細ERSHAM公司)反應管中，再向反應管中加入lul隨機引物Pd(N)6(0.2ug/iU)，使總體積達到33ul，室溫lmin，混勻，瞬時離心，37。C水浴60min，即得逆轉錄產物cDNA。(3)病毒基因序列擴增引物的設計與合成根據CTN株病毒序列，選擇基因組中兩個單一酶切位點作為分界點將病毒全長基因分成4段(F1，F2，F3，F4)進行擴增，擴增同時去除了偽基因處423bp鹼基代之以綠色螢光蛋白(GFP)基因，擴增的引物如表l所示:tableseeoriginaldocumentpage9tableseeoriginaldocumentpage10F"代表正向引物，"R"代表反向引物。(4)目的基因的PC財廣增:①將全基因分為4個片段分別擴增並直接測序在0.2ml離心管中加入以下試劑進行PCR反應雙蒸水34.5ul，10XEasy-ABuffer5ul，10mMdNTPmix1.5ul，Primer-F1.5ul，Primer-R1.5ul，cDNA5ul，Easy-AHigh-FidelityPCRCloningEnzyme&MasterMix(Stratagene公司)lul。4個片段PCR程序循環如下:94°C預變性5min，94°C變性30s，對4個片段而言58。C，68°C,58°C,66。C分別退火40s，72"C延伸40s，72t:總延伸10min，共30個循環。②輔助質粒的擴增輔助質粒PCR反應體系同全長質粒分段擴增的PCR體系完全相同，PCR反應條件分別為，N，P，G和L基因的各個片段的PCR反應條件為94°C5min，94°C30s，58°Clmin,72°C2min30s，72。C10min。(5)目的基因片段的回收使用TAE緩衝液製作1X瓊脂糖凝膠，然後對目的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳。在長波紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。切碎膠塊。將膠塊放入一個無色離心管中，稱其重量(100mg100ul)。力n3倍膠塊體積的BufferQG，5(TC水浴10min(或直到膠塊完全溶解)。可以每隔2-3min震蕩離心管以助溶解。膠塊完全溶解後，混合物應該為黃色(如同沒溶解膠之前BufferQG的顏色)，將QIAquickspincol咖n放置於2ml收集管上，小心將溶液轉移到QIAquickcol畫中，使DNA結合到膜上，13000rpm離心lmin，棄濾液，將QIAquickcol咖n再放回同一收集管中，加0.75mlBufferPE，洗結合到膜上的DNA。棄濾液，13000rpm再離心lmin，將QIAquick放入乾淨的l.5ml離心管中，加30ul的洗脫液到QIAquick膜的中心部位，並靜置lmin，然後13000rpm離心lmin，該試劑盒購自QIAgen公司。(6)目的基因片段連接T載體將回收的PCR產物與pGEM-TEasy載體連接，取純化的PCR產物5ul，10XT4DNAbufferlul，T4DNA連接酶lul，pGEM-TEasyectorlul，滅菌雙蒸水2ul，16°C連接過夜。(7)轉化取連接產物5ul轉化到100ulE.coliJM109感受態細胞中(TAKARA公司)，37。C180rpm/min復甦1.5h，取200ul菌液塗於含50ug/ul的氨苄青黴素和適量IPTG(異丙基-e-D-硫代半乳糖苷)、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚一p-半乳糖苷)瓊脂平板上，37。C培養12-16h，進行藍白斑篩選。(8)PCR鑑定:挑取白色菌落，用PCR擴增用的特異性引物進行菌落PCR鑑定，PCR體系和條件同PCR擴增時所用。(9)小量提取質粒將過夜培養的細菌培養液lml置於l個1.5ml離心管裡，4°C13000rpm離心lmin，棄掉上清，加入250ul試劑盒裡預冷的溶液Pl吹打溶解細菌沉澱，加入250ul溶液P2，輕柔的顛倒混勻，再加入350ul溶液P3，顛倒混勻出現絮狀沉澱後，4°C12000rpm離心10min，立即吸取上清於2ralQIAGEN-tip中，4°C12000rpm離心lmin，棄掉液體，加入500ul溶液PB洗脫，12000rpm離心lmin，棄掉液體，加入750ul溶液PE洗脫，12000rpm離心lmin，棄掉液體，空離lmin，加入30ulTEbuffer，12000rpm離心lmin，洗脫液即為所需質粒。(10)酶切鑑定選擇適當的酶切位點對連接在T載體上的各個片段進行鑑定。取小提質粒2ul，10Xbufferlul，相應的內切酶O.5ul，雙蒸水補至10ul，37。C水浴lh，1%瓊脂糖凝膠電泳鑑定酶切結果。各個片段鑑定所用限制性內切酶及鑑定後的目的片段如下，F1-T:Dral(2490bp，1818bp，692bp);F2-T:Pvul(1096bp，3825bp);F3-TBamHI(1097，1657，2877);F4-THindlII/MluI(1642,4301);N-T:Nhel/Aflll(1353bp，3000bp);P-T:Nhel/Hindlll(894bp，3000bp);G-T:Nhel/Af111(1575bp，3000bp);L1-T:KpnI/Sall(1900bp，3000bp);L2-T:Sail/Ncol(1350bp，3000bp);L3-T:Ncol/Hindlll(1950bp，3000bp);L4-T:HindlII/EcoRI(1250bp，3000bp)。(11)序列測定將TA克隆鑑定正確的樣本，送北京博邁德科技發展有限公司測序。用pGEM-TEasy載體上的通用引物進行測序，篩選出正確的TA克隆質粒備用。(12)表達載體的改造將pVAXl載體用Nhel/Kpnl，Kpnl/Notl，Notl/Pmel分別雙切，同時將HamRz，linker,HdvRz合成的寡聚核苷酸稀釋至工作濃度10(TC煮沸後，室溫退火5min，將這些寡聚核苷酸分別連接於pVAXl上構成pVAX-R表達載體。具體方法同(10)。(13)全長質粒構建用酶切連接的方法，將Fl,F2，F3，F4依次連接在pVAX-R載體上，同時選擇pGFP作為綠色螢光蛋白基因(GFP)的供體，在GFP基因的5'和3'段分別插入兩個linker,使GFP基因3'和5'兩端分別帶有狂犬病病毒轉錄起始和終止信號。具體連接和轉化方法如下線性化的pVAX-R載體3ul，10XT4bufferlul，相應的酶切片段5.5ul，T4DNA連接酶0,5ul，16。C連接過夜。將連接產物轉化E.coli，9感受態細胞，取200ul復甦的感受態細胞菌液塗於含50ug/ul的卡那LB平板上，挑取克隆進行PCR和酶切鑑定。(14)輔助質粒構建用相應的酶將N，P,G，LI,L2,L3，L4分別從T載體中酶切消化下來，方法同(10)，再將其克隆入pVAXl載體中，具體連接方法如下線性化的pVAXl(Invitrogen)載體3ul，10XT4bufferlul，相應的酶切片段5.5ul，T4DNA連接酶(NEB)0.5ul，16。C連接過夜。將連接產物轉化E.coliJM109(TAKARA)感受態細胞，取200ul復甦的感受態細胞菌液塗於含50ug/ul的卡那LB平板上，挑取克隆進行PCR和酶切鑑定。(15)大量提取質粒QIAGENPlasmidMaxiKit提純方法將l個錐形瓶裡過夜培養的細菌培養液150ml置於l個50ml離心管裡，4°C6000g離心15min,分三次離心收集細菌。加入10ml溶液P1重懸細菌；加入10m溶液P2，上下顛倒輕柔混勻，室溫孵育5min;再加入10ml預冷的溶液P3，輕柔顛倒混勻4-6次，將混合液體倒入QIAfilterCartridge中，室溫孵育10rain;同時，用10ml溶液QBT平衡QIAGEN-tip500柱，流幹後，將注射器內芯輕柔插入注射器內，將流出的液體收集至平衡過的QIAGEN-tip500柱內，待液體12流幹後，用60ml溶液QC洗滌柱，將QIAGEN-tip500柱放置另l個50ml離心管裡，用15ml溶液QF洗脫DNA，加10.5ml(0.7體積)的室溫異丙醇到洗脫液裡，室溫孵育5min，同時將QIAprecipitatorMaxiModule置於30ml注射器的管口，將孵育後的洗脫混合液倒入注射器內，插上注射器內芯，讓洗脫液在壓力作用下緩緩流出，加入2ml70%的無水乙醇洗脫QIAprecipitator，再把內芯拔出，推一管空氣使殘餘的無水乙醇排出，將QIAprecipitator置於一個5ml注射器管口，加入500ulTE，收集洗脫的液體，即為含有DNA質粒。(16)轉染將大量提取的病毒全長質粒和4個輔助質粒，按照全長質粒2ug，N蛋白輔助質粒0.5ug，P蛋白輔助質粒0.25ug，G蛋白質粒O.15ug和L蛋白輔助質粒0.lug的量共同轉染朋K-21細胞。轉染前16h用消化好的B服-21細胞接種6孔板，待細胞長成單層，密度大概在80%左右，用無血清無雙抗(雙無)的DMEM(Gibco)洗滌細胞2次，在孔中加入lml的雙無DMEM待用；10ulLipofectamine2000TransfectionReagent(Invitrogen)加入50ul雙無的DMEM中，室溫孵育5min，同時將5種質粒加入50ul雙無DMEM中，室溫孵育5min;將DNA稀釋液和脂質體稀釋液輕柔混合，室溫孵育20min，整個孵育時間不能超過25min。將孵育完的混合液加入洗好的6孔板中，6h後，棄掉細胞上清液，換成含10%血清，r/。雙抗的DMEM液，16-24h後換液一次，之後培養2-5d。(17)結果觀察將轉染5天後的細胞，棄掉上清，直接放在螢光顯微鏡下觀察，可見綠色螢光蛋白的表達，用TRizol法提取上清總RNA，經反轉錄後，用一對跨GFP和L基因的特異性引物進行擴增，PCR結果為陽性，證明重組病毒拯救成功。實施例2本發明所述狂犬病毒CTN株全基因組感染性cDNA克隆弱毒性動物實驗例選擇10隻3日齡的昆明鼠乳鼠，10隻10日齡的小鼠和10隻20日齡的成年鼠進行動物攻毒實驗。一、實驗方法1.用本發明拯救後的重組病毒通過腦內注射的途徑接種同時接種20日齡成年鼠和1日齡乳鼠，重組狂犬病滴度為8.9X104ffu/ml以20ul/只的劑量腦內注射l日齡昆明鼠乳鼠，以25ul/只的劑量腦內注射10日齡昆明鼠乳鼠並以30ul/只的劑量腦內注射20日齡成年昆明鼠。二、實驗結果接種5天後，3日齡組的乳鼠開始出現祌經症狀，對外界刺激反應敏感，並且後肢開始出現麻痺症狀，出現神經症狀3-4天後，乳鼠全部死亡。取死亡乳鼠腦組織，製作冷凍切片段，在共聚焦顯微鏡下發現腦組織海馬回處有大量螢光蛋白的表達，說明乳鼠是感染了重組的狂犬病病毒而致死。而10日齡組和20日齡組小鼠鼠注射此重組病毒後，15天內均沒有發病。並且取未發病的鼠腦組織同樣製作冰凍切點，在共聚焦顯微鏡下未觀察到有綠色螢光蛋白的表達。說明10日齡組和20日齡組小鼠沒有感染此重組的狂犬病病毒。通過以上動物實驗表明，本發明重組的狂犬病病毒只對3日齡的乳鼠才具有毒性，對10日齡以上的小鼠沒有致病性。本發明重組的狂犬病病毒保留了與原有CTN株原始病毒一樣的弱毒性，具有安全性。本發明應用本發明可以用於製備新型狂犬病疫苗，如G蛋白是狂犬病病毒的包膜蛋白，它是唯一一個能刺激機體產生中和抗體的蛋白。由此，可以在本發明獲得的狂犬病毒CTN株全基因組感染性cDNA克隆G，L蛋白之間再插入一個G蛋白，後插入的G蛋白可以是CTN株的G蛋白，也可以是其它疫苗株的G蛋白，這樣構成一個雙G蛋白表達體系，通過反向遺傳技術，將含有雙G蛋白的重組病毒拯救成功。糖蛋白表達量的增加必然會刺激機體產生更強的免疫保護作用從而製備成新的疫苗。也可在本發明綠色螢光蛋白處插入其他功能蛋白，將本發明作為病毒載體使用。序列表<110〉中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所24<170〉Patentlnversion3.51〈211〉12263DNA<213〉狂犬病毒CTN株全基因組感染性cDNA克隆〈400〉1acgcttaacaacc肌atc3ggacagtgtcatttgcaaaac3gagatgtaal60cacccctEicsatggatgccg3ca^g8ttgtattcagagtc犯t肌tC3ggtggtctcctt120gaagcccgagattattgtggatc肌tatgsatacaaatatccggccatca肌g3cttgei3180ga肌cccsgtatcaccctagggaaagctcccgacttaaacaaggcatacaagtcagtcct240gtcaggcatgaatgctgccaagctggatccggatgatgtatgttcttacttagcagctgc300aatgcaattctttgaggggacatgccctgaagactggaatagctacgggatcttgattgc360acgaeiaaggagacaaaatcacccctgattctcttgtagatataaagcgta420agggaactgggctctgacggg3ggt3tggagttgacgagggaccccactgtgtctgeigca480tgcgtctttagttggtcttctcttgagtctttataggttgagcaaaateitcgggaLcaaag540cacaggcaactacaagacaaacattgcggacagg由gagcagattttcgagactgcccc600tttcgtcaag3tcg"t3gaacaccatactctgatgacaactcacaagatgtgtgctaactg660gagtaccataccgaacttcaggttcttagccggaacctacgatatgtttttctcccggat720tgaacatctgtattcagctattagagtgggtacagtcgtcactgcttatgaagactgctc780agggctagtatcgtttacagggttcataaagcagatasai:ctcactgcaa3ggaggc組840actatatttct"tccataaaaactttgaggaagaatgtttga^cc3gggc3900agagactgctgttcctcactcttatttcatccacttccgttcattaggcctgagtgg3肌960formulaseeoriginaldocumentpage16tcaggatctttgattggattgcatgaactggtcccctcgaagtttgtcggggtgtatcaaaaaggtcgga3gacttatcag3gca^tagaattaM"taccaagacttaagttgtgtttcgatcgatatacaatctgtcagtatgtcaccagcatacaattcctgattatccc卿tgtggggaaaatgctatctggatgcggg卿卿g3a^tctcta^gacgg犯cctctcgtgaatcgttg卿,agtttcagacatattcaacagagatcatccacggcatatta.gtcaaggtaggtgt.acaaagggggsg眺attgcagatacatgaattctggaggac卿cttgtttaccacaaaaa"tattttacattttggaaattcccatcacctcaggattctcatacttgtacgggccacgtttaagga卿tggcattggctccgcagacttagacagga^taa^cctgaaaatcc^gg3gC3tggggtcgcgattacatgacttgg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