黃酮類化合物的持久吸收的製作方法

2023-09-16 10:23:15 2

專利名稱：黃酮類化合物的持久吸收的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於長久並持續釋放黃酮類化合物(特別是含鼠李糖的黃酮類化合物)及在胃腸道中延長所述黃酮類化合物吸收的方法。還涉及包含所述黃酮類化合物和 α -鼠李糖苷酶的組合物。本發明也包括包含橙皮苷和橙皮素-7-葡糖苷的組合物。
背景技術：
黃酮類化合物，或生物類黃酮是大多數植物中存在的普遍的一組多酚物質，其濃縮於種子、水果皮或果皮、樹皮及花中。許多植物藥品含有黃酮類化合物，許多作者已經報導其具有抗細菌、抗氧化、抗炎、抗變應性、抗誘變、抗病毒、抗腫瘤、抗血栓和血管舒張作用。WO 2005/058255 Al中描述的近期發展也顯示了含黃烷酮組合物用於改善人類或寵物皮膚、頭髮和皮毛健康的益處。自然界中，這些化合物主要作為糖苷存在。與糖的這種綴合顯著影響了它們的吸收動力學。例如，黃酮類化合物葡糖苷具有快且早的吸收，而黃酮類化合物芸香苷(鼠李糖-葡糖苷)具有慢且晚的吸收。對於黃酮類化合物芸香苷(如橙皮苷)，因小腸中缺少可以將所述黃酮類化合物芸香苷的鼠李糖部分去除的α-鼠李糖苷酶，其在哺乳動物中生物利用率低並且晚。這導致胃腸道中黃酮類化合物芸香苷穿過進入盲腸的過程費時。JP 2003-073279中描述了含長效黃酮類化合物糖苷的健康食品和飲料，因此食品中包括不同程度糖基化的黃酮類化合物的混合物，使得在整個胃腸道中發生吸收。JP 2000-078955也描述了通過提供生理學活性的黃酮類化合物及其衍生物的混合物來改善食品或藥品中黃酮類化合物的吸收的方法。此夕卜，Espin J. C.等在 Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52 00)，6136-6142頁中描述了在果汁和綠茶中製備生物可用的葡糖苷黃酮類化合物。這通過用來自棘孢麴黴(Aspergillus aculeatus)的鼠李糖苷酶處理果汁和綠茶來實現。發明目的因此仍然需要提供備選方法，通過所述方法黃酮類化合物組合物在哺乳動物中具有可控的效果。發明概述因此，通過獨立權利要求的特徵解決該需要。從屬權利要求進一步形成了本發明的中心思想。因此，在本發明的第一方面中，組合物包含至少一種含鼠李糖的黃酮類化合物和 α-鼠李糖苷酶。
製備本發明的組合物用於化妝品、營養及藥物用途。第二方面，本發明涉及具有α-鼠李糖苷酶活性的細菌，其選自捲曲乳桿菌 (Lactobacillus crispatus)、植物乳桿菌(Lactobacillus plan tarum)、力口氏乳桿菌 (Lactobacillus gasseri)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)或腸膜明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides)0在其它方面，本發明涉及α -鼠李糖苷酶在製備包含至少一種含鼠李糖黃酮類化合物的組合物中的用途，所述組合物用於改善所述黃酮類化合物的生物功效和/或生物利用率。在本發明另一方面，提供了 α -鼠李糖苷酶和至少一種含鼠李糖黃酮類化合物在製備用於改善皮膚健康的組合物中的用途。並且，本發明組合物的化妝品用途代表了本發明的另一方面。本發明還涉及的是用於維持和/或提高含鼠李糖黃酮類化合物的生物利用率的方法，所述方法包括步驟提供包含至少一種含鼠李糖黃酮類化合物和α -鼠李糖苷酶的組合物，所述α-鼠李糖苷酶處於基本不能剪切所述黃酮類化合物的鼠李糖部分的狀態。用於在攝入所述黃酮類化合物後延長含鼠李糖黃酮類化合物的代謝物的血漿水平的方法是本發明的另一方面，所述方法包括步驟經口提供包含至少一種含鼠李糖黃酮類化合物和α-鼠李糖苷酶的組合物，所述α-鼠李糖苷酶處於基本不能剪切所述黃酮類化合物的鼠李糖部分的狀態。用於改善皮膚健康的方法也屬於本發明的一個方面，所述方法包括步驟經口施用包含至少一種含鼠李糖黃酮類化合物和α -鼠李糖苷酶的組合物，或經口分別和同時施用包含至少一種含鼠李糖黃酮類化合物和α-鼠李糖苷酶的組合物，所述α-鼠李糖苷酶處於基本不能剪切所述黃酮類化合物的鼠李糖部分的狀態。最後，本發明包含組合物，所述組合物包含橙皮苷和橙皮素-7-葡糖苷(優選比例為70/30至50/50)的混合物。附圖
參考附圖中顯示的一些實施方案，於下文進一步描述了本發明，其中圖Ia描述了橙皮苷的分子結構，圖Ib描述了橙皮素-7-葡糖苷的分子結構，圖Ic描述了橙皮素的分子結構，並且圖2是根據單獨攝取橙皮素-7-葡糖苷，還是單獨攝取橙皮苷或消費本發明組合物來比較血漿橙皮素水平的曲線圖。圖3顯示在接近於存在純的α -鼠李糖苷酶(CTRL+)、加氏乳桿菌CNCM 1-3795 (907EC)的完整細胞、加氏乳桿菌CNCM 1-3795 (907CE)的破碎細胞，或不存在任何細菌/酶(CTRL-)的小腸(pH 6)環境中，橙皮苷在體外的消失。圖4顯示橙皮素-7-葡糖苷在pH 6處的形成(從橙皮苷的起始量(100% )開始計算)，其中CTRL+、CTRL-、907CE和907EC具有與圖3中相同的含義。圖5顯示當用加氏乳桿菌(CNCM 1_37%)的完整細胞或破碎細胞處理橙皮苷時， 橙皮素在PH 6處形成。圖6顯示存在純的α -鼠李糖苷酶(CTRL+)、加氏乳桿菌CNCM 1-3795 (907EC)的
4完整細胞、加氏乳桿菌CNCM 1-3795 (907CE)的破碎細胞，或不存在任何細菌/酶(CTRL-) 時，在接近於膳食消化後的胃環境(PH 4)中，橙皮苷在體外的消失。圖7顯示橙皮素-7-葡糖苷在pH 4處的形成(從橙皮苷的起始量(100% )開始計算)，其中CTRL+、CTRL-、907CE和907EC具有與圖6中相同的含義。圖8圖解TIMl實驗的結果。當使用加氏乳桿菌(CNCM 1-3795)的菌株時，監測胃及小腸中橙皮苷水解成橙皮素-7-葡糖苷高達3小時。該圖顯示細菌酶在胃中活性低，僅在小腸中水解的橙皮苷的量隨化合物移向胃腸道而減少。圖9圖解當使用純的α -鼠李糖苷酶時，橙皮苷水解成橙皮素-7-葡糖苷的程度。 該圖顯示純酶在胃中具有活性，但在胃腸道中活性較低。發明詳述本發明涉及控制哺乳動物中含鼠李糖黃酮類化合物吸收的方法，使得攝取所述黃酮類化合物後，在上胃腸道和下胃腸道中或在整個胃腸道中發生等量吸收。因此，為了實現持久和可調節的效果，本發明的基本原則是以可調方式提供黃酮類化合物的方法，所述黃酮類化合物在哺乳動物胃腸道的整個通道中是至少部分可吸收的形式。通常，黃酮類化合物在上胃腸道及結腸中是至少部分水解的。根據本發明，在消化早期(胃、小腸)，α-鼠李糖苷酶的存在一定程度上允許部分剪切含鼠李糖的黃酮類化合物(參考圖3-9)。這導致黃酮類化合物更易吸收並處於消化過程的更早期。此外，結腸中天然存在的酶促進了剪切過程，使得隨後發生黃酮類化合物在胃腸道中通過時發生持續吸收。因此，本發明提出包含至少一種含鼠李糖黃酮類化合物和α -鼠李糖苷酶的組合物，其中所述α -鼠李糖苷酶處於基本不能剪切含鼠李糖黃酮類化合物的狀態。假如滿足了合適條件(環境、pH、溫度等)，α -鼠李糖苷酶通常具有剪切包含鼠李糖部分的底物的能力。然而在本發明的組合物中，該酶處於基本阻止執行其正常功能的狀態。僅在攝入組合物後，酶的環境改變，才使得新環境(ΡΗ、溫度等)允許所述酶變成有活性的，因而剪切所述黃酮類化合物的鼠李糖部分。因此，在本發明的組合物、用途或方法中，α -鼠李糖苷酶處於基本不能剪切含鼠李糖黃酮類化合物的狀態。僅在攝入組合物後，α-鼠李糖苷酶才能夠剪切含鼠李糖的黃酮類化合物。該「延遲的」 α -鼠李糖苷酶活性保證僅在攝入之後才發生α _鼠李糖苷酶剪切黃酮類化合物。因此，僅在胃腸道環境中才發生α-鼠李糖苷酶活性。這可根據本發明的不同實施方案，通過若干方法來實現。例如，這可通過使組合物中的α -鼠李糖苷酶處於「失活」的條件下來實現，即它不能剪切黃酮類化合物的鼠李糖部分。失活的α-鼠李糖苷酶例如是已經用抑制劑處理過的α-鼠李糖苷酶，這樣僅當遇到胃腸道環境時，所述α-鼠李糖苷酶才能夠成為有活性的。或者，組合物中的環境例如可以通過具有高pH值使得酶「失活」。攝入之後，胃腸道的低PH將為α -鼠李糖苷酶變得有活性提供有利環境。根據另一實施方案，這可通過將組合物中的α -鼠李糖苷酶與黃酮類化合物分離來實現。分離是使得所述α-鼠李糖苷酶不直接接觸所述黃酮類化合物。例如可通過本領域已知的方法將α-鼠李糖苷酶封裝來進行分離。因此，可將酶封裝，使得其僅在胃腸道環境下才釋放。或者，通過將α -鼠李糖苷酶封裝在能夠釋放α -鼠李糖苷酶的微生物中，所述 α_鼠李糖苷酶不直接接觸組合物中的黃酮類化合物。該「生物封裝」可通過微生物的產 α -鼠李糖苷酶菌株實現，所述微生物保存在使其呈現低或零代謝速率的環境(水活度等) 下。組合物中的環境(水活度等)因而使得微生物在這些環境下不釋放酶。α-鼠李糖苷酶在微生物的細胞壁內或細胞壁上被「生物封裝」。因此，在本發明中，「處於基本不能剪切含鼠李糖黃酮類化合物的鼠李糖部分的狀態中的α-鼠李糖苷酶」是指上文描述的任何形式的酶。當產生α -鼠李糖苷酶的微生物用於本發明的組合物或方法時，其優選為細菌。 更優選地，所述微生物選自乳桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、 鏈球菌屬(Streptococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬 (Pediococcus)、酒球菌屬(Oenococcus)等。最優選地，所述微生物選自捲曲乳桿菌(ATCC 33820)、捲曲乳桿菌(CNCM 1-3654)、植物乳桿菌(ATCC 8014)、植物乳桿菌(CNCM 1-3653)、加氏乳桿菌(CNCM 1-3795) 或其混合物。因此，選自捲曲乳桿菌(ATCC 33820)、捲曲乳桿菌(CNCM I-36M)、植物乳桿菌 (ATCC 8014)、植物乳桿菌(CNCM 1-3653)、加氏乳桿菌(CNCMI-3795)的具有α -鼠李糖苷酶活性的微生物是本發明的一部分。所述微生物優選以106-101(lCfU/g的量存在於本發明的組合物中。更優選以 109cfu/g的量存在。可進一步將能夠產生α -鼠李糖苷酶的微生物封裝。微生物的封裝是本領域技術人員熟知的方法。本發明中所用的黃酮類化合物可選自包含鼠李糖部分的任何黃酮類化合物。任何這種含鼠李糖黃酮類化合物可選自橙皮苷、芸香苷、eriotricin、柚皮苷、新橙皮苷、洋芫荽苷、蒙花苷、枸桔苷、櫻桃苷等和來自該列表的任何可能組合，所述組合包含來自該列表的兩種或更多種組分。優選地，所述黃酮類化合物是橙皮苷(圖la)。橙皮苷(圖la)包含芸香糖(鼠李糖-葡萄糖)部分。在活性α -鼠李糖苷酶的存在下，可在一定程度上將橙皮苷的鼠李糖部分切除以產生橙皮素-7-葡糖苷(圖lb)。同樣，可通過其它酶(例如存在於胃腸道中的葡糖苷酶)進一步剪切橙皮素-7-葡糖苷以產生橙皮素(圖Ic)。參照圖2，可以看出一方面，攝取橙皮素-7-葡萄糖(圖lb)後，橙皮素(圖lc)的血漿水平在攝取後很快顯示尖峰。不希望受理論的束縛，認為這是由於存在能夠將葡萄糖部分切除的酶，使得橙皮素容易吸收。另一方面，因攝取橙皮苷(圖la)引起的橙皮素血漿水平僅在稍後並以更小程度出現。不希望受理論的束縛，認為這是由於僅在穿過胃腸道的較後階段存在能夠剪切橙皮苷的芸香糖部分的酶。
因此，本發明的組合物有利地提供維持更長時間的橙皮素血漿水平(參考圖2)。此外，根據本發明的另一實施方案，通過包含橙皮苷(圖la)和橙皮素-7-葡糖苷 (圖lb)的混合物的組合物也提供了橙皮素的這種持久血漿水平。優選地，這些以橙皮苷比橙皮素-7-葡糖苷為70/30至50/50的比例存在於所述組合物中。本發明組合物中黃酮類化合物的量對應於範圍為0. Olmg至Ig黃酮類化合物的糖苷配基當量的量。優選地，所述黃酮類化合物以範圍為IOmg至SOOmg黃酮類化合物的糖苷配基當量的量存在。例如，當橙皮苷(圖la)用於本發明的組合物中時，其以將提供0. Olmg至lg，優選 IOmg至SOOmg相應橙皮素(圖Ic)的量存在。這通過本領域技術人員容易地計算得到。在本發明組合物中，α -鼠李糖苷酶以足以提供10-50%的黃酮類化合物糖苷配基或10-50%的糖基化黃酮類化合物形式(其在消化的早期是可吸收的)的量存在。例如，在黃酮類化合物是橙皮苷的情況下，所用α -鼠李糖苷酶的量是足以在上胃腸道(小腸)中提供10-50%的橙皮素-7-葡糖苷(圖lb)或橙皮素(圖Ic)的量。這可通過本領域已知的方法(如TNO的TIM-I進行的實驗和體內驗證)容易地評估(參考圖 8 禾口 9) ο優選配製本發明組合物用作營養、藥物或化妝品組合物。因此，本發明組合物可以是乾燥組合物、溼組合物或半溼組合物。「幹的」指組合物的水活度低於0. 6。「半溼的」指組合物的水活度在0. 6至0. 9之間，「溼的」指組合物的水活度高於0.9。它們可選自液體組合物、乾燥組合物或半乾燥組合物，如溶液劑、噴霧劑、粉劑、片劑、膠囊劑、酸乳酪、餅乾、奶、飲料、巧克力、冰淇淋、早餐穀類薄片或早餐穀類條、奶粉、豆製品、非乳發酵產品、營養補充劑、食品補充劑、寵物食品、嬰兒配方等。對於攝食，口服組合物，並且特別是食品補充劑的許多實施方案是可能的。通過製備糖包衣片劑、明膠膠囊劑、凝膠劑、乳劑、片劑、膠囊劑或溶液劑的常用方法製備它們。 具體而言，含鼠李糖黃酮類化合物和α -鼠李糖苷酶，或在不同實施方案中，橙皮苷和橙皮素-7-葡糖苷可摻合到任何其它形式的食品補充劑或濃縮食品中，例如食物條，或壓縮或非壓縮的粉劑中。粉劑可用水、汽水、乳製品或豆製品稀釋，或可摻合到食物條中。組合物可包含常用的賦形劑和成分，例如食品領域中常用的脂肪和/或水性成分、溼潤劑、增稠劑、防腐劑、質地劑(texturing agent)、調味劑和/或塗層劑、抗氧化劑、 染料。根據本發明的其它方面，α -鼠李糖苷酶可用於製備包含至少一種含鼠李糖黃酮類化合物的組合物，其中所述α -鼠李糖苷酶處於基本不能剪切所述黃酮類化合物的鼠李糖部分的狀態，用於改善所述黃酮類化合物的生物功效和/或生物利用率。「組合物」涵蓋如上描述的本發明的任何組合物。將生物功效定義為攝取的營養物轉化成具有顯著生物效應的營養物活性形式的比例。它與生物利用率緊密聯繫，將生物利用率定義為物質被吸收進系統循環中的程度。通過提高黃酮類化合物的生物功效和/或生物利用率，本發明提供具有更持久和持續效應的更有效組合物的益處。因此，本發明也提供用於維持和/或提高含鼠李糖黃酮類化合物的生物利用率的方法，所述方法包括步驟提供包含至少一種含鼠李糖黃酮類化合物和α -鼠李糖苷酶的組合物，所述α -鼠李糖苷酶處於基本不能剪切所述黃酮類化合物的鼠李糖部分的狀態。攝取橙皮苷(圖la)或攝取橙皮素-7-葡糖苷(圖Ic)後與攝取本發明的組合物後血漿水平的比較顯示出顯著差異。實際上，攝取本發明組合物後，橙皮素血漿水平維持了更長時間(圖2)。因此，本發明還包括用於在攝取所述黃酮類化合物後提高含鼠李糖黃酮類化合物的代謝物的血漿水平的方法，所述方法包括步驟經口提供包含至少一種含鼠李糖黃酮類化合物和α -鼠李糖苷酶的組合物，所述α -鼠李糖苷酶處於基本不能剪切所述黃酮類化合物的鼠李糖部分的狀態。在本發明方法中，α -鼠李糖苷酶可與包含含鼠李糖黃酮類化合物的組合物分開提供。例如，所述α-鼠李糖苷酶可提供為片劑、膠囊等以與包含所述黃酮類化合物的組合物被同時攝取。或者，它可提供為例如粉劑以噴灑在含黃酮類化合物的組合物上。技術人員可容易地設想此處提及的特定實施方案的多種不同備選方案。另一方面，本發明組合物可用於化妝品。「化妝品用途」指非治療用途，其可改善人類或寵物皮膚、皮毛和/或頭髮的美觀方面或舒適度。在該上下文中，化妝品用途可包括防止對人類或寵物的皮膚、皮毛和/或毛髮的損傷和/或改善人類或寵物的皮膚、皮毛和/或毛髮。這種損傷特別包括皮膚的光化損傷和老化損傷，如乾燥、無規則色素沉著(特別是雀斑、痣、滴狀色素減少症和持久的色素沉著過度)、皺紋(顯著的是細微的表面紋和深皺紋)、星狀假瘢痕、彈性組織變性、無彈性、毛細血管擴張、靜脈湖、粉刺、皮脂腺增生、軟垂疣和脂溢性角化病。化妝品用途還對頭髮和皮毛具有特殊益處，如改善的頭髮或皮毛密度、纖維直徑、 色澤、油性、光澤度、皮脂產生，並且可幫助預防頭髮或皮毛脫落。本發明還包括治療用途，如皮膚病學用途。實際上，α -鼠李糖苷酶和至少一種含鼠李糖黃酮類化合物(其中所述α-鼠李糖苷酶處於基本不能剪切所述黃酮類化合物的狀態)在製備用於改善皮膚健康的組合物中的用途屬於本發明的另一方面。所述組合物也可用於預防炎症或用於改善骨和/或心血管健康。「組合物」涵蓋如上描述的本發明的任何組合物。在該實施方案中，本發明組合物可用於治療和/或預防皮膚損傷，所述損傷例如由壓力環境產生，例如通過化學、生物或物理壓力，例如通過暴露於氧化劑或致癌物，暴露於細菌、病毒、真菌、來自周圍細胞和/或微生物的脂類，或暴露於紫外線照射產生。這些損傷還包含光化性角化病、紫癜、櫻桃樣血管性水腫(cherry angiodema)、基底細胞癌和鱗狀上皮細胞癌、皮膚燒傷和/或起泡、表皮增生、炎症、免疫抑制和癌症，例如非黑素瘤和黑素瘤皮膚癌。本發明組合物對人類或寵物的皮膚的效果可通過使用常規方法來測量，所述方法包括最小紅斑量(MED)、比色法、經皮失水、DNA修復、測定白細胞介素和蛋白聚糖的產生、 或膠原酶活性、屏障功能或細胞更新。因此，用於改善皮膚健康的方法也屬於本發明的一個方面，所述方法包括步驟經口施用包含至少一種含鼠李糖黃酮類化合物和α -鼠李糖苷酶的組合物，或經口分別和同時施用包含至少一種含鼠李糖黃酮類化合物和α-鼠李糖苷酶的組合物，所述α -鼠李糖
8苷酶處於基本不能剪切所述黃酮類化合物的鼠李糖部分的狀態。該方法也用於改善心血管和骨健康。將理解本發明的概念同樣可用作輔助目前所用的藥療法的輔助療法。因為本發明組合物可容易地與食物材料一起經口施用，所以可施用含高含量目的物質的特殊臨床食物。此外，本發明的概念同樣可擴展到包含含鼠李糖黃酮類化合物和α -鼠李糖苷酶的組合物的局部應用。通過下文描述的非限制性實施例進一步闡明本發明。 實施例實施例1材料橙皮苷酶「Amano 」 Cone. (A. MANO PHARMACEUTICAL CO.，LTD.)。在體外通過細菌粗提物剪切橙皮苷為了測試細菌α -鼠李糖苷酶是否能識別並剪切作為底物的橙皮苷，在鼠李糖存在下生長的細胞的粗提物與橙皮苷在PH 4和ρΗ 6溫育4小時和8小時，並通過HPLC完成分析。在下表中將結果表示為橙皮苷或其衍生物基於反應起始時總的橙皮苷量(0.08mg/ mL)的百分比。用0.08mg橙皮苷/mL(其為旨在獲得終產物的橙皮苷的近似濃度)和3xl09 細菌/mL的粗提物進行測試。結果顯示兩種菌株均具有α -鼠李糖苷酶和β -葡糖苷酶活性，並因此根據反應條件，將橙皮苷剪切成為不同程度的橙皮素-7-葡糖苷和糖苷配基。該結果提示細菌可用於在原位將橙皮苷部分轉化成為橙皮素-7-葡糖苷和糖苷配基。
權利要求
1.具有α-鼠李糖苷酶活性的細菌，其是加氏乳桿菌。
2.根據權利要求1的細菌，其是加氏乳桿菌CNCM1-3795。
3.細菌用於產生α-鼠李糖苷酶的用途，其中所述細菌是加氏乳桿菌。
4.根據權利要求3的用途，其中所述細菌是加氏乳桿菌CNCMI-3795。
全文摘要
本發明涉及用於長期並持續釋放黃酮類化合物，特別是含鼠李糖黃酮類化合物，和延長所述黃酮類化合物在胃腸道中的吸收的方法。還涉及包含所述黃酮類化合物和α-鼠李糖苷酶的組合物。也包括包含橙皮苷和橙皮素-7-葡糖苷的組合物。
文檔編號C12N9/24GK102433286SQ20111044042
公開日2012年5月2日 申請日期2007年8月22日 優先權日2006年8月24日
發明者G·威廉森, I·揚科維奇, M·裡查爾, M·雷恩 申請人:雀巢產品技術援助有限公司